PENENTUAN KADAR ENZIM TRIPSIN BERDASARKAN KECEPATAN REAKSINYA MENGKATALIS KASEIN Novi Puspa Ningrom Plaikoil Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Pendidikan Ganesha e-mail:
[email protected]
Abstract As catalysts, enzymes affect the rate at equilibrium is achieved, but it does not affect the total equilibrium reaction. Enzymes assist the reaction by lowering the activation energy of formation of the transition state of a substrate into a product than non-catalyzed process. Quantitative analysis of the kinetics of enzyme reactions can be carried out by two principles, namely the principle of the approach according to Michaelis-Menten equilibrium and steady-state theory principles (Steady-state theory) by Briggs-Haldone. Michaelis and Menten stated that the enzymatic reaction at various concentrations of the substrate through two phases: 1) when [S] is low, the enzyme active regions are not all bound with the enzyme, 2) on [S] is high, the active side was bound entirely by substrat.Pengukuran absorbance done using UV-Vis spectrophotometer. The results of the discussion and calculations show that the price of Vmax and KM respectively amounted to 0.0268 μmol / min and 0.120 mg/mL. Keywords: tripsin, enzim, catalys, Lineweaver-Burk jumlah besar. Jumlah atau kadar enzim yang kecil tersebut menimbulkan kesulitan tersendiri bagi kita untuk mengukur kadar enzim, sehingga memerlukan teknik yang rumit. Secara klinis, pengukuran kadar enzim sangat penting untuk dilakukan (Tika, 2010). Analisis kuantitatif kinetika reaksi enzim dapat dilakukan dengan dua asas pendekatan yaitu asas keseimbangan menurut Michaelis-Menten dan asas teori keadaan tunak (Steady state theory) menurut Briggs-Haldone. Laju reaksi awal (Vo) dari reaksi yang dikatalisis oleh enzim meningkat dengan bertambahnya konsentrasi substrat hingga tercapai keadaan dimana penambahan substrat tidak lagi meningkatkan laju reaksi awal. Keadaan dimana laju reaksi awal maksimum (Vmaks) dicapai pada kondisi substrat jenuh. Hal ini dapat dijelaskan dengan postulat reaksi dari persamaan Michaelis-Menten sebagai berikut, dimana E, S, dan P masing-masing adalah enzim, substrat, dan produk reaksi.
1. PENDAHULUAN Enzim adalah protein yang mengkatalisis reaksi-reaksi biologi. Sebagai katalis, enzim mempengaruhi laju pada saat kesetimbangan dicapai, tetapi tidak mempengaruhi kesetimbangan total reaksi. Enzim membantu terjadinya reaksi dengan menurunkan energi aktivasi pembentukan keadaan transisi substrat menjadi produk dibandingkan proses yang tidak dikatalisis. Laju awal (Vo) dari reaksi yang dikatalisis enzim meningkat dengan bertambahnya konsentrasi substrat hingga dicapai keadaan di mana laju awal maksimum (Vmaks) dicapai pada kondisi substrat jenuh. Enzim sebagai katalisator mempunyai sifat-sifat seperti katalis pada umumnya. Enzim ikut bereaksi namun pada akhir reaksi enzim kembali dalam bentuk semula. Hal tersebut mengakibatkan enzim dapat dipakai kembali setelah melaksanakan aktivitasnya, sehingga tubuh tidak memerlukan enzim dalam
E+S
k1
ES
k2
k3
E+P
k4
Gambar 1. Persamaan reaksi kesetimbangan enzim-substrat Michaelis dan Menten menyatakan bahwa reaksi enzimatis pada berbagai konsentrasi substrat mengalami dua fase: 1) ketika [S] rendah, daerah aktif enzim tidak semuanya terikat dengan enzim, 2) pada [S] tinggi, sisi aktif yang telah terikat seluruhnya
dengan substrat. Pada saat ini enzim telah bekerja dengan kapasitas penuh. Adapun persamaan Michaelis-Menten secara matematis dapat dituliskan
1
: Vo =
Kecepatan maksimum enzim untuk berikatan dengan substrat membentuk kompleks ES. Berikut adalah plot V0 terhadap [S] yang berbentuk hiperbolik
Vmaks [S] . Dimana Vo = kecepatan reaksi K M + [S]
enzim dengan kadar substrat [S], KM = tetapan Michaelis –Menten (mol per liter) dan Vmaks =
Vmaks
Laju Reaksi (V)
Vmaks
KM
Konsentrasi Substrat [S] Gambar 2. Plot hubungan [S] dan Vo Sering KM didefinisikan sebagai tetapan disosiasi reaksi yang dikatalisis oleh enzim. Pada reaksi sederhana dapat dilihat. k2 [E][S] k2 ES E + S maka Ks= = k k1 [ES] 1
Persamaan diatas identik dengan persamaan garis lurus, y = ax + b
Karena KM adalah
Persamaan Michelis-Menten dapat di transformasikan atau di turunkan secara aljabar menjadi bentuk lain yang lebih bermanfaat didalam pemetaan data percobaan menjadi persamaan Lineweaver-burk, persamaan ini memiliki banyak manfaat karena menghasilkan penentuan V maks secara lebih tepat yang hanya dapat di duga pada pemetaan Vo terhadap (S).Persamaan ini dinyatakan oleh Lineweaver – Burk dan dialurkan seperti gambar berikut.
dengan, y =
k2 + k3 k1
maka, Ks =
k2 + k3 k1
Jadi KM akan selalu sama atau lebih besar daripada Ks. Dilihat dari persamaan:
V=
Vmaks [S] 1 K maka = M V Vmaks K M + [S]
1 1 + [S] Vmaks
2
K 1 1 1 ; x = ; a = M dan b = V [S] Vmaks Vmaks
•
•
•
• • •
•
•
0
Gambar 3. Plot hubungan 1/Vo dan 1/[S] (Plot Lineweaver-Burk) dengan pengadukan yang kuat kemudian didiamkan dalam air es agar pengendapan berlangsung maksimal. Sentrifugasi dilakukan selama 10 menit, lalu dilakukan penyaringan. Filtrat yang diperoleh dikerjakan dengan metode Anson, dan diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer UVVis.
Percobaan kinetika reaksi enzim ini memiliki prinsip bahwa laju awal (Vo) dari reaksi yang dikatalisis enzim akan meningkat dengan bertambahnya konsentrasi substrat hingga dicapai suatu keadaan saat penambahan substrat tidak lagi meningkatkan laju reaksi dan apabila semua enzim dalam keadaan ES (jenuh oleh substrat) maka laju reaksi akan mencapai nilai maksimum (Vmaks).
Prosedur Kerja t=0 menit Larutan buffer dan enzim dicampur dalam wadah dan ditambahkan larutan TCA, kemudian diaduk kuat-kuat dan terakhir ditambahkan larutan kasein, lalu dilakukan inkubasi selama 20 menit pada suhu 35oC. Sentrifugasi dilakukan selama 10 menit, lalu dilakukan penyaringan. Filtrat yang diperoleh dikerjakan dengan metode Anson, dan diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer UVVis.
2. METODE Praktikum kinetika reaksi enzim ini dilakukan pada hari Jumat tanggal 4 April 2014 di Laboratorium Kimia Organik Jurusan Pendidikan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Pendidikan Ganesha Singaraja. Alat dan bahan Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah pipet tetes, gelas kimia, batang pengaduk, gelas ukur, pipet volumetri, corong, Erlenmeyer, termometer, spatula, kaca arloji, sentrifugal, tabung reaksi, dan spektronik UV-Vis. Bahan yang digunakan adalah larutan TCA, larutan kasein, buffer posfat, larutan tripsin, larutan NaOH, reagen Folin-Ciocalteu, kertas saring, indikator universal, dan akuades.
3. PEMBAHASAN Tujuan dari penambahan volume yang beragam adalah untuk membuat konsentrasi pada masingmasing substrat menjadi berbeda-beda, sehingga dapat dibuat plot laju reaksi terhadap konsentrasi substrat. Selain itu, untuk membuat pH dari larutan kasein menjadi pH optimum dari enzim trinpsin sehingga kerja dari enzim menjadi maksimal. Penambahan larutan tripsin bertujuan untuk mengkatalisis reaksi hidrolisis ikatan peptida yang ada pada protein dalam kasein. Ikatan peptida yang dipecah oleh enzim tripsin terletak pada sisi karboksil residu lisin dan arginin. Selama proses inkubasi iakan
Prosedur Kerja t=20 menit Larutan kasein diinkubasi terlebih dahulu sebelum ditambahakan larutan buffer posfat dan larutan tripsin selama 5 menit pada suhu 35oC. Reaksi dihentikan dengan penambahan TCA dan disertai 3
memungkinkan terikatnya enzim tripsin dengan substrat. Penambahan larutan TCA berfungsi untuk menghentikan aktivitas enzim mengingat larutan TCA yang bersifat asam, sehingga pada penambahan TCA mampu menyebabkan denaturasi protein baik pada tripsin maupun denaturasi protein dalam kasein. Terjadinya denaturasi inilah yang menyebabkan terbentuknya endapan, sehingga dapat dianalisis pengaruh konsentrasi substrat terhadap laju reaksi enzimatis. Selain menyebabkan terjadinya denaturasi protein, penambahan TCA juga menyebabkan pH larutan menjadi menurun (asam), sehingga kompleks enzim substrat yang terbentuk menjadi tidak stabil dan aktivitas enzim dalam mengkatalisis reaksi hidrolisis protein dalam kasein menjadi terhenti akibat terjadinya penurunan pH, hal ini mengingat enzim tripsin bekerja secara optimal pada pH 8,0.
Reagen Folin-Ciocalteu (bening dan berwarna kuning) merupakan campuran fosfotungstat dan fosfomolibdenum. Reagen ini dapat direduksi oleh gugus fenolik pada asam amino tirosin yang ada pada filtrat menghasilan tungstat dan molibdat yang berwarna biru. Berdasarkan hasil percobaan, ketika filtrat ditambahkan dengan reagen Folin-Ciocalteu dihasilkan larutan bening kebiruan yang kepekatannya meningkat dari tabung I sampai tabung V. Berdasarkan hasil yang diperoleh dapat diketahui bahwa produk yang dihasilkan dari tabung I sampai tabung V meningkat seiring dengan menigkatnya kepekatan warna larutan. Pengukuran absorbansi larutan diukur pada 650 nm dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis dengan hasil sebagai berikut.
Tabel 1. Hasil Pengukuran Absorbansi Filtrat untuk Waktu 20 Menit dan waktu 0 Menit dengan Menggunakan Spektrofotometer UV-Vis No Tabung A ∆A t = 0 menit 0,098 I 0,027 t = 20 menit 0,125 II III IV V
t = 0 menit t = 20 menit
0,085
t = 0 menit
0,094
t = 20 menit
0,113
t = 0 menit t = 20 menit t = 0 menit t = 20 menit
0,116 0,131 0,148
0,106
0,168
Perhitungan konsentrasi substrat untuk setiap tabung reaksi adalah sebagai berikut. Massa susu
[kasein] =
0,021 0,019 0,015 0,02
yang ditimbang = 2,00 gram dalam 100 mL aquades dengan perhitungan sebagai berikut.
2,00 gram = 0,02 gram / mL = 20,0 mg / mL 100 mL
4
Tabung I
Tabung IV
V1 = 0,1 mL; V2 = 7 mL; M1= 20,0 mg/mL V1 × M1 = M2 × V2 0,1 mL × 20,0 mg/mL = M2 × 7 mL
V1 = 3,0 mL; V2 = 7 mL; M1= 20,0 mg/mL V1 × M1 = M2 × V2 1,0 mL × 20,0 mg/mL = M2 × 7 mL 3,0mL × 20,0 mg / mL M2 = 7 mL
0,1 mL × 20,0 mg / mL 7 mL = 0,285 mg / mL [ S ] = 0,285 mg / mL 1 = 3,50 mL / mg [S ] M2 =
= 8,57 mg / mL
[ S ] = 8,57 mg / mL 1 = 0,116 mL / mg [S ]
Tabung II
Tabung V
V1 = 0,5 mL; V2 = 7 mL; M1= 20,0 mg/mL V1 × M1 = M2 × V2 0,5 mL × 20,0 mg/mL = M2 × 7 mL 0,5 mL × 20,0 mg / mL M2 = 7 mL
V1 = 5,0 mL; V2 = 7 mL; M1= 20,0 mg/Ml V1 × M1 = M2 × V2 5,0 mL × 20,0 mg/mL = M2 × 7 mL 5,0 mL × 20,0 mg / mL M2 = 7 mL
= 1,42 mg / mL [ S ] = 1,42 mg / mL 1 = 0,70 mL / mg [S ]
= 14,29 mg / mL [ S ] = 14,29 mg / mL 1 = 0,069 mL / mg [S ]
Tabung III V1 = 1,0 mL; V2 = 7 mL; M1= 20,0 mg/mL V1 × M1 = M2 × V2 1,0 mL × 20,0 mg/mL = M2 × 7 mL 1,0 mL × 20,0 mg / mL M2 = 7 mL
= 2,85 mg / mL [ S ] = 2,85mg / mL 1 = 0,35 mL / mg [S ] Harga Vo pada masing-masing tabung dapat diturunkan dari persamaan A = ε b C, dengan ε.b merupakan harga tetapan, sehingga dapat diasumsikan ε.b adalah konstanta, sehingga A = k . C, dimana A adalah absorbansi, C adalah konsentrasi,
dan k adalah konstanta. Berdasarkan hal tersebut, maka A∼C. Rumusan kecepatan adalah Vo =
5
[C] to
Karena A∼C, maka V =
A to
Untuk mengetahui harga
Karena to tetap yaitu t = 0 menit dan 20 menit, maka
dari
1 1 Vo = A, sehingga = A Vo
harga
1 untuk A
1 dapat diapresiasikan Vo masing-masing
tabung.
Perhitungan serapan masing-masing tabung adalah sebagai berikut.
Tabung I
Tabung IV
ΔA = 0,027 1 1 = = 37,037 A 0,027 1 = 37,037 mol/menit Vo
ΔA = 0,015 1 1 = = 66,667 A 0,015 1 = 66,667 mol/menit Vo
Tabung II
Tabung V
ΔA = 0,021 1 1 = = 47,619 A 0,021 1 = 47,619 mol/menit Vo
ΔA = 0,02 1 1 = = 50 A 0,02 1 = 0,50 mol/menit Vo
Tabung III ΔA = 0,019 1 1 = = 52,631 A 0,019 1 = 52,631 mol/menit Vo Tabel 2. Nilai Laju Reaksi Enzimatis (1/V0) dan Konsentrasi Substrat (1/[S]) Tabung Absorbansi 1/A = 1/V0 1/[S] ke(A) 1 0,027 37,037 3,50 2 0,021 47,619 0,70 3 0,019 52,631 0,35 4 0,015 66,667 0,116 5 0,02 0,50 0,069
6
80.00 y = 4.4974x + 37.299 R² = 0.4443
70.00 60.00
1/Vo
50.00 Hubungan antara 1/[S] dan 1/Vo Linear (Hubungan antara 1/[S] dan 1/Vo)
40.00 30.00 20.00 10.00 0.00 3.50
0.70
0.35
0.12
0.07
1/[S] Gambar 4. Kurva Hubungan laju reaksi enzimatis (1/V0) terhadap konsentrasi substrat (1/[S]) Kurva yang dihasilkan antara
4,4974x + 37,299. Persamaan ini dikaitkan dengan persamaan yang dinyatakan oleh Lineweaver-Burk, yaitu:
1 1 dengan [S ] Vo
menghasilkan persamaan regresi linear, yaitu: y =
1 KM = Vo Vmaks
1 1 [S] + V maks y 0 4,4974x x
Berdasarkan persamaan tersebut, maka dapat ditentukan bahwa y adalah menyatakan 1/V0, gradient (m) menyatakan Km/Vmaks, serta intersep (b) menyatakan 1/Vmaks. Diketahui bahwa harga Vmaks merupakan harga saat x = 0, sehingga
= 4,4974x + 37,299 = 4,4974x + 37,299 = - 37,299 = -8,293
1 1 + [S] Vmaks
Dengan demikian, -1/KM niainya adalah -8,293. Maka harga Km adalah 1 KM = = 0,120 mg/mL 8,293
y = 4,4974x + 37,299 1 = 4,4974 . 0 + 37,299 Vo
4. KESIMPULAN Hasil pembahasan dan perhitungan menunjukkan bahwa harga Vmaks dan KM masingmasing adalah sebesar 0,0268 μmol/menit dan 0,120 mg/mL.
K 1 = M Vo Vmaks 1 1 = Vo Vmaks
1 Vo
=
1 Vmaks
= 37,299
5. UCAPAN TERIMAKASIH Terimakasih penulis ucapkan kepada Bapak Dewa Subamia sebagai laboran Lab Kimia Organik Jurdik Kimia UNDIKSHA atas bantuannya untuk menyiapkan alat dan bahan selama penulis melaksanakan praktikum. Terimakasih juga penulis ucapkan kepada Bapak Nyoman Tika sebagai dosen
Vmaks = 0,0268 μmol/menit Sedangkan titik potong pada sumbu 1/[S] adalah 1/KM, yaitu harga saat y=0, sehingga: 7
pengampu mata kuliah praktikum biokimia, serta kepada Ibu Dewi Wirmandiyanthi selaku asisten yang senantiasa menemani praktikan melangsungkan praktikum.
6. DAFTAR PUSTAKA Poedjaji, Anna. 2005. Dasar-Dasar Biokimia. Bandung: UI Press Thenawijaya, Maggy. 1982. Lehninger. Dasar-Dasar Biokimia Jilid 1. Jakarta: Erlangga
8
