Informe de Pcr

PRACTICA DE BIOLOGIA MOLECULAR

INTRODUCCIÓN Introducción La invención de la reacción en cadena de la polimerasa PCR! por "# Mullis $ sus cola%oradores en &'() *a revolucionado la %iol %iolo+ o+,a ,a mole molecu cula larr $ la me medi dici cina na mole molecu cula larr -ai -ai.i .i et al#/ al#/ &'() &'()!# !# La reacción en cadena de la polimerasa es una t0cnica in vitro utili1ada para para am ampl pli2 i2ca carr en1i en1im3 m3ti tica came ment nte e una una re+i re+ión ón dete determ rmin inada ada de AD4 AD4 situada entre dos re+iones de AD4 cu$a secuencia se conoce# Mientras 5ue 5ue ante antess so solo lo pod, pod,an an o%te o%tene ners rse e ca cant ntid idad ade es m,ni m,nima mass de un +en +en espec,2co/ a*ora ora incluso un 6nico e7emplar de un +en puede ampli2carse con la PCR *asta un millón de e7emplares en tan solo unas pocas *oras# Las t0cnicas de PCR se *an *ec*o indispensa%les para muc*os muc*os proced procedimi imient entos os comune comunes/ s/ como como la clonac clonación ión de 8ra+me 8ra+mento ntoss espe es pec, c,2c 2cos os de AD4/ AD4/ la dete detecc cció ión n e iden identi ti2c 2cac ació ión n de +ene +eness para para dia+ dia+nó nóst stic ico o $ me medi dici cina na le+al le+al// $ en la inve invest sti+ i+ac ació ión n de mode modelo loss de e9pre e9presió sión n de los +enes# +enes# M3s recie reciente ntemen mente/ te/ la PCR *a permi permitid tido o la investi+ación de nuevos campos/ como el control de la autenticidad de los los alim alimen ento tos/ s/ la pres presen enci cia a de AD4 AD4 modi modi2c 2cado ado +en0 +en0ti ticam camen ente te $ la contaminación micro%ioló+ica# Para comprender los principios de la PCR $ sus aplicaciones/ de%e atenderse en primer lu+ar a la naturale1a de la mol0cula del AD4/ por lo 5ue en la sección si+uiente se descri%en la estructura $ la replicación del AD4#

FACULTAD FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS BIOLÓ GICAS

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REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) OBJETIVOS: : Descri%ir el proceso del PCR# : Detallar los componentes necesarios para llevar a ca%o un PCR# : Preparar una PCR

INTRODUCCION: La reacción en cadena de la polimerasa 8ue desarrollada en &'(; por el Doctor "ar$ Mullis perteneciente a la Cetus Corporation en Cali8ornia# El Dr# Mullis reci%ió en &''; el Premio 4o%el de ?C# El si+uiente paso consiste en un descenso de la temperatura para permitir 5ue los ce%adores se unan por complementariedad al D4A molde# Esta se+unda 8ase se conoce como *i%ridación# Temperaturas *a%ituales en esta 8ase oscilan entre ;) $ @?C# Por 6ltimo/ en la 8ase de elon+ación o e9tensión/ la en1ima polimerasa incorpora nucleótidos complementarios a partir del e9tremo ; li%re de la re+ión en 5ue *an *i%ridado los ce%adores# La temperatura a la 5ue se lleva a ca%o esta 8ase depende de la en1ima polimerasa empleada si se utili1a Ta5 polimerasa la temperatura de elon+ación suele ser de ?C# Los componentes necesarios para *acer un PCR son= El D4A a partir del cual 5ueremos o%tener una copia de un 8ra+mento/ es decir/ el D4A 5ue 5ueremos ampli2car# Este D4A se conoce como D4A molde# FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

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Una en1ima capa1 de +enerar una copia de D4A a partir del D4A molde= una D4A polimerasa# La reacción se lleva a ca%o en un tampón apropiado para el 8uncionamiento de la en1ima polimerasa# Adem3s/ como co8actores de la polimerasa se aFaden cationes divalentes/ +eneralmente en 8orma de cloruro de ma+nesio M+Cl!# Iniciadores de la reacción= Las en1imas D4A polimerasas 6nicamente son capaces de aFadir nucleótidos al e9tremo ; li%re de una do%le cadena de D4A# -on necesarios por tanto mol0culas cortas entre & $ ; %ases! de D4A de cadena sencilla# Estas mol0culas son los ce%adores o primers de la Reacción/ ellos son los 5ue van a delimitar el 8ra+mento a ampli2car# 4ucleótidos li%res= las en1imas D4A polimerasas van a crear una cadena complementaria a la cadena molde mediante la incorporación de nucleótidos al e9tremo ; li%re del ce%ador 5ue se *a unido a la cadena molde# Los nucleótidos se aFaden en 8orma de deso9irri%onucleósidos tri8os8ato d4TPs!# Estos cuatro componentes son los elementos %3sicos 5ue es necesario incorporar a la reacción para 5ue se complete una PCR#

MATERIALES:           

d4TPs# Dos ce%adores o iniciadores en in+l0s/ primers!# Iones divalentes# -e suele usar ma+nesio M+!/ Mn! Iones monovalentes/ como el potasio# Una solución tampón o %uHer 5ue mantiene el p adecuado para el 8uncionamiento de la AD4 polimerasa# AD4 polimerasa Ta5!# AD4 molde# Termociclador# Micropipetas Tips o puntas pl3sticas# Tu%os

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

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PROCESO METODOLOGICO Cada cic! d" PCR c!#$%a d" %&"$ 'a$"$: 1 D"$#a%&ai*aci+#: En esta el AD4 %lanco de do%le cadena se somete a una temperatura de '? a ') ?C durante ; se+undos permitiendo la separación de las dos cadenas# 2 ,i-&idi*aci+#: En esta la temperatura de la me1cla se disminu$e *asta alcan1ar la temperatura adecuada para 8avorecer el apareamiento de los primers con la secuencia %lanco/ lo cual +eneralmente ocurre entre >) a )) ?C dependiendo de la temperatura de Jusión o Tm de los primers! durante  a ; se+undos 3 E!#.aci+# ! "/%"#$i+#: En este la temperatura de la me1cla se eleva *asta  KC para 5ue la Ta5 polimerasa D4A polimerasa! comience el proceso de e9tensión en dirección ) a ; a+re+ando los nucleótidos correspondientes/ o%teni0ndose la *e%ra complementaria de D4A o AMPLIC4# En cada ciclo de PCR se duplica todo el AD4 presente en la reacción/ de manera 5ue en unas pocas *oras se o%tienen millones de copias de un solo 8ra+mento#


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Estas tres 8ases tienen lu+ar en el mismo tu%o $ constitu$en un ciclo completo de PCR/ 5ue se reali1a en menos de dos minutos# Teóricamente/ el ciclo de PCR se puede repetir sin l,mite/ pero la polimerasa/ los nucleótidos $ los ce%adores suelen Renovarse al ca%o de unos ; ciclos# Estos ; ciclos/ 5ue duran menos de tres *oras/ %astan para producir mil millones de copias de AD4#

C!#$id"&aci!#"$: Al 2nal del primer ciclo de la PCR/ *a$ dos do%les *e%ras de AD4 id0nticas a la ori+inal/ cada nueva *e%ra producida se denomina AMPLIC4# Este ciclo de tres pasos desnaturali1ación/ alineamiento $ e9tensión! puede a*ora repetirse muc*as veces# Con8orme la PCR contin6a/ se crean primero dos/ cuatro/ oc*o/#n copias nN n6mero de ciclos!/ o%teni0ndose despu0s de ; ciclos &#;#>&#(> copias# Este proceso de la PCR tam%i0n es llamado AMPLIICACIÓN de%ido a 5ue la secuencia o%7etivo es copiada una $ otra ve1 con el o%7eto de *acer millones de copias# A*ora $a *a$ su2ciente material +en0tico para detectar la presencia $ la cantidad del pató+eno# La temperatura de 8usión o Tm a la cual se reali1a el paso de *i%ridi1ación/ representa la temperatura a la cu3l ) de un oli+onucleótido con una secuencia espec,2ca se encuentra unido $ la otra mitad se encuentra desnaturali1ado#

PROCEDIMIENTO: El procedimiento 5ue a continuación se descri%e es utili1ado para la detección del +en de resistencia a amino +lucósidos en cepas de M# tu%erculosis $o se llevara a ca%o la con2rmación de +0nero $ especie mediante ampli2cación multiple9# De acuerdo al protocolo#

01 E9tracción del AD4 por el m0todo de Boilin+/ de acuerdo a protocolo del la%oratorio de Biotecnolo+,a# )# Reali1ar la me1cla maestra de PCR master mi9!/ como se descri%e a continuación/ encontrar el volumen para 5ue la concentración 2nal


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5uede como se indica/ adicionando los Primers espec,2cos $ el AD4 en estudio# &# -e toman @> Ql de a+ua +rado &milli # una ve1 5ue todos los componentes est3n convinados en el mi9 se procede a+re+ar la muestra de AD4 molde para despu0s ser llevado al termocilcador $ esperar de & *oras para 5ue ampli25ue#

M. tuberculosis

Marcador= I-@&& &;p%!/ I- S ('! Procedimiento= M&= control positivo M= control ne+ativo M;=# FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

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M>=# M)=## I- @&& REACTA4TE-

OLUME4ul JI4ALV !

A+ua destilada

)/@

)W %uHer

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) mM M+Cl

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/) uM d4TPs

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) uM ce%ador

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En1ima

/

&Utu%o

AD4

)

MIW ul!

)ul

C!#dici!#"$ d" PCR: Predenaturacion= ')?C 9 ;X Denaturacion= ')?C 9 ;XX i%ridación= @?C 9 >)X

;

E9tensión= ?C 9 ;XX

Ciclos

Poste9tensión= ?C 9 ;X

04 isuali1ar el resultado en +el de a+arosa de acuerdo al tamaFo del producto ampli2cado en la si+uiente clase FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

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Ta%la &# -ecuencias de primers para la ampli2cación de +enes espec,2cos de una %acteria $ de un +en de resistencia# -ecuencia de Oli+onucleótidos= MARCADOR

-ECUE4CIA

I-@&&

)XCCT GCG AGC GTA GCC GTC GG;X )XCTC GTC CAG CGC CGC TTC GG;X

I- ;

)XTTC GGA CCA CCA GCA CCT AA;X

I- >

)XTCG GTG ACA AAG GCC AGG TA;X

T""&a%&a d" "%iaci+#: TKN>GC!AT! KC •

PARA I-@&= TKN>(!;! KC N KC

•

PARA I- ; = TKN >;(!@;! KC N@ KC

CONCLUSIONES En conclusión/ la PCR es una nueva *erramienta de investi+ación $ dia+nóstico de la%oratorio mu$ potente 5ue a%re todo un nuevo mundo de posi%ilidades# -u aplicación *a de ser limitada a a5uellos casos o estudios 5ue lo permitan $ en nin+6n momento su aplicación *a de desmerecer $ suplir la t0cnica o2cial de detección $ enumeración de Le+ionella I-O &&;&!

RECOMENDACIONES: •

•

Reali1ar los c3lculos para o%tener el e9perimento deseado de lo contrario 8allaremos en el intento $ no se podr3 apreciar los resultados# Tener muc*o cuidado $ asepsia para 5ue pueden o%tenerse los resultados deseados#

CUESTIONARIO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

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1 BIBLIOGRAIA Revista 4ature Protocolos AFos '&; Articulo Bodas de Plata de la PCR Revista 4ova UCMC# (# Glad$s Pinilla PCR protocols second edition Y*on M#-# BARLETT DAID -TIRLI4 UMA4A PRE-- TOOZA 4EZ [ER-E[# OL @ ; RAPID CICLE REAL TIME PCR METOD- A4D APPLICATIO4 MICROBIOLOG[ A4D JOOD A4ALI-I-# -PRI4GER U# REI-TL C#ZITTZER J# TOT"ERILL #


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