INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Ingeniería Campus Guanajuato Laoratorio de !iotecnología "olecular #!"$
Pr%ctica no& #
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR). EQUIPO 4
Arag'n L'pe( )o*ana Sara+, C+ago,a S%nc+e( C,nt+ia -aren .ranco García /aleria Guadalupe 0amíre( "orales "aría Antonieta PROFESORES:
1r& C2sar A(a Gon(%le( 1ra& -arla Li(et+ "acías S%nc+e( "&C& )ulieta Sep3l*eda Angulo
4# de Octure de $45#&
OBJETIVO GENERAL ● Amplificar un fragmento de ADN mediante la técnica de PCR y visualizarlo en gel de agarosa.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ● Conocer el fundamento de la técnica PCR. ● Determinar el tamaño promedio del fragmento de ADN teniendo como referencia un marcador de peso molecular y compararlo con el tamaño reportado.
RESULTADOS
TÉCNICA DE PCR Para la presente práctica se generaron dos mezclas de reaccin de PCR con distintas concentraciones !"a#la $% empleando como templado el gen GFA1 producto de una PCR de ADN de Sporotrix shenckii. &l gen fue proporcionado por los profesores el mismo d'a de la práctica. (as muestras y los reactivos se mantuvieron a )*C apro+imadamente durante toda la práctica. Tabla 1. Mezclas de reacción de PCR
Reactivo
,olumen !-(%
Concentracin final
ezcla $
ezcla /
ezcla $
ezcla /
Agua
$0
$1
2/3v4v
253v4v
Regulador de PCR !$5+%
/.1
/.1
5.6/+
$+
gCl/ !15 m%
/
/
7.0 m
) m
8ligo directo !$5 -%
$
$
5.70 -
5.) -
8ligo reverso !$5 -%
$
$
5.70 -
9
dN"P:s !/.1 m%
/
/
5.$; m
5./ m
ADN plasm'dico !$55 ng4-(%
$
$
7.0 ng4-(
) ng4-(
5.1
5.1
/.1 unidades
/.1 unidades
"a< polimerasa
&l termociclador fue programado para 75 ciclos siguiendo las condiciones mostradas en la "a#la /. Tabla 2. Condiciones para la amplificación por PCR del gen
Ciclos
Accin
"emperatura !*C%
"iempo
$
Desnaturalizacin inicial
6)
1 min
75
Desnaturalizacin
6)
)1 s
Alineacin
16
$ min
&+tensin
0/
$ min
$
&+tensin final
0/
1 min
=inal
antenimiento
)
∞
ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA AL 1% Para corro#orar
se o#serv el gel #a?o luz ultravioleta en el transiluminador o#teniendo los resultados visualizados en la =igura $.
600pb
Figura 1. Electroforesis del Gen GF1 amplificado por PCR. a) Marcador Hyperladder 1Kb BIOI!"# b) Me$cla de reacci%n sin oli&on'cle%tido re(erso# c) Me$cla de reacci%n copleta# d) A*! teplado +GFA1).
@e o#serv una #anda de apro+imadamente 255 p# en el carril correspondiente a la mezcla $> mientras
DISCUSIONES REACCIÓN EN CADENA DE POLIMERASA &l método de amplificacin de ácidos nucleicos usado fue el de reaccin en cadena polimerasa !PCR%> ya una sola copia de ADN templado> a menudo no detecta#le por los métodos de Bi#ridacin estándares> se multiplica a $5 0 o más copias en un periodo relativamente #reve. &sto proporciona gran cantidad de templado> es posi#le o#servar
A
continuacin se presenta la importancia y funcin de cada uno de los reactivos necesarios para la reaccin de PCR
A&'a desioni$ada est,ril
Dadas las #a?as concentraciones de sales es ampliamente usada para técnicas como lo es la PCR> as' se evitan variaciones inicas en la reaccin y posi#les interferencias !&guiarte et al .> /550%. -lor'ro de a&nesio +M&-l)
(a enzima "a< DNA polimerasa re en el sentido pero la reaccin no puede proceder sin la presencia del mismo> es importante considerar para la concentracin final en la mezcla de reaccin> pues altas concentraciones de este metal inBi#en la accin de esta enzima> generando productos inespec'ficos !&guiarte et al.> /550%> regularmente se tra#a?a con un rango de concentracin entre $ y 7 m> sin em#argo puede variar de acuerdo a la casa comercial ya $66;%. *esoxirribon'cle%tidos tri/os/atados +d!0s)
(os dN"P:s son los #lo dC"P> dE"P> d""P%> usualmente a una concentracin de /55F. Concentraciones #a?as de dN"Ps disminuyen el 'ndice de incorporacin errnea de los nucletidos> mientras $661G arris> $66;%. 8tro factor a considerar es la inesta#ilidad de los dN"Ps> ya y es a partir de 7 a 1 ciclos por lo estos pudieron Ba#er estado dañados. Oli&on'cle%tidos +*irecto y 2e(erso)
(os oligonucletidos Bi#ridan con regiones espec'ficas del ADN> delimitando la regin de interés. "ienen una longitud de $1 a 75 nucletidos y su secuencia es lo la concentracin ptima para PCR usualmente está entre 5.$ y $F !"orres et al > $661G arris> $66;%. 0eplado +A*!)
(a calidad del material genético afecta directamente el resultado de la reaccin> si éste presenta contaminacin> con prote'nas o detergentes> la reaccin puede inBi#irse !&guiarte et al.> /550%. B'//er 134
(a mayor'a de los #uffers contienen "ris $5m y HCl 15mG el p var'a de ;./ a 6 a /1*C sin em#argo éste se reduce conforme aumenta la temperatura por lo $66;% 0a5 A*! polierasa
(a "a< polimerasa se de#e mantener en congelacin !9/5*C% Basta su uso> y posteriormente en Bielo. De#e agregarse como ltimo reactivo a la reaccin para evitar /551%.
&sta enzima puede resistir a temperaturas de 61*C> necesarias para la separacin de las dos Be#ras de ADN y permite mane?ar la astringencia de la reaccin y as' acceder nicamente a las secuencias de ADN espec'ficas de la zona utilizada !@forza> /550%. &l principio de la PCR se #asa en la amplificacin de un fragmento espec'fico de ADN a través de ciclos sucesivos en los Bi#ridacin y e+tensin. (a primera de ellas> la desnaturalizacin permite iniciar la reaccin ya para pues si éste slo se desnaturaliza parcialmente tenderá a Bi#ridar nuevamente dificultando con esto la alineacin de oligonucléotidos !arris> $66;%. &n cuanto a la Bi#ridacin segn JroKn !/55;% una vez esta temperatura depende directamente de la temperatura de alineamiento de los oligonucléotidos. Para la amplificacin del gen GFA1> se usaron oligonucletidos espec'ficos con las siguientes secuencias 8ligo Directo 8ligo Reverso
1: CEC"CCA"AC"AECCCE" 7: 1: ECAACC""ECCAACC"CC" 7:
@e realiz un análisis de éstos con la Berramienta 6rier *esi&n and Search 0ool7 de Ji@earcB !"a#la )% para conocer la temperatura de Bi#ridacin ptima> la cual regularmente se considera 1*C por de#a?o de la temperatura de fusin de los oligonucletidos !Minler> /5$)%. Tabla ". Caracter#sticas de los oligonucleótidos utilizados
8ligo
"amaño
"m !*C%
3EC
Directo
$;
22./
2$.$
Reverso
$6
2).2
10.6
"m promedio !*C%
21.)
" alineamiento !*C%
25.)
(a temperatura de alineamiento utilizada fue de 16*C> sin em#argo ésta se puede variar de / a 1*C para optimizar la amplificacin del ADN de interés !arris> $66;%. =inalmente durante la etapa de e+tensin> la ADN polimerasa termoresistente incorpora nucletidos en el e+tremo 7O del ce#ador utilizando como molde la cadena de ADN previamente desnaturalizada. (a temperatura a la $66)G Earc'a> /552G Ro?o> /5$)G Minler> /5$)G arris> $66;%. &l tiempo de esta etapa depende del tamaño previsto del fragmento a amplificar considerando /550G Minler> /5$)%.
,@QA(IACN &N E&( D& AEAR8@A A( $3
Después de de#e analizarse el producto de amplificacin. (a electroforesis en gel es una de las formas más simples de ad pero a menudo se usa un gel simple de agarosa. &s necesario comparar cualitativamente el producto de PCR> con otros ya reportados> en la =igura / se o#serva el resultado de la amplificacin del gen RP(7/. Al igual carril c> el gen amplificado es visualizado como una sola #anda> producto de una PCR realizada correctamente.
Figura 2.Electroforesis en gel de agarosa al 1$. 1) Marcador de peso olec'lar# ) -ontrol ne&ati(o# 8 y 9) &en 28 apli/icado +,re$ et al# 319).
De acuerdo con Minn y col !/552%> la presencia de una #anda nica del tamaño esperado es una #uena evidencia preliminar de la especificidad de la reaccin de PCR> lo cual puede o#servarse en los resultados o#tenidos> la nica #anda visualizada en el gel present poca intensidad lo pues e+iste una relacin proporcional entre la intensidad de la #anda y la cantidad de producto amplificado !uñoz> /5$1%. &n teor'a> es suficiente con una molécula de ADN para amplificar un fragmento por PCR sin em#argo> el rendimiento a pe /557%> de modo la sensi#ilidad y la especificidad en el análisis de una muestra por PCR pueden ser aumentadas si se realiza un segundo PCR o n9PCR. &l ensayo por n9PCR consiste en dos reacciones de PCR consecutivas. &n la primera reaccin de amplificacin se utilizan ce#adores espec'ficos de la secuencia por analizar. &l producto de esta reaccin sirve como templado para una segunda reaccin de PCR. (a sensi#ilidad en la deteccin se ve aumentada ya $66;%. &sto puede o#servarse en la =igura $ comparando los carriles c y d> am#as muestras se tratan del gen GFA1> sin em#argo éste solo es visi#le en el carril c este tamaño es muy cercano a la #anda o#servada en el carril c de la =igura $
Figura !. %ecuencia del gen GF1. & 'a secuencia del oligo es el re(erso complementario de la sección resaltada.
Cuando no se o#serva producto luego de una PCR se puede de#er a fallas en 7 parámetros principales f'sicos o térmicos. Qno de los errores $66;%. &n el caso del carril # en la =igura $> no se espera#a o#servar producto de#ido a la ausencia de oligo reverso en la preparacin. 8tra forma de e+plicar la ausencia de producto es mediante la frmula para calcular el nmero de copias segn los ciclos de reaccin !orton et al > $66)% -opias de A*! apli/icado:
n
2
−1
donde se consideran las cadenas en nuestro caso> al añadir nicamente el oligo directo> la frmula se modificar'a de la siguiente manera -opias de A*! apli/icado:
−1
n
1
De donde es #ien sa#ido $6;6%> lo siempre se o#tendrá una sola cadena>
CONCLUSIONES • •
•
@e amplific el gen GFA1 mediante PCR consecutiva. @e determin el tamaño del gen mediante la visualizacin en gel de agarosa coincidiendo con el tamaño consultado en la #ase de datos de NCJ. @e comprendi el fundamento terico de la PCR.
CUESTIONARIO
Cal!la a pa"#$" & la '(")!la a&!aa la T) & l*+ *l$,*-!l&(#$*+ p"*p*"$*-a*+. (a temperatura de alineamiento> es la temperatura a la y depende directamente del porcenta?e de cada una de las #ases> me?or dicBo de las uniones entre las #ases.
T )(+% U / (+%
!&ntrala> /555%
8ligonucletido directo
+T$$ +T0
T )!$$%U / !0%T1;°
8ligonucletido reverso
+T$$ +T;
T )!$$%U / !;%T25°
promedioT
16*C
M&-$*-& /!& +!&&"a +$ +& !#$l$a !-a #&)p&"a#!"a & al$-&a)$&-#* )!2 $-'&"$*" * )!2 +!p&"$*" a la #&)p&"a#!"a (p#$)a. (a temperatura de alineamiento depende de la longitud del primer> si dicBa está por encima o por de#a?o de la ptima funcionará incorrectamente. &n caso de por el contrario> al ser muy #a?a será una unin inespec'fica !Arredondo> /55$%.
M&-$*-& la+ p"$-$pal&+ a!+a+ a la+ /!& a#"$b!$"a. a. A'sencia de apli/icado
● Degradacin del ADN puede ocurrir cuando se manipula la muestra en condiciones su#ptima o #ien pérdida de un alelo> alterando as' los resultados de la amplificacin. ● nBi#icin de la PCR puede Ba#er agentes /551%. #. Apli/icaci%n en 'n control ne&ati(o. &l control negativo se utiliza para compro#ar Beparina% 9&+traccin del ADN defectuosa 9utacin en el sitio de Bi#ridacin del ce#ador 9Ja?a concentracin o calidad del templado 9Concentracin incorrecta de g/U o primers !8gaKa et al.# $6;5%.
I-3&+#$,!& /!4 p*"a 5a&" pa"a *""&,$" l*+ +$,!$&-#&+ "&+!l#a*+. a. resencia de prod'ctos inespec;/icos de apli/icaci%n.
● A?ustar la temperatura de annealing (a optimizacin de la temperatura de annealing es particularmente importante segn aumenta la comple?idad genética de la muestra. Qna mayor comple?idad favorece el annealing inespec'fico y #a?o condiciones no muy estrictas la #a?a
especificidad puede provocar la amplificacin de productos inespec'ficos como regla general> conviene empezar por la temperatura o#tenida de frmulas matemáticas e irla incrementando varios gradosG a la primera señal de pérdida de sensi#ilidad se de#e elegir la temperatura inmediatamente inferior. ● A?ustar la concentracin de los primers @i la concentracin de primers es #a?a puede ocasionar un po#re rendimiento de la reaccin. @i es demasiado alta puede ocasionar una disminucin de la especificidad puede favorecer la formacin de d'meros de primers !Roca et al.# 339).
b. Ba
● A?uste de la concentracin de g/U &l aumento de la Vg/UW tiene el efecto neto de disminuir la severidad de la unin de los primers y> por lo tanto> una #a?a especificidad de la reaccinG las #a?as Vg/UW pueden originar una po#re eficiencia de la reaccin. (a Vg/UW de#e calcularse como funcin de la concentracin de nucletidosG para la mayor'a de protocolos> de#e pro#arse un rango de Vg/UW entre 5.1 y 7.5 m por encima de la concentracin de nucletidos. ● &l a?uste de los Deso+inucletidos "rifosfato !dN"Ps% (a concentracin ptima de dN"Ps de#e determinarse emp'ricamente y con?untamente con la Vg/UW. De forma general> la VdN"PsW var'a entre /5 y /55 m> teniendo en cuenta pero para la "a< polimerasa var'a entre $.5 y /.1Q por cada $55 -( de reaccin. Para optimizar la concentracin de enzima> se de#e testar emp'ricamente el protocolo variando la concentracin entre 5.1 y 1.5 Q por cada $55 -( de reaccin. Cuando la concentracin de enzima es muy elevada se produce la unin inespec'fica de los primers y cuando es demasiado #a?a se o#tiene una #a?a eficiencia de amplificacin. !Roca et al.# /55)%# !Carzoglio et al .> /550 ).
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● uñoz P. !/5$1%. XF'ndaentos de la reacci%n en cadena de la olierasa +-2)7 @onora "@8N &ducar para trascender ● 8gaKa ".> 8azai ". !$6;5%. XDiscontin'o's *!A replication. Ann'al 2e(ie> o/ Biocheistry7 .Pp. )6. ● Pérez A.> Crespo =.> @anmart'n (.> !/5$)%> 6Selecci%n de &enes de re/erencia en seen e5'ino ● ● ● ● ● ● ●
criopreser(ado para s' 'so en est'dios de expresi%n &en,tica con la t,cnica de -2 c'antitati(a7# @anidad litar no. $.> &spaña. Roca> P.> Sordi 8.> Rodr'guez A. !/55)%. 6Bio5';ica: t,cnicas y ,todos7 . &d. élice. &spaña.
Pp. /$. Ro?o . !/5$)%. 6Gen,tica Molec'lar e In&enier;a Gen,tica7. &d. Pirámide. adrid. Pp. $1/. @forza C. !/550%. 6"l dia&n%stico en cl;nica7. &d. édica Panamericana. Juenos Aires. Pp. 07. "orres A.> Jaca J. !$661%. 62eacci%n en -adena de la olierasa7. &d &lementos. ,ol 7. Pp. $29/$ Minler ("DA. !/5$)%. 60a5 *!A olierasa7. @antiago> CBile. V&n l'neaW KKK.Kinlerltda.com Minn M.> Honeman &.> Allen @.> Procop E.> Sanda MG@cBrecen#erger P.> Moods E. !/552%. 6*ia&n%stico icrobiol%&ico. 0exto y atlas en color7 . &ditorial édica Panamericana. Juenos Aires> Argentina. Iavala C.> !/551%> Xanual de "écnicas Jásicas de Jiolog'a olecularY. Qniversidad Autnoma de \ucatán> é+ico> Pp. $$09$//.
