Ejercicios de PCR Parte I.
1. La finalidad de la PCR es hacer copias de un fragmento de ADN de interés. En este ejercicio, una cadena de la doble hélice de DNA será llamada Original-1. Escribe la secuencia de nucleótidos de la cadena complementaria que se llamará Original-2. Fragmento de ADN de interés (01) Original-1 3' T C G G C T A C A G C A G C A G A T G G T A C G T A 5' (02) Original-2 5' _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 3'
Parte II.
2. Un fragmento de ADN conocido como cebador se sintetiza artificialmente y tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a las bases adyacentes del segmento Original-1. Escriba la secuencia de nucleótidos de las cinco bases de Cebador-1. 3. Escribe la secuencia de nucleótidos de los cinco bases de Cebador-2. (01) Original-1 3' T C G G C T A C A G C A G C 5' _____ (Cebador-1) (02) Original-2 5' A G C C G A T G T C G T C G 3' _____ (Cebador-2)
A G A T G G T A C G T A 5' 3’ T C T A C C A T G C A T 3' 5'
Parte III.
4. En el ciclo 1 y todos los ciclos posteriores de la reacción de PCR, una copia de cada una de las dos hebras originales se sintetizarán comenzando en el extremo 3' del cebador y continuando hasta el extremo 5' de la cadena original. Escriba la secuencia de las copias que se hacen de las hebras de O-1 y O-2. (01) Original-1 3' T C G G C T A C A G C A G C A G A T G G T A C G T A 5' (C1) Copy-1
5'
C C G A T _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 3'
(O2) Original-2 5' A G C C G A T G T C G T C G T C T A C C A T G C A T 3' (C2) Copy-2
3' _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ A T G G T 5'
Parte IV. 5. Durante el segundo ciclo de la PCR, se hace una copia de cada una de las hebras Original-1, Copia-1, Original-2, y Copia-2 obtenido en el ciclo 1. Escriba la secuencia de Copia-1 formado durante la replicación de Original-1 en el ciclo 2. ¿Difiere la secuencia de la de Copia-1 realizada en el primer ciclo? Escribe la secuencia de Copia-2 formada durante la replicación de Original-2 en el segundo ciclo. ¿Difiere la secuencia de la Copia-2 realizada en el primer ciclo? 6. Para hacer una copia de la hebra C1, un cebador se une a las secuencias correspondientes a la hebra C1. Tenga en cuenta que sólo uno de los dos cebadores será apropiado. Escriba la secuencia del cebador. Completar la secuencia del CC1. 7. Para hacer una copia de la hebra C2, escriba la secuencia del cebador en el lugar apropiado en CC2. Completar la secuencia de CC2. (01) Original-1 3' T C G G C T A C A G C A G C A G A T G G T A C G T A 5' (C1) Copia-1
5'
C C G A T _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 3'
(C1) Copia-1
5'
C C G A T G T C G T C G T C T A C C A T G C A T 3'
(CC1) Copia-C1 3'
_______________
5'
(O2) Original-2 5' A G C C G A T G T C G T C G T C T A C C A T G C A T 3' (C2) Copia-2
3' _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ A T G G T
(C2) Copia-2
3' T C G G C T A C A G C A G C A G A T G G T
(CC2) Copia-C2 5'
___________________
5' 5'
3'
8. ¿Cuántas hebras de cada uno de los siguientes están presentes después del segundo ciclo? O1 ___
O2 ___
C1 ___
C2 ___
CC1 ___
CC2 ___
Parte V. 9. Para el tercer ciclo de PCR, cada una de las ocho hebras producidas por el ciclo 2 se replican. Escribe el símbolo de la hebra producida por replicación del O-1, C1, O-2, y C2. Puede hacer referencia a la cuarta parte del ejercicio para obtener ayuda. 10. Para replicar CC1 y CC2, un cebador se une a una secuencia apropiada en cada una de las hebras. Escribe la secuencia del cebador en el lugar apropiado en las nuevas hebras. Completar la secuencia de las dos cadenas. O-1 ___ ? C1 ___ ? C1 ___ ? CC1
3' G G C T A C A G C A G C A G A T G G T 5'
CC2
5' _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 3'
O2 ___ ? C2 ___ ? C2 ___ ? CC2
5' C C G A T G T C G T C G T C T A C C A 3'
CC1
3' _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 5'
11. ¿Cuántas hebras de cada uno de los siguientes tipos están presentes después del tercer ciclo? Hebras totales _____ O1 ___
O2 ___
C1 ___
C2 ___
CC1 ___
CC2 ___
Parte VI. 12. Durante el cuarto ciclo de PCR, las hebras producidas por el tercer ciclo serán copiadas de la misma manera que los ciclos anteriores. Use la Parte IV como referencia y determine el número de hebras de cada uno de los siguientes que estará presente después de completar el ciclo 4. Hebras totales ____ O1 ___ O2 ___ C1 ___ C2 ___ CC1 ___ CC2 ___
Parte VII. 13. El número total de hebras presentes al final de cada ciclo se calcula así: CT =2*# de ciclo + 1 Utilice este principio para calcular y registrar el número total de hebras en la tabla de abajo. 14. La reacción de PCR se inició con una doble hélice del ADN que se separa en dos hebras designadas como O-1 y O-2. Registre el número de hebras de O-1 y O-2 en la tabla de abajo. 15. El número de copias de cada una de C1 y C2 se incrementa en uno cada ciclo. Anote el número de hebras de C1 y C2 en la tabla siguiente. 16. El número de copias de cada una de CC1 y CC2 en cada ciclo se puede determinar restando las copias de O1, O2, C1 y C2 del número total y dividiendo la diferencia entre 2. = [CT - (O1 +O2 +C1 +C2)]/2 Utilice este principio para completar la tabla de abajo. Ciclo Total
O1
O2
C1
Número de hebras C2 CC1 CC2
O
___
___
___
___
___
___
___
1
___
___
___
___
___
___
___
2
___
___
___
___
___
___
___
3
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___
___
___
___
___
___
4
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___
___
___
___
___
___
5
___
___
___
___
___
___
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: : 10
___
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___
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___
___
: : 20
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Parte VIII Las siguientes secuencias corresponden a un par de oligonucleótidos utilizados como cebadores para la amplificación del gen que codifica para la amelogenina en humanos, proteína encargada del esmalte de los dientes, y utilizado en ciencias forenses para la determinación del sexo en cadáveres. Fwd 5’ C T C A T C C T G G G C A C C A C T T G T T A T A T C 3’ Rev 5’ G G T A C C A C T T C A T A G G G G T C A G C A C 3’
De acuerdo a la secuencia anterior determine: El porcentaje de T, C, G y C La temperatura media de alineación (Tm) De acuerdo con las recomendaciones para los diseños de los cebadores: La longitud de los cebadores es adecuada? Explique su respuesta Los oligos son complementarios entre sí? La diferencia entre sus Tm es adecuada? Explique su respuesta El porcentaje de C+G es adecuado? Explique su respuesta 1. Elija la opción correcta (Reacción en Cadena de la Polimerasa)
A) La PCR permite la amplificación exponencial de unas pocas moléculas diana de ADN. B) La PCR incluye 3 pasos que se repiten al menos 50 veces: naturalización, alineamiento y polimerización. C) Los cebadores para la PCR estándar deben ser autocomplementarios. D) El ADN molde en una PCR sólo puede ser ADNc. E) Un ejemplo de ARN polimerasa termoestable es la Taq.
2. Elija la opción correcta (Reacción en Cadena de la Polimerasa) A) Entre las múltiples aplicaciones de la PCR, están la investigación forense y las pruebas de paternidad. B) La RT-PCR es una variación de la PCR que permite amplificar ADNc. C) La RT-PCR requiere de una ADN polimerasa dependiente de ADN. D) A y B son correctas. E) Todas las anteriores son incorrectas. 2. Si la secuencia 5’-G-T-G-G-G-A-A-T-G-T-C-C-A-A-A-G-A-A-T-C-T-GT-C-3’ fuera de una hebra de ADN molde, ¿Cuál es la secuencia del ARN transcrito? (indica en la respuesta el extremo 5’ y el 3’)
3. Si la secuencia 5’-G-T-G-G-G-A-A-T-G-T-C-C-A-A-A-G-A-A-T-C-T-GT-C-3’ fuera de una hebra de ADN codificante, ¿Cuál es la secuencia del ARN transcrito? (indica en la respuesta el extremo 5’ y el 3’)
¿A qué tipo de dominio de unión al ADN corresponden las siguientes imágenes?
