LA PCR CONVENCIONAL La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de biología molecular que permite la rápida replicación del ADN. Con la PCR, cantidades mínimas de material genético pueden ser amplificadas millones de veces en pocas horas permitiendo la detección rápida y fiable de los marcadores genéticos de enfermedades infecciosas, cáncer y desórdenes genéticos. El uso de la tecnología de la reacción en cadena de la polimerasa ha aumentado mucho la capacidad de los científicos para estudiar el material genético. Desde su invención por científicos de Cetus Corporation en 1983, la PCR ha cambiado la forma en la que se lleva a cabo la investigación y diagnóstico médico. La capacidad de producir rápidamente grandes cantidades de material genético ha permitido avances científicos significativos, incluyendo huella dactilar del ADN y la secuenciación el genoma humano. La PCR está diseñada según el principio natural de replicación del ADN. Es un proceso de tres pasos, designado como un ciclo, que se repite un número específico de veces. Un ciclo de PCR consiste en los siguientes pasos: 1. Desnaturalización 2. Alineación 3. Extensión Este proceso tiene lugar en un termociclador, un instrumento que automáticamente controla y alterna las temperaturas durante períodos programados de tiempo para el número apropiado de ciclos de PCR (generalmente entre 30 y 40 ciclos).
Desnaturalización. En esta etapa, las cadenas de
ADN son calentadas y separadas a una temperatura de 95 °C durante 20-30 segundos; el tiempo tiempo depende de la secuencia del templado, templado, es decir, si la cantidad de G-C es alta, será necesario necesario más tiempo para romper sus uniones debido a que el apareamiento de estas bases está formado por tres enlaces, uno más que las bases de A-T. Además, depende de la la velocidad en la que el termociclador aumenta la temperatura, esto varía de acuerdo al modelo del equipo. Al fi nal de de esta etapa tendremos las cadenas separadas que servirán servirán como templado para el siguiente paso
Hibridación. En esta etapa, los primers se alinean al extre mo 3’ del templado previamente separado e hibridan con su secuencia complementaria. Para que se forme el complejo templado-primers, es importante que la temperatura de
hibridación o temperatura melting (Tm) sea la óptima; ésta generalmente oscila entre 50-60 °C. Si el diseño de los primers es el correcto y la temperatura es la adecuada, la estabilidad y especificidad del complejo será eficiente.
Extensión. En esta etapa, la Taq polimerasa actúa sobre el complejo templadoprimers y empieza su función catalítica a una velocidad muy rápida; agrega dNTP’s complementarios para crear las cadenas completas de ADN. La extensión de las cadenas es en dirección de la síntesis del ADN, es decir, de 5’ a 3’. La temperatura óptima para la reacción es de 72 °C, ya que a esa temperatura la enzima es funcional. Al final del ciclo, se habrán formado los amplicones con un tamaño dictado por el número total de pares de bases (pb) que deberá ser conocido por el investigador.
LA PCR EN TIEMPO REAL La PCR en tiempo real o PCR cuantitativa permite cuantificar además de detectar y amplificar secuencias de ADN. La prueba se basa en la Reaccion de Cadena de la Polimerasa donde un fragmento de DANA de tamaños conocido es copiado y amplificado billones de veces. El producto del PCR (punto final) es posteriormente visualizado en un gel de agarosa y proporciona evidencia cualitativa de la presencia de este fragmento de DNA en la muestra. La PCR en tiempo real (o PCR cuantitativa) surgió para resolver el problema de la cuantificación de la técnica de la PCR. En la PCR en tiempo real se emplean sondas marcadas con fluorocromos. Las sondas de hidrólisis, frecuentemente empleadas en esta técnica, son oligonucleótidos que presentan fluorocromos en ambos extremos y tienen una secuencia complementaria a parte del fragmento de ADN que se quiere amplificar. Uno de los fluorocromos actúa como donador de fluorescencia en el extremo 5’ y el otro como aceptor de esta fluorescencia en el extremo 3’. La ADN polimerasa se desplaza sobre la cadena de ADN sin tetizando la cadena complementaria a partir de un fragmento de ADN que sirve de molde (cebador). Al llegar al punto en el que la sonda se ha hibridado, la hidroliza. El fluorocromo del extremo 5’ de la sonda (el donador) es liberado. El fluorocromo aceptor no puede entonces absorber la fluorescencia del donador por estar alejado de él espacialmente. Un detector realiza la medida de esta emisión de fluorescencia, que es proporcional a la cantidad de ADN presente, y la representa gráficamente. Además de proporcionar información cuantitativa, la PCR en tiempo real presenta otra serie de ventajas frente a la PCR tradicional.
El PCR en Tiempo Real utiliza termocicladores equipados con módulos diodos emisores de luz (LED’s) para detectar la fluorescencia acumulad a en la reacción al termino de cada ciclo- Los protocolos del PCR en Tiempo Real pueden diseñarse para producir resultados cualitativos y demostrar la presencia o ausencia de un fragmento de DNA o resultados cuantitativos calculando el número de copias de DNA, que al compararse con una curva estándar, establece la cantidad de microorganismos presentes en la muestra.
VENTAJAS DE PCR EN TIEMPO REAL Y PCR La ventaja fundamental de PCR en Tiempo Real es que tiene una mayor sensibilidad lo que disminuye el riesgo de falsos negativos. El hecho de que los datos sean tomados en la fase exponencial del proceso asegura que ningún componente pueda estar limitando el proceso de amplificación. También es más rápida y tiene menos probabilidad de contaminación con lo que disminuyen los falsos positivos. Son muchas las aplicaciones de esta técnica en el campo de la medicina. Cabe destacar la cuantificación viral, la cuantificación de la expresión de genes, el control de la eficacia de fármacos, la detección de agentes infecciosos, el diagnóstico de tumores y la detección de polimorfismos.
PCR convencional vs. PCR a tiempo real PCR Convencional Desventajas
Ventajas Especificidad Sencibilidad
Cuantificación difícil Tratamientos de post-PCR (geles)
PCR a tiempo real Combina amplificación por PCR y detección de fluorescencia, superando todas las desventajas de la PCR convencional. • Detección sensible y específica • Cuantificación fácil y precisa • Monitorización a tiempo real en ordenador • No tratamiento post-PCR: detección en tubo
PCR Standard
DIFERENCIAS ENTRE LAS TECNICAS PCR tiempo Real
Análisis de punto final Detección del electroforesis en gel
Análisis de la cinética de la reacción producto
por Detección del producto en cada ciclo de la reacción.
BIBLIOGRAFÍA http://tecnologiasparalavida.com/rtpcr.html http://www.unizar.es/lagenbio/docencia/doctorado/fundamentosPCR.pdf http://jornades.uab.cat/workshopmrama/sites/jornades.uab.cat.workshopmr ama/files/Eppendorf.pdf
