PREGUNTAS PROPUESTAS SEMINARIO PCR 1. Aspectos Aspectos a tener tener en cuenta cuenta a la hora hora de de diseñar diseñar los los primers. primers. ❏
Complementariedad: Los Los ceba cebado dore ress debe deben n ser ser tota totalm lmen ente te comp comple leme ment ntar ario ioss al DN DNA A mold molde e para para aseg asegur urar ar una una buen buena a PCR PCR (esp (espec ecia ialm lmen ente te el extr extrem emo o 3'). 3'). Debi Debido do,, entr entre e otra otrass caus causas as,, a la alta alta conc concen enttraci ración ón de ceba cebado dore ress en la reac reacci ción ón o a la baja baja temp tempe eratu ratura ra de hibri ibrida daci ción ón,, los los cebadores también pueden hibridar con secuencias que no son complementarias comp comple leta tame ment nte e a ello ellos, s, lo que que prod produc uce e el efec efecto to cont contra rari rio o a lo ante anteri rior or:: baja baja espe especi cifi fici cida dad dy rendimiento. Además, también ién pueden aparec recer híbridos entre los propios ios cebadores (ce (cebado badore ress dire direct ctos os e inve invers rsos os con con secue ecuenc ncia iass com comple plement mentar aria iass) o dars darse e una hom homolog ología ía intra-primer (más de 3 bases que se complementen dentro del cebador) debido a la pres presen enci cia a de secu secuen enci cias as pali palind ndró rómi mica cass o repe repeti tici cion ones es inve invers rsas as que que ocas ocasio ione ne la liga ligaci ción ón del del propio cebador. ❏ Secuencia: Los cebado cebadores res deben deben presen presentar tar en las las últi últim mas 5 base ases, en el extre xtremo mo 3', 3', al menos enos 2 bases G o C (‘abrazadera’ o ‘grapa’ GC), que permiten que el cebador esté más fuertemente unido y sea más probable que la amplificació ción comien ience correcta ctamente. Además, el extremo 3’ debe estar libre de estructuras secundarias, repetitivas, pali palind ndró rómi mica cass y alta altame ment nte e dege degene nera rada das. s. Por Por otro otro lado lado,, es reco recome mend ndab able le evit evitar ar olig oligos os con con repeticiones de dinucleótidos o poliX (lo (los poliA o poliT liT promueven una unión más débil pudi pudién éndo dose se sepa separa rarr el comp comple lejo jo ceba cebado dorr-mo mold lde e en esa esa zona zona,m ,mie ient ntra rass que que por por otro otro lado lado los los poliG o poliC dan lugar a una unión más fuerte promoviéndose así la hibridación inespecífica) ❏ Longitud: El tamaño de cebador ideal es de 15-3 15-30 0 nucl nucleó eóti tido dos. s. Ceba Cebado dore ress más más cort cortos os dan dan lug lugar a PCRs más inespecífica icas y cebadores más largos disminuyen el rendimiento de la reacción, La long longit itud ud y la secu secuen enci cia a del del prim primer er dete determ rmin inan an la temp temper erat atur ura a de hibr hibrid idac ació ión, n, la cual cual a su vez depende de la temperatura de fusión o Tm. tempe eratu ratura ra de fusió usión n del del ceba cebado dorr (Tm) (Tm) es un pará parám metro etro que que ❏ Contenido en G+C y Tm: La temp nos nos indi indica ca la esta estabi bilid lidad ad del del dúpl dúplex ex form formad ado o entr entre e el ceba cebado dorr y la secu secuen encia cia compl complem emen enta tari ria a a éste en el DNA. Así, primers con temperaturas de fusión en el rango de 52-58ºC gene genera ralm lmen ente te está están n asoc asocia iado doss a una una mayo mayorr espe especi cifi fici cida dad, d, mien mientr tras as que que los los ceba cebado dore ress con con temp temper erat atur uras as de fusi fusión ón supe superi rior ores es a 65 °C tien tienen en tend tenden enci cia a a la hibr hibrid idac ació ión n secu secund ndar aria ia,, es deci decir, r, se mant mantie iene nen n unid unidos os a secu secuen enci cias as que que no guar guarda dan n tant tanta a homo homolo logí gía a con con ello elloss como como la secuencia de interés, puesto que es necesario imponer más temperatura para que se disocien. Por otro lado, el contenido de GC de la secuencia da una indicación justa de la Tm y el cebador. A mayor porcentaje de GC, mayor será la temperatura Tm, puesto que hay un mayor número de puentes de hidrógen geno que proporcionan estabili ilidad a los dúplex. Los ceba cebado dore ress para para PCR PCR y secu secuen enci ciac ació ión n debe deben n tene tenerr un cont conten enid ido o de GC entr entre e 40 y 60%, 60%, con con el 3' del cebador termina inado en C o G para promover la unión, como ya se comentó. Los pares de cebadores deben tener Tm similares con una diferencia máxima de 5°C. 2. ¿De ¿De qué qué etap etapas as con consta sta un cicl ciclo o de PCR? PCR? Expli xpliqu que e qué qué fac factore toress se debe deben n tene tenerr en cuen cuenta ta en cada una de ellas y por qué.
Un ciclo de PCR tiene lugar en 3 etapas que se repiten en cada ciclo: ❏
Desnaturalización del del DNA molde olde de doble oble cade cadena na.. Para Para que los los prim primer erss pued pueda an unirs nirse e, es nece necesa sari rio o que que el tem templat plate e sea de cade cadena na senc sencil illa la.. Por Por lo cual cual,, será será nece necessario ario efectu ectuar ar una una
desnaturalización, que se realiza mediante una incubación breve del tubo de reacción a una temperatura de 94 ºC durante 30-60 segundos. Temperaturas más bajas pueden dar lugar a desnaturalizaciones incompletas mientras que temperaturas más altas y durante más tiempo pueden resultar en una pérdida de la actividad enzimática. ❏
Hibridación de los cebadores a la zona 3’ específica de cada una de las hebras (50-65ºC, 45 segundos). Este paso se realiza a la temperatura de alineamiento, que varía según las características de los primers utilizados, permitiendo de esta manera que el cebador encuentre su región complementaria y se una a ella.
❏
Elongación del cebador por la DNA polimerasa. Es el último paso de un ciclo de reacción de PCR y normalmente se realiza a 72ºC, temperatura óptima de la DNA polimerasa. En este paso, la polimerasa extiende la cadena complementaria del template, cuyo punto de inicio sería el complejo formado por el cebador y el template. El tiempo de incubación dependerá del tamaño del segmento que se desea amplificar.
3. Explica el fundamento y nombra los componentes de una reacción de PCR.
La reacción en cadena de la polimerasa o PCR (P olymerase C hain Reaction) es una técnica de biología molecular cuyo objetivo es obtener copias de fragmentos de DNA a partir de una concentración mínima del mismo, actuando estos fragmentos iniciales como molde. Esto se lleva a cabo mediante la utilización de oligonucleótidos que presentan un extremo 3’ libre, complementario a la cadena de DNA molde que queremos amplificar. Estos oligos funcionan, por tanto, como punto de inicio para la adición de nucleótidos y para copiar la cadena molde. Una vez que el oligonucleótido se une a su diana, la DNA polimerasa puede seguir extendiendo la cadena complementaria. En una reacción típica de PCR se usan dos de estas moléculas, que flanquean la región de DNA que se desea amplificar siendo el tamaño normal delimitado de 100 a 1000 bp. Estos oligonucleótidos serían los denominados “primers” o cebadores.
El resultado de la aplicación de numerosos ciclos "en cadena" da lugar a la amplificación exponencial del segmento de DNA delimitado por los primers. Para saber la cantidad de DNA obtenido (N) se aplica la siguiente fórmula: N = N0* 2n donde N0 se refiere a la cantidad de DNA inicial y n al número de ciclos de PCR. Los componentes necesarios para llevar a cabo una reacción de PCR son:
4. ¿Qué características se deben tener en cuenta a la hora de elegir una polimerasa? Ponga un ejemplo de polimerasa.
La enzima DNA polimerasa es la encargada de catalizar la adición de los nuevos nucleótidos a la cadena en formación a partir del cebador y usando para ello el molde de DNA. Existen diversas variantes de esta enzima, cada una de ellas con una serie de particularidades que permiten su funcionamiento en distintas condiciones, así como la posibilidad de obtener distintos tipos de productos de PCR. Por tanto el uso de una polimerasa u otra quedará determinado por ciertas características, tales como: ❏ ❏ ❏ ❏ ❏ ❏ ❏ ❏
Termoestabilidad Procesividad, que hace referencia a la velocidad de la enzima. Ratio de elongación, que se refiere al tiempo que la enzima está unida al molde y los pb que amplifica Actividad transferasa terminal, adición de adenina al extremo 3’ una vez terminada la síntesis, generando extremos cohesivos Fidelidad, capacidad de síntesis sin cometer errores Capacidad de corrección de errores 3’-5’ exonucleasa Actividad 5’-3’ exonucleasa Actividad nickasa, realizar un corte en una de las hebras
Ejemplo: (cada uno el que quiera) 5. Explique brevemente cada uno de los tipos de PCR estudiados e indique las aplicaciones de cada una de ellas. Aqui ya resumís un poco lo que cada uno vea, que vaya que quitemos cosas y sean importantes y Rogelio las quiera.
●
PCR múltiple: La PCR múltiple es una variante de la PCR en la que se amplifican
simultáneamente varias secuencias. Se añaden dos o más pares de cebadores en una única mezcla de PCR junto a los reactivos de la reacción en cantidades suficientes. Nos permite obtener información de varios locus en la misma reacción. Sin embargo, se requiere optimizar el diseño del cebador de forma que todos puedan trabajar a la misma temperatura. También debemos ser capaces de diferenciar cada uno de los productos, ya sea por tamaño o por fluorescencia (usando cebadores marcados con distintos colores). Además, es crucial que su especificidad sea alta para que no se produzcan amplificaciones no deseadas. Las secuencias amplificadas pueden provenir del mismo DNA molde (por ejemplo, un genómico) o de moldes diferentes. ●
Nested PCR o PCR anidada: Es una variante de la PCR convencional que comprende dos
rondas de amplificación con distintos pares de iniciadores o primers en cada una, con el fin de incrementar la sensibilidad de detección. Primero se realiza una reacción con los primers externos para amplificar una región de DNA más extensa, que contiene el segmento diana. Después, con el producto de esta amplificación, se ejecuta una segunda PCR con los iniciadores internos para amplificar la región específica. De esta manera evitamos que se amplifiquen fragmentos de manera inespecífica debido a una homología
con
los
cebadores.
Es
muy
improbable que cualquiera de los productos de PCR no deseados contenga sitios de unión también para los nuevos cebadores, asegurando que el producto de la segunda PCR tenga poca contaminación a partir de productos indeseados de dímeros de cebador, horquillas y secuencias alternativas de cebador.
Cobra gran importancia, además, cuando la secuencia que queremos amplificar se encuentra en una parte del DNA donde hay una estructura secundaria a la que los cebadores no se pueden unir bien. Usaremos primers más lejanos que contengan esta secuencia, la aislaremos y en una PCR posterior usaremos primers que ya sí puedan amplificar la secuencia deseada.
●
PCR reverso transcriptasa: Se usa principalmente para amplificar RNA monocatenario, sobre
todo mRNA, a través de la síntesis de cDNA por medio de una transcriptasa inversa (RT). Después, el cDNA obtenido se amplifica mediante una PCR normal. Antes de comenzar a realizar la técnica es necesario extraer el RNA y purificarlo. Normalmente se añade DNasa I para eliminar el DNA que pueda quedar (que pueden dar
“falsos positivos”), pero antes de que comience la reverso transcripción debe ser eliminada, pues puede degradar las copias de DNA. En cuanto a los cebadores, se pueden añadir: - Oligos-dT: Tramos de 12-18 desoxitimidinas que se unen a las colas poli (A) de los mRNAs eucarióticos. No son adecuados para RNAs degradados ni para RNAs sin cola poli(A). - Hexámeros aleatorios: Pueden hibridar con cualquier RNA que se encuentre en la muestra y debido a su inespecificidad, dan lugar a cDNAs más cortos. - Cebadores específicos de genes: Se unen a secuencias específicas de RNA y, por lo tanto, se necesitan tantos como RNAs diferentes haya en la muestra. En el primer paso de este tipo de PCR, los cebadores se añaden a la muestra de RNA a una temperatura de 65ºC durante 5 minutos y posteriormente se congela durante 1 minuto para asegurar que el RNA es monocatenario y que el cebador se ha unido correctamente, ya que las muestras
con
RNA
son
difíciles
de
trabajar. Después actúa la reverso transcriptasa, formando un hídrido de RNA y cDNA monocatenario.
Dependiendo
de
la
enzima se necesita una temperatura determinada. Sin embargo, una vez obtenemos las copias de DNA (ya bicatenarias gracias al dominio dependiente de ADN de la RT) para amplificar con polimerasas la temperatura se sube lo que, además de permitir la desnaturalización de las hebras, provoca la inhibición de la reverso transcriptasa. (No creo que sea necesario explicarlo todo, pero no me fio)
En general, la RT-PCR se utiliza para el diagnóstico de virus RNA, así como para el desarrollo de terapia antimicrobiana, para el estudio de la expresión génica in vitro y para la elaboración de bibliotecas de cDNA. Además, si el cDNA sintetizado (y posteriormente amplificado) proviene de un mRNA maduro, sin intrones, la copia de DNA tampoco contiene intrones. Este hecho es muy útil porque las células procariotas no tienen la maquinaria necesaria para llevar a cabo la maduración del mRNA, puesto que no tienen intrones, así que el cDNA se puede introducir en células procariotas sin ningún problema y poder estudiar su expresión en ellas. ●
Real-Time PCR:
Se trata de una técnica analítica de gran valor. Permite cuantificar la cantidad de DNA o RNA presente en una muestra combinando amplificación y detección en un único paso. Este tipo de PCR cuenta con diversas aplicaciones, como el análisis de la expresión génica, el genotipado, análisis de SNP, detección de patógenos, estudios para validar dianas de fármacos, y cuantificación de RNAs de interferencia. Cuando se utiliza para cuantificar RNAs, es necesario combinar esta técnica de qPCR (o Real-Time PCR) con la reverso transcripción. En este tipo de PCR la medición de la cantidad de DNA se mide en la fase exponencial, donde se calcula la denominada ‘línea umbral’ (‘threshold’), es decir, el nivel de detección en el cual la reacción alcanza su máximo sobre el valor de fondo. El ciclo de reacción en el que se alcanza este valor es el ‘Cycle Threshold’ (Ct). El proceso se puede automatizar fácilmente usando un sistema que realice la amplificación (termociclador) y que a su vez sea capaz de leer fluorescencia. Al calcular los resultados de un ensayo de cuantificación, pueden utilizarse métodos de cuantificación absoluta y cuantificación relativa. La absoluta consiste en la cuantificación de una molécula de concentración desconocida en una muestra interpolando este valor por medio de una curva estándar. La cuantificación relativa, sin embargo, compara el valor Ct de nuestra muestra con otra muestra del mismo origen que la de estudio pero en una situación de referencia (por ejemplo, una muestra de células tratadas con un fármaco frente a células control que no han sido tratadas). ●
PCR como herramienta para mutagénesis:
La PCR es una herramienta que nos permite realizar la mutagénesis dirigida, en la cual podemos introducir mutaciones puntuales, inserciones o deleciones en unas bases concretas (como su nombre indica, de manera dirigida). Puede ser muy útil, por ejemplo, a la hora de hacer clonajes para eliminar o añadir aminoácidos o para añadir cortes de enzimas de restricción. El diseño del primer depende del tipo de mutación deseada. Se puede realizar mediante una PCR tradicional utilizando primers mutados o haciendo una técnica de mutagénesis dirigida con una extensión del primer. En otras situaciones también puede interesarnos producir errores al azar, y esto también nos lo permite la PCR, pero utilizando unas condiciones especiales (mutagénesis propensa a errores). a) Mutagénesis dirigida mediante modificación de los primers: Consiste en utilizar primers que incluyan la modificación que queramos añadir. Hay que tener en cuenta que deben tener unos 25 nucleótidos que sean complementarios al molde.
b) Mutagénesis por extensión del primer: Utilizamos 4 primers para hacer 2 PCR distintas en las que obtengamos productos complementarios en una parte de la secuencia, de forma que al hibridar, sus extremos 3’ puedan servir de “primer”.
c)
Mutagénesis propensa a errores: Es otra técnica con la cual podemos insertar mutaciones al azar en una secuencia de DNA bajo condiciones que reducen la fidelidad de la Taq polimerasa. La PCR propensa a error suele contener mayores concentraciones de MgCl2 (7mM) para estabilizar las bases no complementarias. También se puede añadir MnCl2 para aumentar la tasa de error y distintas concentraciones de dNTPs, o incluir análogos de nucleótidos como 8-oxo-dGTP.
