Pendahuluan Sulit untuk menjelaskan secara luas dampak dari PCR. PCR, metode cepat dan dan muda mudah h untu untuk k meng mengen ener eras asik ikan an copy copy frag fragme men n DNA DNA yang yang tida tidak k terb terbat atas as jumlahnya, adalah salah satu ilmiah. PCR yang baru saja ditemukan dapat mengubah kehidupan ilmu science secara nyata. Dari praktekpraktek seharihari tentang tentang diagnos diagnosis is medis medis hingga hingga teori, teori, PCR mampu mampu menganal menganalisis isis sejumlah sejumlah kecil kecil materi genetic, bahkan materi genetic yang rusak menjadi suatu le!el yang lebih detail"teliti dan suatu realita. PCR adalah teknologi ilmiah yang paling penting yang ada setela setelah h sekia sekian n ratus ratus tahun tahun lamany lamanya a dan ilmu ilmu scien science ce telah telah menga mengaku kuii nya karena PCR jauh lebih simple dan lebih murah dari teknikteknik sebelumnya yang pernah ada dalam menduplikasikan DNA, PCR telah mendemotrasikan panelitian genetic, digunakan semua ahli biologi dan tentunya di bidang biologi molekuler. #akta ilmiah mengatkan bah$a PCR sangat berguna karena materi genetic tinggal disetiap sekuenssekuens sekuenssekuens baik pada tumbuhan maupun pada he$an, bakteri atau !irus dalam bangunan nukleotidanya%umumnya DNA atau RNA& yang memang unik dan spesi'k spesi'k di setiap setiap indi!idu indi!idu yang berbeda. berbeda. (arias (ariasii unik ini membuatnya membuatnya dapat kembali ke materi genetic asalnya, mengidenti'kasi dengan presisi paling tidak dari mana organisme spesies ini datang dan bagian partikuler dari spesies tersebut. Dalam melakukan )n!estigasi bagaimanapun juga dengan mempelajari DNA yang ada semua bias untuk dianalisis. PCR mengeploitasi fungsi alami yang dapat dikenali dari en*im yang dikenal dengan polymerase. +n*imen*im ini berada di semua makhluk hidup dan tugas mereka adalah mengkopy materi genetic dan juga pror proread, ead, serta serta mengkor mengkoreksi eksi copycopy copycopy.. -adangk -adangkadan adang g dikenal dikenal juga fotocopy fotocopy molek molekule uler, r, PCR dapat dapat mengen mengenal al kara karakte kterr atau atau karak karakter teris istik tik,, mengan menganali alisis sis dan mensintesis DNA"RNA spesi'k. PCR berkerja atau melakukan mitures yang sangat sulit sulit,, menca mencari ri tahu, tahu, mengi mengiden denti' ti'ka kasik sikan, an, dan mendu mendupli plika kasik sikan an materi materi geneti genetic c particular dari darah rambut atau jaringan specimen dari mikroba,he$an,tumbuhan mikroba,he$an,tumbuhan,, beberapa dari mereka ribuan atau jutaan tahun lamanya. Polymerase Chain Reaction %PCR Reaction %PCR juga bias diartikan sebagai suatu metode untu untuk k memp memper erba bany nyak ak suat suatu u poto potong ngan an sek sekuens uens seca secara ra in !itr !itro o. Pros Proses es PCR PCR ditemu ditemuka kan n oleh oleh -ary -ary /ullis /ullis pada pada Ap April ril 0123 0123 yang yang saat saat itu bekerj bekerja a pada pada Cetus Cetus Corpor Corporati ation. on. Deskri Deskripsi psi menge mengenai nai pros prosedu edurr pemeri pemeriksa ksaan an dari dari metod metode e ini untuk untuk pertama kali di publikasikan pada tahun 0124 dan /ullis memperoleh penghargaan Nobel pada tahun 0113 untuk karyanya ini. Saat pertama kali diperkenalkan, en*im yang dipakai adalah -leno$. Suatu en*im polymerase dari E. coli. en*im coli. en*im ini aktif pada suhu 35 oC, tetapi segera dirusak pada pada suhu suhu tingg tinggi. i. Ditemu Ditemuka kanny nnya a en*im en*im polyme polymeras rase e yang yang berasa berasall dari dari Thermus Aquaticus, Aquaticus, yang tidak mudah rusak pada suhu tinggi serta alat otomatis yang dapat
menaikkan suhu %Thermocycler & , membuat metode PCR ini menjadi mudah dikerjakan. Sejak saat itu, PCR telah menjadi metode pemeriksaan dasar dan penting untuk laboratorium riset dan analitik. Dasardasar PCR telah dimanfaatkan secara luas dan telah pula diaplikasikan untuk berbagai macam spesialistik seperti karakterisasi gen, kloning dan ekspresinya dan juga diagnostik DNA dimana PCR dimanfaatkan untuk deteksi organisme patogen, mengidenti'kasi mutasimutasi yang bertanggung ja$ab terhadap berbagai penyakit keturunan. Selain itu DNA fngerprinting telah dimanfaatkan untuk keperluan dunia kedokteran dan kedokteran forensik.
Polymerase Chain Reaction %PCR& merupakan suatu metode sintesis en*imatis sekuens DNA spesi'k menggunakan dua buah primer oligonukleotida target yang menghibridisasi rantai yang berla$anan dari sisi DNA in vitro. Reaksi ini terdiri atas tiga tahap yang merupakan suatu siklus berulang. PCR dimulai dengan tahap denaturasi rantai ganda DNA target dengan pemanasan sehingga terbentuk DNA rantai tunggal, kemudian annealing yaitu penempelan primer pada daerah yang sesuai dan dilanjutkan dengan sintesis DNA komplementer baru oleh en*im polymerase sehingga terbentuk kembali DNA rantai ganda. Pada setiap siklus kedua rantai cetakan akan menghasilkan dua molekul baru, dan terus berganda sehingga jumlah yang didapatkan akan bertambah secara deret ukur %6 n, n 7 jumlah siklus&. Reaksi ini memerlukan bahan DNA yang berperan sebagai cetakan DNA atau DNA target, sepasang primer oligonukleotida sintetik, en*im DNA polimerase dengan bufer reaksi yang sesuai, campuran deoksinukleotidatrifosfat %dN8Ps& yang diperlukan untuk pembentukan rantai DNA, dan suatu alat pemanas yang dapat diatur kenaikan temperaturnya. 9asil akhir PCR adalah rantai ganda dengan ukuran yang diketahui. Reaksi tiga tahap berlangsung di dalam suatu alat yang dapat secara otomatis mengubahubah suhu sesuai program PCR yang disebut Thermal Cycler atau mesin PCR. Tahap 1 : panas mendenaturasi DNA rantai ganda dengan kehadiran primer, empat dN8P, PCRbuer dan Thermostable DNA polymerase. Suhu denaturasi 130;; oC. Tahap 2 : Penempelan primer oligonukleotida ke acuan %template& yang telah didenaturasi dengan menurunkan suhu 35<4 oC. Tahap 3 : +tention dari primer pada 56 oC dengan 8a=Polimerase %apabila menggunakan en*im yang lain maka suhunya pun akan lain&. 8ahap ke 0 sampai 3 merupakan 0 siklus PCR. Proses ini diulangi sekurang kurangnya 6; siklus. Pada siklus terakhir $aktu extention diperpanjang sampai beberapa menit untuk menyelesaikan sintesis seluruh rantai DNA.
/etode PCR saat ini banyak digunakan untuk mendeteksi berbagai sekuans DNA yang ada dalam jumlah kecil. >ila materi genetik yang akan dideteksi adalah suatu RNA, maka dapat juga dilakukan pemeriksaan PCR setelah proses pembentukan cDNA dari RNA terlebih dahulu. /etode ini dikenal dengan nama Reverse Transcriptase PCR %R8PCR&. ?ntuk !isualisasi produk tersebut masih terus dikembangkan teknik pe$arnaan. Diantaranya dengan menggunakan etidium bromida akan memperlihatkan pita DNA dengan ukuran tertentu yang diketahui dengan bantuan petanda berat molekul. Deteksi atau kon'rmasi terhadap identitas produk PCR dapat dilakukan dengan teknik Sounthern blot hybridiation, teknik ini lebih sensitif. @angkah pertama dari proses PCR adalah sangat sederhana, yaitu : membuat larutan PCR mi yang terdiri atas !"A template atau !"A sample, # set oligo primer yang cocok, 8a= DNA Polymerase, deoyribonucleoside triphospate %dN8P& dan bufer. -emudian, PCR mi ini diampli'kai berulangulang %biasanya 3; kali atau lebih sesuai kebutuhan& melalui suhu yang memungkinkan untuk denaturation$ annealing dan synthesis. Produk PCR kemudian dapat di!isualisasi dengan elektroforesis gel dan diperiksa hasil dan spesi'sitasnya.
Bahan dan cara pembuatannya >ahan yang akan digunakan adalah sebagai berikut :
DNA template/sample DNA template adalah DNA dari sample yang hendak diampli'lkasi. -andungan DNA yang optimum dari suatu sample utuk analisis PCR tergantung dari kemurnian dan tujuan dari pemeriksaan. ?ntuk analisi gen diperlukan suatu jumlah standar dari DNA yaitu 0;;4;; ng. >ila memakai primer yang dilabel, jumlah DNA yang dibutuhkan sebagai template"acuan jauh lebih sedikit.
Taq DNA polimerase dan Bufer 8a= DNA polimerase adalah en*im yang berfungsi utuk mengkatalisasi pemanjangan rantai DNA template%sample. 8a= DNA polimerase berasal dari Thermus Aquaticus yang tidak mudah rusak pada suhu tinggi.
Konsentrasi enim Rentang konsentrasi en*im ta= DNA polimerase %Perkin +lmer Cetus& yang dianjurkan adalah antar 06,4 unit %SA 7 6; units"pmol& per reaksi 0;; l. Balaupun demikian, kebutuhan en*im disesuaikan dengan target template secara indi!idual atau primers.
Apabila konsentrasi en*im terlampau tinggi, maka akan terjadi produk PCR dengan latar belakang nonspesi'k %pita nonspesi'k&, apabila terlalu rendah, akan diperoleh suatau jumlh produk PCR yang tidak memadahi.
Bufer -omponen 0; buer %stock& yang biasanya mengandung : 0;; m/ 8ris9Cl, p9 %suhu kamar& 4;; m/ -Cl 04m/ /gCl6 ;,;0 %$"!& gelatin
Deo!ynucleotide Triphosphate "dNTP# dN8P adalah bahan dasar yang dibutuhkan untuk pemanjangan dari DNA tersebut. dN8P yang cocok untuk PCR adalah suatu campuran yang terdiri atas dA8P, dC8P, d8P, dan d88P dengan konsentrasi yang seimbang dari keempat N8P tersebut. 9al ini perlu dilakukan untuk menghindari terjadinya kesalahan"kekeliruan penempelan pada DNA template %misincorporation errors&. Penggunaan konsentrasi dN8P yang rendah dapat meningkatkan spesi'kasi dan kemurnian %fdelity & dari PCR dengan mengurangi mispriming pada non target site dan kemiripan dari nukleotida yang salah cetak pada proses pemanjangan. -onsetrasi dN8P antara 6;6;; n/ membuahkan hasil pemeriksaan dengan spesi'tas dan kemurniahn yang optimal.
Konsentrasi $a%nesium Salah satu hal yang sangat penting untuk diperhatikan adalah konsentrasi magnesium. -onsentrasi /g dapat mempengaruhi primer annealing, disosiasi ruang DNA sample. Produk PCR dan spesi'tas produk, formasi dari artefak dan akti!itas en*im serta kemurniannya. /g mempengaruhi akti!itas en*im 8a= DNA polimerase. ?ntuk mendapatkan hasil pemeriksaan yang optimal konsentrasi /g yang diperlukan adalah sekitar ;,4 m/ 4 m/.
Primers ?ntuk keperluan PCR pada umumnya, primers didesain secra tepat dan bersifat komplementer terhadap !"A template, desain dari oligonukleotida dilakukan menggunakan auan yang sederhana meskipun banyak program komputer telah banyak membantu desain primer. Secara umum primers yang digunkan untuk PCR memilki panjang sekitar 6;3; nukleotida. Primer sepanjang ini memungkinkan penggunaan suhu annealing yang tinggi.
Primers yang lebih panjang dari 3; nukleotida tidak meningkatkan spesi'tas. Primer hendaknya didesain secara seimbang dalam jumlah dari keempat basa tersebut. Dalam hal ini terutama harus diperhatikan kandungan C %E;<;&, karena semakin bnyak persentase kandungan cnya maka semakin stabil primer yang didesain. Selain itu perlu pula diperhatikan status homologinya serta kesesuaian suhu annealing dari sepasang primer tersebut. Secara umum, konsentarsi primer antara ;,0;,4 / adalah optimal. -onsentrasi primer yang tinggi dapat menyebabkan mispriming dan akumulasi dari produk yang nonspesi'k dan dapat meningkatkan kemungkinan pembentukn suatu artefak yang template&independent yaitu suatu primerdimer. Produk PCR yang nonspesi'k dan artefak primedimer pada diriya merupakan substrat untuk PCR dan berkompetisi dengan produk yang dinginkan untuk en*im, dN8P, dan primer, hal ini mengakibatkan produk PCR sedikit.
Ba%aimana P&' di%una(an )uman health and %enom pro*ect PCR secar cepat menjadi alat yang esensial untuk meningkatkan kesehatan manusia dan nya$a manusia. Peneliti medis dan obat klinis banyak mendapat keuntungan dari PCR di dua area : deteksi infeksi penyakit akibat organism, mendeteksi !ariasi dan deteksi gen ,khususnya pada gen manusia. -arena PCR dapat mengampli'kasi jumalah DNA yang tidak terbayangkan kecil ukurannya, bahkan yang hanya dari sel, ahli 'sika dan peneliti dapat memeriksa sebuah sperma atau menyelesaikan persoalan sumber elusi!e dari infeksi yang masih dipertanyakan. PCR yang berbasis analisis berkembang menjadi semakin dipercaya sebagai metode umum atau kadangkadang lebih cepat atau lebih murah. /etode ini berguna khususnya untuk mencari tahu organisme penyakit yang sulit atau bahkan tidak mungkin untuk dikultur, seperti pada kebanyakan bakteri, jamur dan !irus karena metode ini dapat menghasilkan kuantitas yang dapat dianalisis dari materi genetik organism digunakan untuk mengidenti'kasi. >erguna untuk mendeteksi !irus A)DS sesegera mungkin selama minggu pertama. Sesudah infeksi, dibandingkan tes standard +@)SA. PCR memperlihatkan DNA unik dari !irus, dikarenakan dari metode yg dikerjakan oleh tes standard, yg memperlihatkan e!idensi secara tak langsung bah$a !irus yg ada sekarang, mencari antibody yg dibuat tubuh untuk mela$an dirinya. PCR memberikan hasil yg lebih akurat dari tes standard. Fang terlihat dari perbedaan keakuratannya, seperti contohnya dalam infeksi kuping tengah yang dikenal dengan otitis media. 8eknik ini dapat mendeteksi bah$a DNA bakteri yang ada dicairan kuping tengah member sinyal berupa infeksi aktif, lalu metode kultur gagal untuk mendeteksi hal ini. Penyakit @yme berupa peradangan sendi yang menyakitkan yang disebabkan oleh bakteri yang ditramisikan menuju "menjadi giigitan per detik, yang biasanya berupa diagnose dasar dari motif gejala. 8api PCR
dapat menghilangkan dari penyakit DNA organisme yang terkandung dalam cairan sendi , dengan menghasilkan pengobatan yang cepat dan yang dapat mencegah komplikasi serius.PCR adalah tes yang paling spesi'k dan sensiti!e untuk helicobacter pylori, jadi organisme penyebab penyakit sekarang diketahui dapat menyebabkan ulkus dilambung. 8ak seperti pada tes sebelumnya, PCR dapat mendeteksi 3 organisme transmisi penyebab penyakit kelamin dalam satu proses%herpes,papiloma !irus,clamydia& dan dapat menghilangkan rantai partikel dari papiloma !irus yang berpotensi untuk menjadi kanker, dimana tes lain belum dapat melakukannya %hanya PCR yang bisa& 8erdapat lebih dari <; PCR protocol untuk identi'kasi pathogen yg telah dijelaskan dalam peta dan sekurang G kurangnya 0; produk klinik telah berguna untuk deteksi organisme yg menyebabkan penyakit 8>C, A)DS, clamydia, dll . karena PCR dapat dengan mudah menghilangkan !ariasi kecil diantara DNA yg sebagian dan unik. /etode ini juga memimpin menuju ke model baru dari tes. Diagnose tes ini tak hanya orang dengan kelainan yang tak diturunkan tetapi juga orang yg memba$a !ariasi yang dapat dihapus, diketahui sebagai mutasi. Proses ini juga berupa solusi dari kejanggalan diantara mutasi yg berbeda dalam sel tunggal, yang dapat menyebabkan kelainan berupa duschenne distro' otot. Cara ini membantu dokter untuk memberikan diagnose. PCR bahkan dapat mendiagnosa penyakit yang telah lalu. 9ubert 9 9umprey menjalani tes untuk kanker pencernaan %tahun 01<5&. Sedangkan hasil tes menghasilkan hasil negati!e, namun dia mati karena penyakit ini. 8ahun 011E penelitain digabungkan 015< sampel jaringan dari jaringan kankernya dan dengan sampel urinnya sebanyak 01<5. Dengan bantuan ampli'kasi PCR dari jumlah kecil dari DNA urin yang berumur 65 urin yang berumur 65 tahun, ditemukan mutasi identik di gen p43. >anyak dari tes genetik baru berasal dari 9uman enome Project, yang adalah usaha besar untuk identi'kasi dan mempelajari semua gen manusia. Sekuensi DNA mengungkapkan !ariasi dalam nukleotida yang gen utama. Perubahan mutasi ini menghasilkan penyakit dan bahkan kematian dengan memaksa gen untuk prosuksi protein abnormal atau terkadang bukan protein sama sekali. Sekuens DNA terdiri dari isolasi dan duplikasi segamen DNA untuk analisis nukleotida. Dengan demikian PCR adalah alat essensial untuk 9uman enome Project karena PCR dapat dengan cepat dan mudah untuk menghasilkan jumlah tak terbatas dari potongan G potongan DNA. PCR membantu dalam menemukan seseorang yang hilang dari kelompoknya. Dari penelitian 2 tahun di Horida ditemukan indikasi bah$a orang G orang yang tinggal disana ada perbedaan gentik dari orang Amerika asli
Arkeolog dengan PCR dapat menemukan tentang kebudayaan manusia dan kehidupan biologi manusia. /enganalisis pigmen dari batu berumur E;;; tahun, dilakukan di 8eas. /ereka menemukan salah satu komponen untuk membuat DNA, yang kemungkinan dari bison. 9e$an G he$an itu tidak tinggal dekat Pecos Ri!er $aktu itu. PCR dapat berguna mengkopi DNA yang berusia ribuan tahun atau jutaan tahun.
+ystem modern, pembela*aran e(olo%i, perila(u he-an 8etapi DNA tak dibutuhkan dahulu untuk menyediakan informasi tentang hubungan e!olusi. Dengan system PCR dapat mengukur perbedaan dalam sekuens DNA diantara sepisies secara langsung dan jika mereka memilih sekuen itu telah diubah sedikit selama e!olusi, antara kelas mayor dari organisme. -ecepatan dan kelangsungan dari proses ini berarti ilmu$an dapat dengan mudah membandingkan sejumlah atau beratus ratus dari indi!idu dalam menempatkan kesimpulan mereka kesebuah 'rmer basis. Dengan PCR ilmu$an dapat memperoleh informasi genetic dari jejak, feses, dll yang susah dipahami. Selain itu juga membantu mengklasi'kasikan informasi. Seseorang dapat diidenti'kasi untuk memperkirakan besarnya populasi dilokasi tertentu atau membedakan ukuran geogra' seekor he$an tunggal dalam kelompoknya. 8ehnik itu dapat adaptasikan untuk pembelajaran sama dari tanaman, untuk analisis pola penyebaran dan keberhasilan produksi dari tanaman tertentu. PCR memiliki harga rendah dan merupakan suatu portable teknologi.
$asa depan P&' 8eknologi sekarang dalam melakukan PCR, yang mana berhubungan dengan ukuran o!en micro$a!e dan menghabiskan dana ribuan dolar terlihat menjadi sebuah impro!isasi radikal yang lebih jauh. Dengan berjualan !ariable seperti reagen kimia dan P9, peneliti telah mereportasikan kesuksesan mengkopi DNA besar dan bahkan lebih besar lagi potongan DNA, termasuk seluruh genom 9)(. 9ard$are miniaturasi yang ekstra ordiner juga menjadi salah satu faktornya, seperti eksperimenter s=uee*e PCR menjadi suatu alat %de!ice& dengan ukuran seperti chip. PCR digunakan untuk materi genetic penemuan yang dimedia cetak tulis tentang mempermudah pengkopian materi, tak mahal dan mudah diakses. Pada prinsipnya PCR dapat memproduksi materi genetic organism dalam kuantitas essensial yang tidak terbatas sehingga dapat digunakan untuk menganalisis sel G sel yang mengandung material. /eskipun mereka adalah germs, tumbuhan medis langka atau manusia, atau malah justru dapat mengetahui apapun yang terekam dalam DNA mereka. Dengan organisme simpel, untuk mengetahui DNA mereka akan mengetahui hampir apapun tentang mereka. Dengan yang lebih rumit seperti manusia, DNA hanya sebagian cerita saja tapi merupakan bagian yang sangat
besar. >erterima kasih atas PCR, kita dapat mempelajari genetic baik yang lampau maupun genetic yang baru untuk tahun G tahun kedepan.