Pcr Informe

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS – BIOLOGIA MOLECULAR

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

2017 INFORME DE BIOLOGIA MOLECULAR

Profesora: GIOVANNA ELIZABETH SOTIL CAYCHO

Integrantes: Andrea Soledad Aragon Torres Karen Quispe Ore Piero Fabio Guardales Martel Sebastian Vivanco flores


I.

INTRODUCCION

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica empleada en la biología molecular con el fin de obtener múltiples copias de una región específica de ADN o molde in vitro (en un tubo de ensayo en lugar de un organismo). Esta técnica se fundamenta en la propiedad que tiene las DNA polimerasas para replicar las hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre si tras cada fase de replicación y a continuación, dejar que las polimerasas vuelvan a unirse a los segmentos de ADN para que vuelvan a duplicarlas. En un principio la técnica era lenta ya que las polimerasas constantemente se desnaturalizaban en cada cambio de temperatura (95°C) y había que agregar nuevas polimerasas sin embargo se realizaron más investigaciones investigacio nes en las que se obtuvieron ADN polimerasas termoestables extraídas de organismos que toleran estas temperaturas. La ADN polimerasa que normalmente se utiliza en la PCR se llama Taq polimerasa, por la bacteria tolerante al calor de la que se aisló (Thermus aquaticus). T. aquaticus vive en aguas termales y fuentes hidrotermales. Su ADN polimerasa es muy termoestable y su mayor actividad se presenta cerca de los (temperatura a la que la ADN polimerasa de ser humano o de E. coli no funcionaría). La Taq polimerasa es ideal para la PCR gracias a esta estabilidad térmica. Como veremos, la PCR utiliza altas temperaturas repetidamente para desnaturalizar el molde de ADN o separar sus cadenas. Mediante el uso de la PCR, una secuencia de ADN se puede amplificar millones o miles de millones de veces y producirá suficientes copias de ADN para que se analicen mediante otras técnicas. Por ejemplo, el ADN se puede visualizar visualizar por electroforesis en gel, enviar a secuenciar o digerir con enzimas de restricción y clonar en un plásmido. La PCR es una técnica cotidiana y normalmente indispensable en laboratorios de investigación médica y biológica para una variedad de aplicaciones dentro de las que encontramos la clonación de ADN para su secuenciación, la filogenia basada en ADN, el análisis funcional de genes, el diagnostico de trastornos hereditarios, hereditarios, la identificación identificación de huellas genéticas (usada en técnicas forenses y pruebas de paternidad), la detección y el diagnóstico de enfermedades infecciosas.


II.

PRODECIMIENTO

Preparación del master mix Se limpió el área de trabajo con alcohol, se realizó el trabajo en frio (se mantuvieron los tubos sobre hielo). Se seleccionaron las muestras de ADN molde animal y vegetal a amplificar y se rotularon ambos tubos. De acuerdo a los volúmenes de reacción y al kit de PCR a utilizar se realizaron los cálculos para determinar el volumen del master mix a preparar para el número de muestras +1 (sin considerar el volumen de ADN), y la concentración final de reacción. (tabla n°1). Se preparó el master mix en un microtubo de 0.6 ml rotulado. Se retiró y se alicuoteo la cantidad necesaria por reacción en cada tubo de PCR de 0.2 ml. Se mezcló en un vortex y se centrifugo por segundos, en modo touch. Tabla n° 1. Master mix Componentes Buffer 10 x Primer F Primer R dNTPs H2O DNA pol Template Total

CCI

CCF

Vol

Vol MTX

10 X 10 uM 10 uM 10 uM

1X 0.1 uM 0.1 uM 200 uM

1.5 1.5 0.15 0.3 11.4 0.5 1 15

6 6 0.6 1.2 45.6 2 60

Amplificación de ADN Se colocaron los tubos de PCR en un termociclador, se ajustó la temperatura de hibridación. Se terminó de realizar el PCR luego de dos horas aproximadamente.


III.

RESULTADO:

Análisis: El PCR obtenido en clase casi no se logra visualizar, excepto por pequeños fragmentos en la base. Debido a que el ADN recorre el gel de acuerdo con su peso molecular, la pequeña porción que se visualiza debe ser de ADN fragmentado o de Primers. El PCR que realizó la profesora nos revelo que el ADN proveniente de una muestra Animal, se encuentra en un muy buen estado. Esto es consistente con la buena concentración de ADN hecho con NANODROP. Se visualiza gran cantidad de ADN replicado consistente con el control positivo. Nuestra muestra vegetal sin embargo mostro dos barras al correr la electroforesis, es probable que esta muestra haya estado contaminada o que las moléculas de ADN hayan formado puentes de hidrogeno que que alteraron su conformación natural. Esto está acorde con la poca concentración de y pureza del ADN de la muestra vegetal cuantificada con NANODROP. La primera extracción y electroforesis que hicimos también nos resultó con una baja cantidad de ADN vegetal obtenido. Tuvimos en nuestro animal, una gran cantidad de ADN, sin embargo no todo estaba completo, estaba fragmentado y por lo tanto se veía un franja de corrida a lo largo del gel. Aunque nuestra muestra de ADN vegetal estaba contaminada, los resultados indican que al menos una buena porción del ADN extraído de muestra animal estaba en un suficiente buen estado como para que se pueda duplicar. Por lo tanto, lo más probable es que haya sido un error de manipulación en clase al momento de preparar el MasterMix y en mezclarlo con nuestras muestras de ADN. Se observo que, en relación con los otros grupos, en nuestra muestra había


más sobrenadante, es posible que los insumos de la MasterMix hayan estado en un volumen erróneo, y que, por esto, no se haya logrado duplicar suficiente de ADN.

IV. CUESTIONARIO 1. ¿Qué es la temperatura de extensión extensión y de que factores factores depende?

La temperatura de extensión 72°C es la cual se produce la síntesis de una cadena sencilla (produciéndose un fragmento de doble cadena por la complementariedad) en la dirección de 5’  3’ mediante la enzima DNA polimerasa . Esta temperatura de extensión depende de los nucleótidos conformados en la cadena al ser elongada, siendo guanina citosina las que requieren mayor T° por lo tanto necesitaremos la temperatura indicada para que las hebras no se cierren y esta esté totalmente elongada y no posea “nudos” en la hebra, asÍ la ADN polimerasa podrá hacer su trabajo. tr abajo. El tiempo de extensión depende de la longitud y concentración de la secuencia blanco y de la temperatura. La extensión del primer se realiza tradicionalmente tradicionalment e a 72ºC. Las estimaciones para la tasa de incorporación de nucleótidos a 2ºC varia de 35 a 100 nucleótidos por segundo dependiendo del buffer, pH, concentración de sales y la naturaleza del templado. Un tiempo de extensión de un minuto es considerado suficiente para productos de hasta 2 kb de longitud. Sin embargo, tiempos mayores de extensión pueden ser útiles cuando la concentración del sustrato es muy pequeña o cuando la concentración del producto excede la concentración de la enzima. (Cortazar Martinez, Adriana, “MÉTODOS FÍSICOFÍSICO-QUÍMICOS EN BIOTECNOLOGÍA.”) BIOTECNOLOGÍA.”) 2. ¿Cuáles de los primers de la lista son degenerados? degenerados? ¿Por qué? ¿Presentarían ¿Presentarían alguna ventaja?

Los primers degenerados son 18sdna 18sdn a shrimp 143 F y 18sdna shrimp 143 R en los cuales presenta, en su secuencia, un nucleótido degenerado “N” el cual nos dara 4 secuencias pueden ser adenina, citosina o guanina y timina. Porque en la secuencia observamos una “N” en lugar de cualquier nucleótido, esto nos indica que nuestra secuencia esta degenerada. Los primers pueden contener extensiones en el extremo 5’

o “mismatches” “mismatc hes”

para

incorporar sitios de enzimas de restricción, un codón de inicio ATG, o secuencias promotoras en la secuencia blanco. Pueden ser usados primers degenerados para extraer genes nuevos en base a su similitud o su secuencia de aminoácidos. aminoácidos. La ventaja que nos da los primers degenerados es que son primers que tienen un número de opciones en varias posiciones en la secuencia para permitir el alineamiento y la amplificación de una variedad de secuencias relacionadas. (Cortazar Martinez, FÍSICO-QUÍMICOS EN BIOTECNOLOGÍA.”) Adriana, “MÉTODOS “MÉTODOS FÍSICO-QUÍMICOS BIOTECNOLOGÍA.”)

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