Guia de Treinamento NAT HIV-HCV

Divisão de Atendimento ao Cliente e Pós - Marketing DIACM

Março de 2012

Índice Princípio do Ensaio .................................................................................................................... 1 Introdução a Biologia.................................................................................................................. 3 ÁCIDOS NUCLÉICOS................................................................................................................ 3 ESTRUTURA DA MOLÉCULA DE DNA .................................................................................... 6 ESTRUTURA DA MOLÉCULA DE RNA .................................................................................... 8 Código do DNA .......................................................................................................................... 9 DA SEQUENCIA DE DNA À SÍNTESE PROTÉICA ................................................................... 9 Duplicação / Replicação ........................................................................................................... 11 Transcrição .............................................................................................................................. 12 Síntese de Proteínas – Tradução ............................................................................................. 13 HIV – HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS ......................................................................... 15 ESTRUTURA VIRAL E GENÔMICA ........................................................................................ 15 REPLICAÇÃO DO HIV ............................................................................................................. 16 CARGA VIRAL ......................................................................................................................... 19 DINÂMICA DO HIV NO ORGANISMO INFECTADO ............................................................... 19 HCV – HEPATIT VIRUS C ....................................................................................................... 20 Estrutura Viral e Genômica do Vírus ........................................................................................ 20 REPLICAÇÂO DO HCV ........................................................................................................... 22 TRANSMISSÃO ....................................................................................................................... 23 CARGA VIRAL ......................................................................................................................... 24 Princípio da técnica .................................................................................................................. 25 Reação de polimerase em cadeia ............................................................................................ 25 Cinética da reação ................................................................................................................... 26 Etapas da reação de PCR ........................................................................................................ 27 Condições da PCR ................................................................................................................... 28 PCR em Tempo Real ............................................................................................................... 29 PCR Multiplex .......................................................................................................................... 29 RT-PCR.................................................................................................................................... 29 PCR em Tempo Real no NAT HIV / HCV de Bio-Manguinhos ................................................. 31 Biossegurança ......................................................................................................................... 32 Componentes e Apresentação do Kit ....................................................................................... 33 Formato do Kit .......................................................................................................................... 33 Componentes e Apresentação do Kit........................................................................................33 Relação dos componentes fornecidos com o produto:............................................................. 33 Relação dos materiais necessários não fornecidos ................................................................. 34 Indicação das condições adequadas de armazenamento e transporte ................................... 34 Material de reposição ............................................................................................................... 34 Precauções, cuidados especiais e esclarecimentos sobre os riscos decorrentes do manuseio do produto e seu descarte .................................................................................................... 35 Influências pré-analíticas, tais como, anticoagulantes e temperatura ...................................... 36 Cuidados com as amostras biológicas ..................................................................................... 36 Plataforma NAT Nacional ......................................................................................................... 37 Fluxo Metodológico .................................................................................................................. 38 Esquema do Teste ................................................................................................................... 38 NAT – Teste de Ácido Nucléicos .............................................................................................. 39 A) Preparo do Pooling .............................................................................................................. 40 Etapas e Equipamentos: .......................................................................................................... 40 Procedimento ........................................................................................................................... 41 Utilização do Janus .................................................................................................................. 41 Inicialização do robô (Initialize): ............................................................................................... 42 Elaborado pela DIACM Aprovado por Linda Khalili Boukai

ii Revisão: 29/03/2012

Remoção de bolhas e lavagem do sistema (FlushSysLiq) ....................................................... 42 Procedimento Pool de seis amostras ....................................................................................... 45 Rotinas utilizando somente amostras em Single ...................................................................... 55 B) EXTRAÇÃO ......................................................................................................................... 56 PROCEDIMENTOS.................................................................................................................. 56 Utilização do MDx: ................................................................................................................... 56 2.1. Instruções gerais – Sistema de reposição e descarte de líquido: ..................................... 60 - Preparo da Mesa de Trabalho e Carrossel do Equipamento ................................................. 62 Carregamento das amostras na mesa de trabalho .................................................................. 72 2.4 Verificação de coágulos ..................................................................................................... 73 C) Protocolo de Reação de PCR - JANUS............................................................................... 79 D) Amplificação e Detecção ..................................................................................................... 86 Amplificação ............................................................................................................................. 86 Detecção .................................................................................................................................. 86 4. Procedimento para Amplificação e Detecção – Real Time 7500 ......................................... 87 E) Processamento de dados e Resultados .............................................................................. 90 E.1 Geração do laudo de resultados no Software de Bio-Manguinhos .................................... 92 E.2 Interpretação dos Resultados ............................................................................................ 95 E.2.1: Interpretação do Laudo .................................................................................................. 95 E.2.2 Interpretação das curvas de amplificação no ABI 7500 .................................................. 97 A. Controle interno e amostras não detectáveis ....................................................................... 98 B.Controles Negativos e positivos ............................................................................................ 99 C. Perfis dentro do padrão esperado ..................................................................................... 101 Perfis fora do padrão esperado .............................................................................................. 102 Armazenamento do Kit ........................................................................................................... 105 Condições de Transporte ....................................................................................................... 105 Conservação e Estocagem .................................................................................................... 105 Instruções de uso do Tag........................................................................................................106 EQUIPAMENTO MDx ............................................................................................................ 107 PROCEDIMENTOS DE MANUTENÇÕES ............................................................................. 107 “Liquid containers cleaning” – Limpeza dos recipientes de líquidos ...................................... 110 MANUTENÇÕES DIÁRIAS .................................................................................................... 110 Tip-Disposal Station Cleaning Maintenace - Limpeza da estação Tip-Disposal..................... 110 Worktable cleaning Maintenance – Limpeza da mesa de trabalho ........................................ 110 Bar Code Reader Windows Cleaning Maintenence – Limpeza da janela do leitor de códigos de barra ................................................................................................................................... 111 High-Dispensing System and Liquid Detectors Maintenance - Manutenção do Sistema de detector de líquido e sistema dispensador de alta velocidade ............................................ 111 MANUTENÇÕES SEMANAIS ................................................................................................ 111 Reagent Carousel Cleaning Maintenance – Limpeza o carrossel de reagentes .................... 114 MANUTENÇÕES MENSAIS .................................................................................................. 114 System Liquid Container Cleaning Maintenance – Limpeza do recipiente de líquido do sistema ............................................................................................................................................ 114 Worktable Cleaning Maintenance – Limpeza da mesa de trabalho ....................................... 115 Robotic Handling System Cleaning Maintenance – Limpeza do “Lab Hand” ......................... 115 Biannual Maintenance Procedure – Manutenção semestral .................................................. 115 MANUTENÇÕES SEMESTRAIS ........................................................................................... 115 EQUIPAMENTO ABI 7500 ..................................................................................................... 116 Calibração do ABI 7500 ......................................................................................................... 116 A) Calibração ROI: ................................................................................................................. 116 B) Calibração Background ..................................................................................................... 117 C) Calibração Óptica .............................................................................................................. 117 D) Calibração do Dye ............................................................................................................. 118 Elaborado pela DIACM Aprovado por Linda Khalili Boukai

iii Revisão: 29/03/2012

E) Calibração do DYE 3 ......................................................................................................... 119 BACKUP DOS EQUIPAMENTOS .......................................................................................... 121 BACKUP JANUS: ................................................................................................................... 121 BACKUP MDx: ....................................................................................................................... 122 BACKUP ABI 7500: ................................................................................................................ 122 ENVIO DE ARQUIVOS PARA A DIACM................................................................................ 123 Problema na consolidação no Janus :.................................................................................... 123 Problemas no MDx: ................................................................................................................ 123 MENSAGENS DE ERROS DOS EQUIPAMENTOS: ............................................................. 125 Mensagens de Erros no Janus: .............................................................................................. 125 ERRO: Liquid Handling Error ................................................................................................. 125 ERRO: System liquid empty ................................................................................................... 126 ERRO : Dilutor Module Error .................................................................................................. 126 ERRO 2: Liquid Handling Error .............................................................................................. 127 Cuidados básicos para a prevenção de ERROS no Janus: ................................................... 128 Códigos de ERROS BioRobot MDx : ..................................................................................... 129 Cuidados básicos para a prevenção de ERROS no MDx: ..................................................... 130 Mensagem de erro do ABI 7500 : .......................................................................................... 131 Cuidados básicos para a prevenção de ERROS no ABI 7500: .............................................. 131 Descontaminação .................................................................................................................. 132 Ambiente ................................................................................................................................ 132 Janus...................................................................................................................................... 132 MDx ........................................................................................................................................ 132 ABI ......................................................................................................................................... 133 Cuidados adicionais para os hemocentros no uso da plataforma NAT .................................. 133 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................................... 140

Elaborado pela DIACM Aprovado por Linda Khalili Boukai

iv Revisão: 29/03/2012

Siglas AIDS – Síndrome da Imunodeficiência Adquirida cDNA – DNA complementar DNA – ácido desoxiribonucléico EPC – Equipamento de proteção coletiva EPI – Equipamento de proteção individual FRET – “Fluorescence Resonance Energy Transfer” HCV – Vírus da Hepatite C HIV – Vírus da imunudeficiência humana IL – interleucina mRNA – RNA mensageiro NAT – Teste de ácidos nucléicos ORF – Open Reading Frame PCR – Reação de Polimerase em Cadeia RNA – ácido ribonucléico rRNA – RNA ribossômico TNF α- fator de neurose tumoral tRNA – RNA transportador


v Revisão: 29/03/2012

Princípio do Ensaio A Plataforma NAT Multiplex HIV/HCV emprega técnicas de Biologia Molecular para a detecção, em tempo real, dos produtos de amplificação gerados numa reação de PCR (Reação da Polimerase em Cadeia). O diagnóstico laboratorial, nesta tecnologia, é usado para a pesquisa de ácidos nucléicos específicos baseada na amplificação e detecção simultânea de sequências de RNA de HIV (Vírus da Imunodeficiência Humana) e HCV (Vírus da Hepatite C). O processo de detecção é realizado através da captação de fluorescência emitida pela amplificação do produto, com maior especificidade, devido à utilização de sondas específicas marcadas com fluoróforos para o fragmento alvo na reação. Esse ensaio consiste na extração automatizada de ácidos nucléicos de um conjunto de seis amostras biológicas, chamado “pool”, juntamente com uma partícula calibradora biossegura, ocorrendo à purificação do material genético que é amplificado enquanto reage com sondas marcadas (TaqMan® chemistry). Estes marcadores utilizam a atividade nuclease 5' da enzima polimerase. O sistema de sondas possui fluoróforos específicos (Reporter) e uma molécula dissipadora de energia (Quencher) (Fig.1). A transferência de energia ocorre em virtude do fenômeno FRET - “Fluorescence Resonance Energy Transfer”. A reação acontece quando há degradação da sonda, pois o aumento da distância entre o reporter e a molécula do quencher causa a emissão de fluorescência, que pode ser detectada pela leitura do comprimento de ondas específicas para cada tipo de fluoróforo liberado. O monitoramento do progresso da PCR à medida que ela ocorre, em ¨tempo real¨, é possibilitado por meio da leitura das intensidades da fluorescência a cada ciclo, uma vez que as intensidades são proporcionais ao número de amplicons gerados. Utiliza-se o fluoróforo VIC para HIV, FAM para HCV e DYE 3 para a partícula calibradora. Abaixo o esquema da reação de amplificação em tempo real e as sondas utilizadas (Fig. 1).


1 Revisão: 29/03/2012

Fig 1. Processo de liberação do Reporter após a atividade 5´ 3´ nuclease da enzima DNA polimerase.


2 Revisão: 29/03/2012

Introdução a Biologia Molecular ÁCIDOS NUCLÉICOS Os ácidos nucléicos são macromoléculas de extrema importância biológica em todos os organismos vivos. As células recebem instruções sobre que proteínas sintetizarem e em que quantidades, a partir dos ácidos nucléicos, que são moléculas que estocam e transmitem a informação genética na célula. Essas moléculas constituem os genes, localizados nos cromossomos das células (Fig. 2). Essa informação é transmitida através do código genético, cuja tradução resulta na síntese protéica.

Fig. 2: Cada cromossomo é formado por uma única molécula de dupla hélice de DNA condensada com proteínas (histonas). Esse complexo de DNA mais proteínas é chamado de cromatina. Em uma célula eucariótica, quase todo o DNA está compactado na cromatina. O DNA é "empacotado” na cromatina para diminuir o tamanho da sua molécula, e para diminuir o tamanho da sua molécula, e para permitir maior controle por parte da célula de tais genes.

Os ácidos nucléicos são polímeros lineares de nucleotídeos, unidos por ligações fosfodiéster. Polímeros lineares são moléculas muito longas compostas por um grande número de subunidades pequenas que se repetem chamadas de monômeros. Existem dois tipos de ácidos nucléicos: ácido desoxirribonucléico (DNA) e ácido ribonucléico (RNA). O açúcar que compõe ambos os ácidos nucléicos é uma pentose, a única diferença está na presença de um oxigênio ligado ao carbono 2’ da cadeia, o DNA é composto de uma desoxirribose e o RNA de uma ribose (Fig. 3). Elaborado pela DIACM Aprovado por Linda Khalili Boukai

3 Revisão: 29/03/2012

A .

B Desoxirribose Ribose

Base

Fosfato

O

Base

Fosfato

O

H

OH

OH

OH

Fig. 3. A: Representação de um nucleotídeo mostrando o açúcar, o grupo fosfato e a base nitrogenada. B: Moléculas representativas dos açucares Ribose e Desoxirribose que compõem o RNA e o DNA respectivamente. Notar que essas duas moléculas diferem entre si somente pelo fato da ribose possuir um átomo de oxigênio a mais em relação à desoxirribose. . :

As bases adenina (A), guanina (G), e citosina (C), são encontradas em ambos os ácidos nucléicos, enquanto que a timina (T), só é encontrada no DNA e a uracila (U), só no RNA. Essas bases nitrogenadas são classificadas em dois tipos: purinas e pirimidinas. As purinas (adenina, guanina e uracila) possuem dois anéis unidos e as pirimidinas (timina e citosina - DNA) possuem um único anel heterocíclico (Fig. 4). H

NH2

N

N H

N H

N

H

N

H H2N

Adenina (A)

H

N

N H

O H

H

O

Pirimidina

N H

N

Guanina (G)

NH2

H

N

N H

N

HN

H

Purina

H

N

N

H

O

HN N H

Citosina (C)

H

O

N H

H

Uracil (U)

Fig. 4. Estrutura das bases nitrogenadas que compõem a molécula de DNA e RNA.


4 Revisão: 29/03/2012

Cada nucleotídeo (monômero) é composto de um grupamento fosfato, um açúcar (pentose), uma base nitrogenada (purinas e pirimidinas) e ácido fosfórico (Fig. 3A). Esses nucleotídeos são interligados por “pontes” ou ligações do tipo fosfodiéster. Essas ligações unem o carbono 3’ da pentose do nucleotídeo adjacente. O esqueleto de um ácido nucléico é composto por fosfatos e pentoses que se alternam. As bases nitrogenadas estão ligadas aos açúcares desse esqueleto. Uma sequência de nucleotídeos possui uma orientação química de extrema importância. Em uma fita de DNA ou RNA, numa das extremidades há um grupo fosfato ligado ao carbono 5’ do açúcar (extremidade 5’) e na outra há uma hidroxila ligada ao carbono 3’ do açúcar (extremidade 3’). Convencionou-se escrever e ler a sequência nucleotídica da esquerda para a direita, no sentido 5’  3’ (Fig. 5). A cadeia polipeptídica possui individualidade, determinada pela seqüência de suas bases, conhecida como estrutura primária. É nessa estrutura primária que a informação genética está contida. O gene corresponde a uma sequência particular de DNA codificadora de uma informação (proteína ou RNA).

Ligação Fosfodiéster

Fig. 5: Esquema ilustrativo do segmento de uma cadeia de DNA e RNA mostrando os nucleotídeos (A= adenina, C = citosina, G = guanina, T = timina, U = uracila) interligados por uma ligação fosfodiéster.


5 Revisão: 29/03/2012

ESTRUTURA DA MOLÉCULA DE DNA O DNA está presente nos organismos vivos na forma de moléculas lineares de peso molecular extremamente elevado, contendo informações necessárias para manter a hereditariedade das células. Em 1953, James Watson e Francis Crick propuseram um modelo de estrutura tridimensional do DNA, baseado principalmente, nos estudos de difração de raios X de Rosalind Franklin e Maurice Wilkins e em estudos químicos da molécula. Este modelo mostrou que o DNA é uma dupla-hélice, no qual essas duas fitas se enrolam em torno do eixo da hélice (Fig. 6). As desoxirriboses ficam externas em relação às bases nitrogenadas como se fossem os corrimões de uma escada circular, expostas ao meio aquoso (Fig. 5). As ligações fosfodiéster, nas duas fitas, estão em direções opostas – uma em direção 5’  3’ e a outra 3’  5’ – sendo, portanto, antiparalelas (Fig. 6). Os anéis aromáticos das bases nitrogenadas são hidrofóbicos e ficam orientados para o interior, quase perpendiculares ao eixo da hélice. As bases estão pareadas entre as duas fitas da molécula, mantendo a sua estrutura.

Fig. 6: Desenho ilustrativo da estrutura em dupla hélice da molécula de DNA proposta por Watson e Crick.


6 Revisão: 29/03/2012

As duas cadeias polinucleotídicas mantêm-se unidas através de ligações de hidrogênio, que se estabelecem entre pares de bases específicas: adenina com timina e citosina com guanina. Desde que exista uma distância fixa entre as duas moléculas de açúcar nas fitas opostas, somente certos pares de bases podem se encaixar na estrutura. Os únicos pares possíveis são AT e CG. É importante salientar que o par AT é unido por duas pontes de hidrogênio e o par CG, por três pontes de hidrogênio, isso faz com que o par CG seja mais estável que o AT (Fig. 7).

Duas ligações de hidrogênio entre Adenina e Timina

Três ligações de hidrogênio entre Guanina e Citosina

Fig. 7: Esquema ilustrativo mostrando os dois pares de bases do DNA. As bases complementares são adenina e timina (A -T) e citosina e guanina (C - G). Observe que entre A - T existem duas ligações de hidrogênio, e entre C - G são três ligações de hidrogênio.

A sequência de bases dispostas ao longo de uma cadeia de polinucleotídeo pode variar consideravelmente, porém na outra cadeia a sequência será sempre complementar (Fig. 6). Assim, as duas cadeias de polinucleotídeos que constituem um segmento de DNA são ditas complementares entre si. Já que a estrutura de dupla hélice do DNA é preservada por ligações intermoleculares fracas (ex.Ligação de hidrogênio), é possível separá-las através de métodos que envolvem, por exemplo, aquecimento ou pH alcalino. A temperatura necessária para romper os pares GC é maior do que a necessária para romper o par AT, uma vez que este é ligado por duas ligações de hidrogênio. A temperatura na qual ocorre à separação das cadeias de DNA (ponto de desnaturação) depende da razão AT/GC. Se o DNA após a desnaturação for vagarosamente resfriado, as cadeias complementares pareiam-se de forma ordenada, restabelecendo assim a conformação original de dupla hélice (renaturação).


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ESTRUTURA DA MOLÉCULA DE RNA A estrutura primária do RNA é semelhante à do DNA, sendo composta também por nucleotídeos (Fig. 3A). A primeira diferença, entretanto, é que o açúcar presente é a ribose em vez da desoxirribose, vindo daí o seu nome, ácido ribonucléico. Como visto anteriormente, a molécula de ribose difere da molécula de desoxirribose por apresentar um grupo OH ligado ao carbono 2’ em vez de um átomo de hidrogênio (Fig. 3B). Outra diferença é que a base timina do DNA é substituída no RNA pela base uracila (U). Enquanto o DNA é formado pela dupla hélice, o RNA é encontrado principalmente como uma cadeia simples de nucleotídeos, embora a molécula de RNA possa dobrar-se e formar cadeia dupla entre bases complementares. Existem três principais classes de RNA: RNA mensageiro (mRNA), o RNA transportador (tRNA) e o RNA ribossômico (rRNA). Todos estão envolvidos na síntese protéica e cada um consiste de uma fita única de ribonucleotídeos e possuem um peso molecular, uma sequência nucleotídica e funções biológicas características. O RNA mensageiro (mRNA) possui as informações para a síntese do RNA. Ele possui as trincas de bases nitrogenadas que definem os aminoácidos. O mRNA funciona como um arquivo de computador, no qual um programa pode ser fielmente copiado. Vale ressaltar, que o mRNA não é fabricado como uma cópia exata do DNA, mas sim como uma molécula complementar que respeita as mesmas regras de ligação entre as bases nitrogenadas, somente a base timina (T) do DNA é substituída pela base uracila (U) no RNA. A esse evento, se dá o nome de transcrição (discutida em maiores detalhes a diante). Já o RNA transportador (tRNA) tem a função de identificar e transportar os aminoácidos até os ribossomos e o RNA ribossômico (rRNA) liga-se às proteínas para compor os ribossomos, que são organelas do citoplasma, onde acontece a síntese das proteínas. Apesar da molécula de RNA possuir uma única cadeia de polinucleotídeo, o RNA não é uma estrutura linear simples e lisa. As moléculas de RNA possuem extensas regiões de complementação nas quais as pontes de hidrogênio entre os pares de bases AU e GC são formadas unindo diferentes porções da mesma molécula. Como resultado disso, a molécula dobra-se sobre si mesma, formando estruturas denominadas alças (Fig. 8).


8 Revisão: 29/03/2012

Fig. 8: Esquema ilustrativo da molécula de RNA dobrando-se e formando alças.

DA SEQUENCIA DE DNA À SÍNTESE PROTÉICA Código do DNA Como a molécula de DNA carrega a informação correta da sequência de aminoácidos que compõem milhares de proteínas na célula? Comparando-se a molécula de DNA com a cadeia polipeptídica, ambas são formadas por cadeias lineares, sem ramificações. Portanto, o código do DNA deve ser linear, de acordo com a sequência de nucleotídeos na molécula. Além disso, cada posição na molécula de DNA pode ser ocupada por um dos quatro nucleotídeos, enquanto na proteína qualquer um dos 20 aminoácidos pode aparecer em determinado ponto. É obvio, portanto, que o código não pode ser um simples nucleotídeo controlando a posição de um aminoácido, pois, nesse caso, teríamos somente quatro possibilidades. Mesmo dois nucleotídeos não seriam suficientes para definir a posição dos 20 aminoácidos na cadeia polipeptídica, pois o número de códigos possíveis seria somente 16. Se, por outro lado, cada três letras do DNA definir um dos aminoácidos, teremos 64 possibilidades, mais do que suficiente para designar os 20 aminoácidos diferentes. Em 1966, com o código do DNA ou código genético completamente decifrado, foi demonstrado que: 1. todos os aminoácidos das proteínas são codificados por uma combinação de três bases do DNA, formando um tríplex chamado códon; 2. um mesmo aminoácido pode ser definido por mais de um códon e, por isso, o código é dito degenerado; 3. existem três códons que, em vez de determinar a entrada de um aminoácido específico na


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cadeia polipeptídica, funcionam como o fim de um programa, determinando a interrupção da cadeia que esta sendo sintetizada (Fig. 9).

Fig. 9: Código genético. Cada conjunto com três bases (códon) determina a entrada de um aminoácido específico ou marca o fim da síntese na cadeia polipeptídica (códons em cinza com a denominação STOP em vermelho). O códon AUG (marcado em laranja) representa a iniciação de uma cadeia de aminoácidos, em eucariotos.

O dogma central da biologia molecular foi sugerido em 1957 por Crick. Essa teoria estabelece que o fluxo da informação genética na célula é unidirecional, sendo que o DNA é transcrito em RNA, o qual é então traduzido em proteína. Entretanto, dois outros eventos constituem exceção a essa regra. Primeiro, por ocasião da divisão celular, o DNA é copiado em outras moléculas de DNA, em um processo conhecido como duplicação do DNA. Segundo, alguns vírus, que possuem como material genético o RNA em vez do DNA (como o caso do HIV), têm sua molécula de RNA copiada e revertida em DNA em um processo chamado de transcrição reversa (Fig. 10). Duplicação

DNA

Transcrição reversa

Transcrição

mRNA

Tradução

Proteína

Fig. 10: Dogma central: estabelece que o fluxo da informação genética na célula é unidirecional. A duplicação do DNA e a transcrição reversa constituem exceções a essa regra.


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Duplicação / Replicação Toda célula ao se dividir, tem seu conteúdo de DNA duplicado na íntegra, transmitindo assim, todas as características genéticas, esse processo é chamado de replicação. Ela ocorre de maneira semiconservativa, porque quando as duas fitas originais são separadas, cada uma vai servir de molde para a construção de uma fita nova. A fita cópia é sintetizada pela ação catalisadora da DNA polimerase III, enzima que utiliza como molde à cadeia precursora e incorpora os nucleotídeos de forma sequencial na nova cadeia, produzindo-a de acordo com a lei de pareamento das bases (Fig. 11). Como essa polimerase sintetiza DNA na direção 5’  3’, a síntese de uma das cadeias complementares é realizada de forma contínua enquanto que a outra é sintetizada descontinuamente. Os fragmentos da cadeia descontínua são ligados pela enzima DNA ligase. Muitas outras proteínas estão envolvidas na estabilização e manutenção da integridade das cadeias simples que são precursoras para a síntese da fita dupla, assim como no reconhecimento dos sítios de iniciação. As DNA polimerases possuem além da função de sintetizar polinucleotídeos, atividade exonucleásica chamada de “correção de leitura” na qual os nucleotídeos incorporados incorretamente são removidos. Esta propriedade é fundamental para a manutenção da integridade da sequência original. Muito da complexidade inerente à replicação de DNA advém do fato de que as duas cadeias da dupla hélice se orientam em direções opostas ( 5’ 3’ e 3’ 5’) e suas cópias devem, igualmente, apresentar direções opostas. Ainda, há o alongamento de todas as cadeias cópias individuais que ocorre na direção 5’ 3’. Esse aparente paradoxo foi esclarecido com a descoberta de que uma fita cópia é construída de forma descontínua, a partir de porções menores que se alongam, individualmente em direção oposta. Essa construção necessita de duas enzimas – a DNA polimerase I para preencher as lacunas e a DNA ligase para juntar os fragmentos.


11 Revisão: 29/03/2012

Fig. 11: Esquemas ilustrativos da replicação de DNA.

Transcrição Apenas uma das fitas do DNA é transcrita dando origem a uma única sequência de mRNA para cada gene (Fig. 12). A indicação de qual fita deve ser transcrita é orientado por uma sequência específica chamada promotor, localizada antes da sequência a ser transcrita, que é reconhecida pela RNA polimerase (enzima sintetizadora de mRNA). Como a RNA polimerase adiciona sequencialmente monofosfatos de ribonucleosídeo à extremidade 3’ da cadeia de RNA em crescimento, a polimerização ocorre na direção 5’  3’ (Fig. 11 e 13). Isso significa que cada molécula de mRNA será idêntica à sequência nucleotídica da fita de DNA que não é transcrita. O mRNA transcrito é transportado para os ribossomos (rRNA) no citoplasma, onde ocorre a síntese protéica. No caso do retrovírus (como o HIV), a informação genética segue o sentido inverso – de RNA para DNA – esse processo é conhecido por transcrição reversa e ocorre devido à presença de uma enzima – a transcriptase reversa.


12 Revisão: 29/03/2012

Fig. 12: Esquema ilustrativo da transcrição do DNA, ou seja, formação do mRNA a partir de uma fita de DNA. Cada sequência de três bases nitrogenadas representam 1 códon. .

Nos organismos superiores, incluindo o homem, uma região do DNA com a mensagem para a síntese de uma cadeia polipeptídica é, geralmente, interrompido por certas porções que não têm função codificante e, portanto, não aparecem representadas na proteína. Tais porções são referidas como íntrons, enquanto as regiões que carregam a informação codificada para a síntese de proteínas são os éxons. Quando um arquivo é ativado, o RNA copia fielmente tanto os íntrons como os éxons; entretanto, antes de o RNA deixar o núcleo, as porções correspondentes aos íntrons são removidas, em um evento chamado de processamento do RNA ou splicing. Dessa forma, no RNA mensageiro, aquele que efetivamente carrega a mensagem para o citoplasma, está presente somente as porções que correspondem aos éxons (Fig. 13).

Fig. 13: Esquema ilustrativo do processo de transcrição do DNA. As partes em cinza mostram as porções referidas como íntrons que são retiradas após o “splicing” através da enzima RNA polimerase.


13 Revisão: 29/03/2012

Síntese de Proteínas – Tradução A síntese proteica não é resultante da leitura direta da sequência nucleotídica do DNA. Como o DNA está localizado no cromossomo (Fig. 2) (no núcleo da célula) e a síntese protéica ocorre quase que na sua íntegra, nos ribossomos localizados no citoplasma, as informações genéticas contidas na sequência nucleotídica do DNA tem que ser transferida para uma molécula intermediária que pode mover-se para o citoplasma, o RNA mensageiro (Fig. 12). O processo de decodificação, pelo qual a informação genética presente na molécula de mRNA dirige a síntese protéica, é chamada tradução. Esse processo envolve os três RNAs – mensageiro, ribossômico e transportador. Na tradução, o ribossomo liga-se primeiro a um sítio específico na molécula de mRNA (códon de iniciação - ATG - Fig. 9) que ajusta a fase de leitura. O ribossomo então se movimenta ao longo da molécula de mRNA, traduzindo um códon de cada vez usando os tRNA para adicionar aminoácidos ao final da cadeia polipeptídica em alongamento. A tradução é finalizada quando o ribossomo reconhece na fita de mRNA a presença do códon de terminação (Fig. 14). A direção da leitura é de 5’  3’, sendo que a sequência de nucleotídeos da fita de DNA corresponde à sequência de aminoácidos da proteína traduzida na direção amino-terminal para carboxi-terminal.


14 Revisão: 29/03/2012

Fig. 14: Representação gráfica do processo de síntese de proteína, que ocorre no citoplasma celular.


15 Revisão: 29/03/2012

HIV – HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS ESTRUTURA VIRAL E GENÔMICA O HIV pertence à família Retroviridae, gênero dos Lentivirus. Esse vírus possui uma forma esférica, com aproximadamente 110 nm de diâmetro. A estrutura da partícula viral infectante recebe o nome de vírion. Nessa estrutura são observadas as proteínas estruturais que são codificadas pelos genes gag, env e pol. O gene gag codifica as proteínas do capsídeo viral (p24 e p17); o gene env, as glicoproteínas contidas no envelope do vírus (gp41 e gp120); e o gene pol codifica as enzimas transcriptase reversa, integrase e protease (Fig. 15).

Fig. 15.:Esquema ilustrativo do vírus HIV mostrando o RNA viral, as proteínas que compõem o envelope viral e a enzima transcriptase reversa.

O HIV apresenta genoma diplóide – duas moléculas de RNA de fita simples de polaridade positiva = de 9,8 kb covalentemente ligadas dentro de um nucleocapsídeo protéico em formato de cone, circundado por um envelope lipoprotéico onde se encontram ancoradas as glicoproteínas (Fig. 15). O genoma já foi todo sequenciado e analisado, sendo que seus genes receberam a seguinte nomenclatura: gag, pol, vif, vpr, tat, ver, vpu, env e nef. Elaborado pela DIACM Aprovado por Linda Khalili Boukai

16 Revisão: 29/03/2012

As proteínas sintetizadas a partir do gene gag compõem o núcleo (“core”) que envolve o genoma viral. O gene gag é traduzido na forma de uma proteína precursora Pr55 gag que é posteriormente clivada para compor as proteínas p17 (proteína de matriz), p24 (proteína estrutural do capsídeo), p9 (proteína do nucleocapsídeo que se liga fortemente ao RNA viral) e p7. O gene pol também é traduzido na forma de um precursor, Pr160 gag-pol e codifica para as enzimas virais: Protease (p10), transcriptase reversa Rnase-H (p51/66) e integrase (p32). O gene vif (p23), parece atuar aumentando a infectividade, mas sua função ainda não foi totalmente elucidada. A função do gene vpr (p15) codifica os ativadores da transcrição. A proteína p14, codificada pelo gene tat, atua como transativador transcricional, interagindo com fatores de transcrição celulares e a sequência TAR viral, promovendo a iniciação e elongação dos transcritos virais. O gene ver (p19), indispensável à replicação viral, age como transativador pós-transcricional, ligando-se à sequência RRE viral e fatores celulares, promovendo splicing e/ou transporte do mRNA viral. O gene vpu (p16) influencia a liberação das partículas virais e aumenta a reciclagem do antígeno CD4+. O gene env codifica a glicoproteína precursora gp160, que posteriormente é clivada para formar a gp41, transmembranar, e a gp120, glicoproteína de face externa, responsável pela ligação do vírus ao receptor celular. Por fim, o gene nef (p27) potencializa a infectividade viral, mantendo altos os níveis de infecção.

REPLICAÇÃO DO HIV O principal receptor para a entrada do HIV-1 (subcategoria do vírus HIV) na célula do hospedeiro é o linfócito TCD4+. A infecção tem inicio quando uma partícula viral, que contém duas cópias de RNA HIV, encontra uma célula com uma molécula de superfície chamada CD4. A interação do vírus com a membrana celular é feita pela ligação da gp 120 ao receptor CD4 da célula hospedeira, porém co-receptores (quimiocinas CCR5 e CXCR4 - mediadores ou regulares de processos inflamatórios com habilidade de recrutar e ativar subpopulações específicas de leucócitos) ou receptores secundários são também necessários para a entrada do vírus na célula. Quando o gene que codifica o CCR5, apresenta uma deleção mutante, o receptor celular codificado por esse gene fica estruturalmente alterado. A condição de homozigose está associada a um efeito protetor à infecção pelo HIV-1. A condição de heterozigose, apesar de não proteger o indivíduo da infecção, está associada à não progressão, ou períodos de latência clínica mais prolongados.


17 Revisão: 29/03/2012

Embora as células TCD4+ pareçam ser o principal alvo para o HIV, outras células do sistema imune com moléculas CD4 em suas superfícies também são infectadas. Entre elas estão os monócitos e macrófagos, que podem hospedar grandes quantidades de vírus sem serem mortos, desse modo, atuam como reservatórios. Após a interação da membrana do envelope viral com a membrana celular, ocorre uma alteração conformacional que expõe um peptídeo de fusão – a gp41. O capsídeo viral é então liberado no citoplasma da célula hospedeira. Por ação da transcriptase reversa do vírus, no citoplasma da célula, a fita de RNA serve de molde para a transcrição reversa de duas fitas complementares de DNA viral (cDNA). O cDNA viral (fita dupla) é transportado para o núcleo, e é incorporado ao genoma da célula hospedeira pela ação da integrase, e passa a ser denominado provírus (DNA do HIV incorporado aos genes da célula hospedeira. Em um mesmo organismo o provírus pode, em algumas células, permanecer em latência e não dar sinal de sua presença. Em outras células, o processo replicativo pode ser lento com multiplicação controlada, ou acelerado levando à lise celular). Para que o DNA proviral produza novos vírus, cópias de RNA devem ser feitas. O provírus, para se replicar, subverte a maquinaria celular e passa a comandar os mecanismos enzimáticos da célula hospedeira. Isso significa dizer que as enzimas celulares passam a trabalhar na síntese de RNAs genômicos mensageiros (RNAm) e na síntese de proteínas virais. As citocinas, proteínas envolvidas na regulação normal da resposta imune, podem também regular a transcrição. Moléculas como fatores de necrose podem também regular a transcrição. Moléculas como fatores de necrose tumoral alfa (TNF-α) e interleucinas (IL)-6, secretados em níveis elevados pelas células de pacientes HIV positivos, podem auxiliar na ativação do DNA proviral. O mRNA viral é transportado do núcleo celular para o citoplasma e começa a tradução das proteínas virais, utilizando a maquinaria celular de síntese protéica. O próximo passo é a montagem da partícula viral (proteínas e RNAs virais) e o ancoramento da partícula à membrana plasmática da célula hospedeira. Uma partícula viral imatura é formada e ao aderir à membrana celular, adquire um envelope. Ocorre o brotamento do vírus imaturo de forma intensa

provocando

a

destruição

da

célula

hospedeira.

Durante

este

ponto

do

amadurecimento é feito pela ação da protease viral que cliva as longas cadeias de proteínas e enzimas que constituem o núcleo em pedaços menores. Essa clivagem resulta em partículas virais infecciosas (Fig. 16).


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A.

B.

Figura 16: A: Imagem ilustrativa do HIV (representado pelos círculos verdes) infectando uma célula. B: Infecção pelo HIV-1 através da ligação gp120 (envelope viral) – receptores CD4 e CCR5 (célula hospedeira) (Fase 1). Citoplasma, transcrição reversa da fita de DNA complementar ao RNA viral pela transcriptase reversa (Fase 2). Núcleo, inserção do DNA pró-viral ao DNA da célula hospedeira, (integrase do HIV) (Fase 3). Ativação celular, transcrição de cópias do RNA viral (RNA polimerase humana), síntese de proteínas e glicoproteínas virais bem como cópias íntegras do RNA genômico do HIV (Fase 4). Por fim, empacotamento do RNA viral seguido de brotamento da célula hospedeira (Fase 5), dando início a disseminação da infecção de novas células.


19 Revisão: 29/03/2012

DINÂMICA DO HIV NO ORGANISMO INFECTADO Estudos indicam que cerca de 10 bilhões de vírus são produzidos por dia e que essas partículas virais tem uma meia vida de aproximadamente 4 horas. De forma semelhante, um grande número de linfócitos TCD4+ é produzido e destruído, sendo que a meia vida de um linfócito infectado é de 2,4 dias. O linfócito TCD4+ é a principal célula-alvo do HIV. Não há, portanto, período de latência virológica e, mesmo durante a infecção crônica assintomática, observa-se uma grande batalha entre o sistema imune do indivíduo infectado e o vírus. Com o passar do tempo, o vírus desestrutura a arquitetura dos órgãos linfáticos, comprometendo a reposição dos linfócitos TCD4+.

CARGA VIRAL O número de partículas virais presentes em uma determinada amostra de um indivíduo infectado é conhecido como carga viral. A carga viral plasmática, detectada na forma de RNA do HIV, reflete a dinâmica desse vírus nos indivíduos infectados, quantificando as partículas que estão sendo produzidas e lançadas na circulação sanguínea. O nível de RNA do HIV no plasma é um marcador clínico importante. O número de partículas virais é mais elevado durante a infecção primária e mais baixo na fase assintomática. Existe uma relação direta entre a quantidade de HIV detectada e a rapidez com que a infecção progride. Níveis elevados de replicação do vírus e o aumento da carga viral estão associados à deterioração acelerada do sistema imune (Fig. 17). O colapso do sistema imune, que antecede o aparecimento da AIDS, é resultado da destruição das células CD4+ e das alterações imunitárias provocadas pelo vírus.

Fig. 17: Gráfico representativo da contagem de linfócitos TCD4+ e da carga viral, ao longo da infecção pelo HIV.


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HCV – HEPATIT VIRUS C A hepatite C vem sendo estudada há vários anos, mesmo antes da descoberta do vírus causador da doença — o Vírus da Hepatite C (VHC). Nesta última década, entretanto, houve avanços significativos no entendimento de sua epidemiologia, modos de transmissão, patogênese, diagnóstico e terapêutica. Sabemos, hoje, que a hepatite C compete com a doença hepática alcoólica como a maior causa de doença crônica do fígado, podendo ser a vencedora em várias áreas geográficas. Estima-se que 3% da população mundial esteja contaminada, sendo relevante o número de pessoas que desconhece o fato de albergar o vírus. Um estudo populacional na cidade de São Paulo mostrou prevalência de 1 a 4% de anti-VHC, variando com a faixa etária. As altas porcentagens de cronicidade da doença, seu potencial evolutivo para cirrose e hepatocarcinoma, assim como o fato de ser a mais freqüente etiologia diagnosticada em casos de transplante hepático, fazem com que constitua grave problema de saúde pública.

Estrutura Viral e Genômica do Vírus O HCV é um vírus RNA da família Flaviviridae, com genoma em fita simples de polaridade positiva medindo 9,7 kilobases de comprimento e com cerca de 9400 nucleotídeos (FIg. 18). Nessa sequência, encontra-se uma longa fase de leitura aberta (ORF – “Open reading frame”) que compreende quase todo o genoma e codifica uma poliproteína de pouco mais de 3000 aminoácidos.

Fig. 18: Representação do vírus da hepatite C, que é um vírus RNA da família Flaviviridae de 50 nm de diâmetro.

Na extremidade 5’, encontram-se três a quatro pequenas ORFs, cuja real tradução em proteínas é questionada. Entretanto, esta região é mais conservada entre os diferentes vírus isolados, sugerindo que deve ter um papel regulatório muito importante durante a replicação Elaborado pela DIACM Aprovado por Linda Khalili Boukai

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viral. Esta sequência conservada, aliada ao fato de conter uma estrutura secundária que a torna mais resistente à digestão por ribonucleases (RNAses), torna esta região como a melhor para seleção de primers para a biologia molecular com fins de detecção deste vírus em amostras provenientes de diferentes regiões do mundo. Uma pequena região não traduzida na extremidade 3’ também está presente, possuindo uma cauda de poli-A característica. Esta pequena região, não traduzida, apresenta estruturas secundárias que parecem ser bem conservadas, podendo ter um significado importante durante a replicação genômica do vírus, pois é nela que ocorre a ligação da sequência complementar à enzima replicase. Porém, observou-se que, quando ocorrem variações na sequência genômica desta região, pode haver diminução da eficiência de ligação da replicase, bem como alteração na replicação viral. Tais fatos podem ser parcialmente responsáveis pelos diferentes níveis de patogenicidade do vírus da hepatite C e também pela sensibilidade ao interferon. As proteínas estruturais do HCV são três: proteína C encontrada na extremidade Nterminal e duas glicoproteínas E1 (GP 33) e E2/NS1 (GP 72), prováveis constituintes do envelope viral. A E1 é uma proteína matriz e a outra, E2/NS1, é provavelmente análoga à glicoproteína principal do envelope dos pestivírus. As proteínas não estruturas NS2, NS3, NS4 e NS5 representam a extremidade carboxiterminal do genoma viral. NS2 e NS4 são proteínas hidrofóbicas e, portanto devem estar ligadas à membrana da célula hospedeira. NS3 tem pelo menos duas funções; helicase, no desdobramento do genoma viral durante a replicação, e protease participando na clivagem de proteínas não estruturais a partir do precursor. A proteína NS5 contém pelo menos a função de RNA replicase RNA dependente, mas deve ser multifuncional. A análise filogenética das sequências genômicas permitiu a caracterização de 6 genótipos (1 a 6) que são subdivididos em grupos a, b, c, etc. Dentro de um mesmo genótipo e subtipo podemos ainda ter variações do HCV, que são denominadas quasispécies. Isso é possível devido à replicação imperfeita do vírus, com o surgimento de pequenas e constantes mutações. A maior ou menor diversidade das quasispécies parece estar relacionada com a pressão imunológica, já que costuma ser pequena nas fases iniciais da doença, com aminotransferases normais, sendo de alta heterogeneidade nos casos de doença hepática mais avançada e/ou baixa resposta terapêutica. O tempo de incubação da hepatite C mostra-se bastante variável, de 1 a 13 meses, com média de 8. Logo após a contaminação, o melhor marcador e único disponível até o presente é a determinação do RNA-HCV, já que os anticorpos surgem apenas 4 a 20 semanas após o contágio. Elaborado pela DIACM Aprovado por Linda Khalili Boukai

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REPLICAÇÂO DO HCV O vírus da hepatite C replica principalmente nos hepatócitos do fígado, onde é estimado que cada célula infectada produza diariamente cerca de cinquenta partículas virais com um total calculado de um trilhão de partículas virais geradas. O vírus também pode se replicar em células mononucleares de sangue periférico, contribuindo potencialmente para os altos níveis de distúrbios imunológicos encontrados em pacientes infectados pelo HCV cronicamente. O HCV tem uma grande variedade de genótipos e sofre mutações rapidamente devido a uma alta taxa de erro por parte do vírus "dependente de RNA-polimerase do RNA”. A entrada nas células do hospedeiro ocorre através de interações complexas entre os virions (partícula viral) e as moléculas da superfície de células. Uma vez dentro do hepatócito, o HCV assume parcelas da máquina intracelular para replicar. A dinâmica de replicação do HCV pode ser deduzida a partir das rápidas taxas de produção de vírus e emergência de mutantes. Outra característica da replicação do HCV é a geração rápida de variantes de vírus. Mesmo dentro de um paciente HCV não existe como uma entidade única, mas sim como um enxame de microvariants de predomínio de, um fenômeno que tem sido referido como quasispecies (para uma revisão ver Holanda et al., 1992). A detecção de anticorpos anti-HCV pode ser realizada inicialmente por métodos de elevada sensibilidade (100%) e especificidade (entre 99,6% a 99,84%), como o enzimaimunoensaio (ELISA) e o enzimaimunoensaio de micropartículas (MEIA), que empregam peptídeos sintéticos do VHC. Posteriormente, os resultados reagentes obtidos nos métodos de triagem devem ser confirmados por métodos de elevada especificidade, como o recombinant immunoblot assay (RIBA) ou Western Blot (WB), a detecção de RNA viral pela reação em cadeia da polimerase (PCR) qualitativa e quantitativa e a técnica do ácido desoxirribonucléico (DNA)-branched (bDNA).


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TRANSMISSÃO Demonstrou-se que o HCV é o agente causal de mais de 90% das hepatites póstransfusionais. Assim, todas as pessoas que receberam transfusão de sangue ou hemocomponentes até o início dos anos 90, com ou sem história de hepatite póstransfusional, devem ser avaliadas para provável contaminação com o vírus da hepatite C. No Brasil, a partir de 1993, há a obrigatoriedade dos testes sorológicos (anti-HCV) em candidatos a doadores de sangue. Assim, a hepatite pós-transfusional tornou-se rara, mas outros meios, parenterais ou não, continuam a disseminar a doença. Além dos produtos do sangue, agulhas/seringas contaminadas ou mesmo a inalação de drogas — com o uso de espelhos e canudos contaminados — são vias importantes. Outras formas parenterais de contaminação são os procedimentos médicos, odontológicos, acupunturistas ou tatuagens. Portanto, qualquer material cortante ou perfurante pode ser veículo transmissor do vírus de uma para outra pessoa, como o alicate da manicura, a lâmina do barbeiro ou mesmo a escova de dentes, compartilhada por cônjuges ou filhos. Em nosso meio, demonstramos que dentre os casos eventualmente rotulados como esporádicos por serem afastados transfusão de sangue ou o uso de drogas ilícitas houve uma porcentagem significativa de pacientes com cirurgias prévias e/ou atendimentos médicos de urgência em prontos-socorros ou ainda a hipótese já confirmada de contaminação médica durante o ato cirúrgico. Dentre as formas não parenterais de transmissão da hepatite C torna-se importante ressaltarmos a possibilidade da transmissão sexual. Embora pouco eficiente, deve-se examinar e alertar o parceiro sexual, particularmente nos indivíduos promíscuos, para os quais é mandatório o uso de preservativos. Aos casais monogâmicos de longa data, sem doenças sexualmente transmissíveis, é facultativo o uso continuado de preservativos, sendo possível a gravidez. A disseminação intrafamiliar também pode existir, possivelmente por compartilharem materiais cortantes ou então pela exposição de ferimentos abertos. A transmissão materno-fetal revela-se pouco significativa na hepatite C, podendo ocorrer particularmente no momento do parto. Não existe profilaxia para o recém-nascido, que terá o anti-HCV da mãe nos primeiros 6 a 12 meses de vida. Os anticorpos costumam desaparecer nesse período, podendo haver verdadeira contaminação com permanência do RNA-HCV em raros casos, principalmente quando a co-infecção HCV e HIV.


24 Revisão: 29/03/2012

CARGA VIRAL Existem vários métodos para medir a concentração do vírus no soro, que é uma avaliação indireta da carga viral. Estes métodos incluem o PCR (Polimerase Chain Reaction) quantitativo e em tempo real, que serão discutidos posteriormente. Os níveis de HCV RNA são normalmente bastante estáveis, embora possam variar de forma espontânea, 3 a 10 vezes ao longo do tempo. Esses ensaios quantitativos podem fornecer importantes dados sobre a natureza da hepatite C. A maioria dos pacientes com hepatite C crônica têm níveis de HCV RNA (carga viral) entre 100.000 (105) e 10 milhões (107) cópias / mL. Expressos em IU, estas médias são de 50.000 a 5.000.000 UI. As taxas de resposta a um curso de peginterferon e ribavirina são maiores em pacientes com baixos níveis de HCV RNA. Há várias definições de "baixo nível" do RNA do HCV, mas a definição usual é de 400.000 UI (~ 1 milhão de cópias / mL) ou menos. No início da infecção observar-se um aumento no nível da carga viral e ao redor do 70º dia após a infecção, há o início da produção de anticorpos e consequentemente uma diminuição da carga viral no paciente.

Fig. 19. Marcadores do HCV durante o início da infecção.


25 Revisão: 29/03/2012

Reação de polimerase em cadeia A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) consiste em fazer cópias do material genético in vitro usando elementos básicos do processo de replicação natural do DNA e foi desenvolvida principalmente por Mullis et al. (1985). A especificidade da técnica é dada pelo uso de iniciadores específicos para o gene ou região do DNA de interesse. A utilização de dois iniciadores delimitam o alvo e a repetição dos ciclos da PCR, dando origem a bilhões de cópias do alvo. Mullis utilizou a então recém-descrita Taq DNA polimerase termoestável isolada da bactéria de fontes termais Thermus aquaticus, origem do nome da enzima. Esta enzima se mantém estável em temperaturas de até 117ºC, com temperatura ótima de 72ºC. Porém, a realização manual dos ciclos de temperatura, banhando-se um rack de tubos em vários banhos-maria de temperaturas diferentes, ainda constituía um fator dificultante do processo. Em 1989, o DNA Thermal Cycler apareceu como o primeiro termociclador automático. Até hoje, a maioria dos termocicladores automáticos funciona com o mesmo princípio: aquecimento por resistências elétricas e refrigeração com ventoinhas e tubulações em serpentina preenchidas por etileno glicol. Aperfeiçoaram-se os sistemas de contagem de tempo, para aumentar a confiabilidade das reações. Em meados dos anos 90 surge o padrão Peltier, cujo bloco de aquecimento é composto por uma liga metálica que aquece ou resfria de acordo com o sentido da corrente elétrica aplicada e este o utilizado pelo equipamento ABI7500 da Plataforma NAT.

Princípio da técnica A técnica explora função natural da enzima Taq polimerase, esta enzima é semelhante à enzima DNA polimerase que é capaz de sintetizar DNA a partir de seus precursores no sentido 5’  3’. Para catalisarem essa síntese, os precursores de DNA devem estar presentes sob a forma de deoxirribonucleotídeos trifosfatos (dATP, dTTP, dGTP e dCTP). Esta consiste em ciclos de reações de síntese de regiões específicas do DNA (gene ou parte dele), na qual a cada ciclo o número de fragmentos é duplicado, havendo assim um crescimento exponencial do fragmento desejado. Hoje, a PCR se constitui no método diagnóstico de rotina para isolar rapidamente sequências específicas a partir de uma mistura complexa de sequências genômicas ou de DNA complentares (cDNAs), DNA gerados a partir de uma sequencia de um RNA mensageiro. Elaborado pela DIACM Aprovado por Linda Khalili Boukai

26 Revisão: 29/03/2012

Cinética da reação A PCR é realizada em três etapas, repetidas em ciclos. Cada etapa é desenvolvida a uma temperatura apropriada para sua maior eficiência, as etapas são:

a) desnaturação das cadeias do DNA ou c-DNA por aquecimento, realizada a uma temperatura próxima de 95ºC. A essa temperatura as pontes de hidrogênio existentes entre as duas fitas rompem separando-as;

Fig 20. Representação gráfica da separação das fitas do DNA durante o processo de desnaturação (95ºC), na qual ocorre o rompimento das pontes de hidrogênio.

b) anelamento (annealinng) dos iniciadores ao DNA da amostra (DNA molde ou template). Iniciadores são oligonucleotídeos com 20-24 bases usualmente seletivos o suficiente para localizar um sítio único em um genoma de alta complexidade de tamanho. Sua função é delimitar a sequência a ser amplificada através do estabelecimento de pontes de hidrogênio com a sequência alvo, respeitando a regra de pareamento descrita por Watson e Crick (Adenina – Timina; Citosina – Guanina);

Iniciador 1 Iniciador 2

Fig 21. Representação do anelamento dos pares de iniciadores complementares aos flancos da sequência alvo na faixa de 55°C a 65°C, durante a PCR.

c) extensão, na qual ocorre a incorporação dos deoxirribonucleotídeos dispersos no meio a partir dos iniciadores, em suas extremidades 3’, em temperatura ótima específica. A adição de nucleotídeos ocorre apenas se os inicadores estiverem pareados à seus sítios específicos obedecendo a propriedade de complementaridade de bases dos ácidos nucleicos. Elaborado pela DIACM Aprovado por Linda Khalili Boukai

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5 ’

3 ’ Taq DNA Polimerase 3 ’

5 ’

Fig. 22. Representação da etapa de extensão da fita no sentido 5’→3’ com incorporação de deoxinucleotídeos presentes no meio pela Taq-polimerase.

Por fim, o objetivo da repetição destes eventos de desnaturação, anelamento e extensão é duplicar a quantidade deste fragmento presente no meio a cada ciclo, acumulando este produto exponencialmente.

Etapas da reação de PCR  Fase de “screening” - ciclos iniciais. Os iniciadores se anelam na fita simples de DNA em sua região complementar. Nesta etapa, a quantidade de iniciadores é abundante em relação aos fragmentos de DNA, tronando fácil este processo.  Fase intermediária: O processo de amplificação está ocorrendo, com os iniciadores agindo de modo a permitir o acúmulo exponencial do fragmento de DNA. O pareamento do iniciador com a sequência que lhe é complementar já está bem facilitada, pois já existem várias cópias das sequências alvos.  Fase tardia ou fase de platô: A amplificação já é sub-ótima devido à limitação dos reagentes e à competição dos produtos gerados. Esta fase ocorre devido aos fatores relacionados abaixo: - Perda da atividade da enzima; - Acúmulo de produtos amplificados que tendem a parear entre si, em detrimento do pareamento com os inicadores; - Aumenta a possibilidade de amplificação de produtos inespecíficos - Gasto dos reagentes, especialmente de iniciadores e deoxirribonucleotídeos; - Acúmulo de pirofosfato, resultante das ligações fosfodiésteres; - Competição com outros produtos que vinham sendo amplificados com eficiência menor, mas também foram se acumulando.


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Condições da PCR Inibidores da PCR podem ter origem na própria amostra ou nos reagentes usados na coleta e no preparo desta. Substâncias tais como grupamentos heme presentes no sangue total, produtos da lise das células vermelhas, bilirrubina, bile e sais inibem a PCR ou podem ainda degradar o ácido nucleico de amostras biológicas como células do sangue periférico, tecido animal e fluidos corporais, incluindo, fluido cérebro-espinhal, material de biópsia, entre outros. Uréia, detergentes (SDS), acetato de sódio, heparina, fenol entre uma grande variedade de compostos orgânicos e inorgânicos podem ser inibidores da reação de PCR por interferir no funcionamento da DNA polimerase na reação. Como exemplo, podemos citar o magnésio (Mg+2), que é um cátion presente na reação de PCR que se liga à DNA polimerase, sendo um co-fator essencial para a atividade da enzima. Esta concentração precisa ser ótima, pois em falta na reação, acarretará formação de menor quantidade de produtos, e, em excesso, reduzirá a fidelidade do resultado por formação de produtos inespecíficos (aumento da taxa de erro). Por este motivo, substâncias quelantes de cátions divalentes como o EDTA podem interferir reduzindo a atividade da enzima. O tempo e a temperatura de armazenamento da amostra podem também impactar significativamente na recuperação dos ácidos nucleicos e na eficiência dos procedimentos subsequentes. Os laboratórios de biologia molecular precisam ter uma estrutura que permita um perfeito fluxograma de trabalho, com áreas dedicadas. Cada estação possui seus próprios equipamentos, as superfícies devem ser lisas e construídas de forma a facilitar a limpeza. Programas de qualidade devem incluir verificação periódica dos equipamentos, como manutenções mensais, trimestrais e ou semestrais usualmente realizadas pelas empresas parceiras. Manutenções diárias e semanais são executadas pelos operadores. Nestas manutenções estão inclusos os procedimentos de limpeza, descontaminação e algumas outras verificações, dependendo do equipamento. Finalmente, o resultado da PCR é baseado na presença ou não do produto amplificado em eletroforese em gel de agarose, ou na visualização de resultados gráficos captados em sistema óptico. Para garantir que um resultado é negativo ou não, deve-se ter a certeza de que a ausência de bandas, ou de fluorescência, é devido à ausência de DNA molde, e não à falhas na reação. Para tanto, deve-se considerar utilizar um controle interno de amplificação nas reações. Os controles nas reações de PCR são verificados a partir da amplificação de uma


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sequência que obrigatoriamente existe no material analisado, e preferencialmente em uma única cópia.

RT-PCR (Reverse Transcriptase - PCR) Em algumas situações, a fonte inicial da informação a ser amplificada é uma molécula de RNA. Neste caso é necessária a realização de uma etapa prévia à PCR que é a síntese de uma fita de cDNA (DNA complementar) tendo a molécula de RNA como molde. Em sua extração o mRNA é separado de uma solução de RNA total extraída de um tecido ou suspensão celular. A solução é catalisada pela enzima transcriptase reversa que converterá o RNA-m em cDNA. Em seguida o cDNA pode então submetido à reação de PCR à semelhança do DNA genômico. Esta técnica é chamada de RT-PCR (Reverse Transcriptase – Polimerase Chain Reaction). Sintetiza-se cDNA empregando-se a enzima transcriptase reversa de origem viral. A partir do cDNA, emprega-se o método de PCR para amplificação. A detecção do mRNA é útil no diagnóstico de infecções causadas por vírus que possuem uma fase latente. A detecção do mRNA expressa somente infecção produtiva e evidência de uma infecção viral ativa

PCR Multiplex A PCR Multiplex é uma reação onde várias regiões diferentes de DNA (ou c-DNAs) são amplificadas ao mesmo tempo. Isto é possível devido a utilização simultânea de diversos pares de iniciadores específicos para cada locus a ser identificado sem que eles possam hibridizar entre si. Se a temperatura de anelamento for semelhante e os diferentes amplicons produzidos apresentarem tamanhos distintos, é possível que o diagnóstico através de uma PCR multiplex seja realizado. A vantagem é a economia de reagentes e tempo, visto que, duas reações ou mais podem ser realizadas conjuntamente.

PCR em Tempo Real Este procedimento permite, de forma simultânea, a detecção e quantificação de um fragmento específico de DNA ou cDNA. O PCR convencional não apresenta valores quantitativos, por isso foi desenvolvido o PCR em tempo real, que é uma técnica descrita como quantitativa porque consegue quantificar o número de moléculas produzidas a cada ciclo.


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A localização da sequência alvo é feita pelos iniciadores, assim como no processo de PCR convencional, porém, dispõe ainda em sua reação, de outro oligonucleotídeo; uma sonda marcada por fluoróforo (molécula que, quando excitada por luz, emite fluorescência em comprimento de onda específico), na sonda há duas moléculas, o reporter e um quencher, na qual o primeiro possui a fluorescência, enquanto o segundo a absorve. Por questões físicas, enquanto o quencher estiver próximo ao reporter (sonda intacta) não haverá a emissão de fluorescência. Ao estender as fitas a partir dos iniciadores, a Taq polimerase degrada a sonda separando a o fluoróforo de seu abafador. Desta forma, essa molécula poderá emitir energia que será captada pelo sistema óptico do equipamento que realiza a PCR em tempo real. Assim, a cada ciclo, ocorre a detecção do aumento do produto da PCR em tempo real, a partir do aumento da fluorescência emitida, decorrente da degradação da ligação do fluoróforo da sonda ligada ao fragmento de DNA que está sendo amplificado. A emissão crescente de sinal luminoso é monitorada em cada reação/tubo de PCR, a cada ciclo, para gerar curvas de amplificação típicas da PCR quantitativa.

Fig. 23. Gráfico representando uma amostra positiva para um alvo específico, na qual a fluorescência gerada pela amplificação do produto e as três fases da PCR em tempo real.

A cinética da reação de PCR em tempo real é semelhante a reação convencional, a amplificação é dividida em 3 fases: a linha basal na qual não há produtos de PCR suficientes para detectar fluorescência, a fase log em que a quantidade de produtos de PCR dobra a cada ciclo (fase da detecção) e a fase platô onde não há mais aumento no número de produtos, conforme explicado anteriormente (Fig.23).


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As características relevantes do PCR em tempo real são rapidez, especificidade, sensibilidade e opcional quantificação. Atualmente o método do PCR em tempo real é considerado um dos métodos de escolha p/ testes moleculares quantitativos e qualitativos em decorrência de suas vantagens sobre o PCR convencional: 

Maior rapidez de execução



Maior sensibilidade e reprodutibilidade;



Menor risco de contaminação de amostras no ambiente laboratorial, devido a

ausência de manipulação das amostras após o processo de amplificação.

PCR em Tempo Real no NAT HIV / HCV de Bio-Manguinhos No ensaio NAT HIV/HCV de Bio-Manguinhos emprega-se uma combinação destes protocolos, com a identificação de dois genomas virais compostos por RNA, portanto se trata de uma RT-PCR. É necessária a etapa prévia de composição do cDNA. É multiplex, por detectar simultaneamente os vírus HCV, HIV e o controle interno da reação, a Partícula Calibradora - fragmento sintético de ácido nucleico viral inserido na etapa de pooling de amostras. Em adição, esta detecção se faz continuamente, em tempo real, com captação da fluorescência decorrente da luminescência produzida pela dissociação do fluoróforo, a partir da sonda, no momento da extensão. Ao detectar-se esta fluorescência, podemos indicar a presença do cDNA que, por sua vez, identifica a presença vírus na amostra. Ou seja, esse sistema se mostra mais específico, pois a sonda é degradada apenas após hibridizar-se ao material a ser detectado. Desta forma, o ensaio NAT se trata de uma RT-PCR multiplex em tempo real para detecção do HIV e do HCV em amostras de doadores de sangue. A simples presença destes tipos virais em uma amostra de sangue inviabiliza a sua transferência a outro paciente. Este protocolo não visa a quantificação de carga viral e, sim, a qualidade do sangue como passível de transfundir ou não.


32 Revisão: 29/03/2012

Biossegurança Materiais biológicos tais como sangue, soro e célula são potencialmente infectantes e muitas vezes estão contaminados com agente etiológicos diferentes do que se está pesquisando, ou ainda desconhecidos. Por isso é fundamental que medidas de biossegurança adequadas sejam adotadas nos laboratórios onde há manipulação desses materiais. Equipamentos de Proteção Individual (EPI) – devem ficar em lugar de fácil acesso aos funcionários do laboratório.  Óculos de segurança, protetor facial e máscara descartável – usadas sempre que houver possibilidade de aerossóis.  Jaleco longo de mangas compridas e punho retrátil, preferencialmente descartável – deve ser usado somente dentro da área do laboratório.  Luvas descartáveis – devem ser resistentes, de material sintético (vinil) ou latex para manipulação de matérias potencialmente infectantes. As luvas descartáveis, usadas para os procedimentos da técnica PCR devem ser isentas de talco.  Pipetas automáticas – devem estar calibradas e validadas.  Propés descartáveis  Calçados fechados e de material resistente. Equipamento de Proteção Coletiva (EPC) – são utilizados para minimizar a exposição dos funcionários ao risco e em caso de acidentes, reduzir suas conseqüências.  Chuveiro de emergência e lava-olhos – devem estar instalados próximos ao ambiente laboratorial.  Extintores de incêndio.  Centrifugas com rotor provido de tampa.  Cabines de segurança biológica – classe II – devem ser posicionadas longe de portas, janelas e de equipamentos que de alguma forma promovam a movimentação do ar, empurrando ar não filtrado, diretamente para a superfície de trabalho, podendo assim contaminar o material que está sendo manipulado.


33 Revisão: 29/03/2012

Formato do Kit Componentes e Apresentação do Kit  Relação dos componentes fornecidos com o produto: MÓDULO Controles

Extração

Amplificação

COMPONENTES

VOLUMES

Controle Positivo

02 Frascos com de 800 µL cada

Controle Negativo


Partícula Calibradora


Tampão de Lise

01 Frasco com 33 mL

Carreador de RNA

01 Frasco liofilizado

Tampão de Lavagem 1

01 Frasco com 83 mL

Tampão de Lavagem 2

01 Frasco com 68 mL

Tampão de Eluição

09 Frascos com 2,0 mL cada

Fluido TE

04 Frascos com 1,4 mL cada

Placa de Vácuo

01 Unidade de 96 poços

Placa de Eluição


Placa de Reação


Protease

01 Frasco liofilizado

Solvente de Protease

01 Frasco com 6 mL

Recipientes Descartáveis

02 Unidades

Placa Óptica

01 Unidade

Selo Óptico

01 Unidade

Tubo de 5 mL

01 Unidade

Manual de Instrução

01 Unidade

Cartão Bio

01 Unidade

Mistura de PCR

02 Frascos com 900 µL cada

Enzima RT


Água/DEPC


Sondas

02 Frascos com 180µL cada

Iniciadores

02 Frascos com 50µL cada


34 Revisão: 29/03/2012

 Material de reposição 

Etanol P.A. Merck 96%;



Tubo BD – PPT EDTA K2 com gel (600 tubos/rotinas);



Desinfetante amônia quaternária 50% (solução de uso diluída 1:600. Ex.: 5 ml de desinfetante para 3 L de água);



1 Frasco plástico de 500 mL para etanol dedicado para utilização de 12 processamentos no MDx;



Ponteiras de 1100 µL MDx - 7 caixas com 96 unidades cada;



Ponteiras de 175µL Janus - 9 caixas com 96 unidades cada;



Tubo Secundário - 4 embalagens com 25 unidades cada.

 Relação dos materiais necessários não fornecidos 

Água destilada



Luva descartável sem talco



Etiquetas com código de barras para tubo secundário



Proveta de 500 mL calibrada



Sacos de descarte de lixo biológico



Duas pipetas automáticas 1000 µL (calibradas)



Ponteiras com filtro 1000 µL

 Indicação das condições adequadas de armazenamento e transporte O KIT NAT HIV/HCV é composto por 3 módulos, com temperaturas de estocagem diferentes: 

Módulo de Controle: armazenar de -80°C a -60ºC;



Módulo de Extração: armazenar de 15°C a 25°C;



Módulo de Amplificação: armazenar de -30°C a -10°C;

Obs.: Os módulos de Controle e de Amplificação serão transportados em gelo seco (-80°C a -60ºC), mas deverão ser armazenados nas temperaturas indicadas, no rótulo externo, desde o ato do recebimento até a utilização do conjunto.


35 Revisão: 29/03/2012

Precauções, cuidados especiais e esclarecimentos sobre os riscos decorrentes do manuseio do produto e seu descarte A Partícula Calibradora e o Controle Positivo não possuem capacidade replicativa in vivo e, portanto, são biosseguros (não infecciosos). Este kit contém produtos químicos, podendo representar uma fonte de risco. Ao manusear qualquer um dos reagentes observe as precauções necessárias. A qualidade dos resultados obtidos depende do cumprimento às boas práticas de laboratório tais como: 

O teste deve ser usado somente para monitoramento in vitro e uso profissional, de acordo com as instruções fornecidas no kit;



Os reagentes contêm agentes irritantes e devem ser manipuladas com cuidado. Observar as recomendações em relação às medidas de segurança dos reagentes;



Tampão de Lise e Tampão de Lavagem 1 contêm cloridrato de guanidina, que pode formar compostos reativos quando combinado com hipoclorito de sódio. É perigoso e irritante se ingerido ou em contato com olhos e pele;



Protease contém subtilisina: sensibilizante, irritante se inalado (prejudicial para o sistema respiratório e para a pele); também acarretará risco quando em contato com os olhos;



Utilizar equipamento de proteção individual (EPI) tais como luvas descartáveis (sem talco) e jaleco em todas as etapas do teste;



Após o uso, desprezar ponteiras, tubos, placas, reagentes, insumos/produtos bem como os itens consumíveis (tubos de coleta e secundários, entre outros) no descarte de risco biológico;



Os tubos com amostras deverão ser colocados em saco vermelho duplo (descarte de risco biológico) e encaminhados para um local apropriado para resíduos. De acordo com a política de descarte de cada hemocentro;



Desprezar a placa óptica após a amplificação e detecção em descarte não reciclável;



Todas as sobras de reagentes deverão ser descartadas após a utilização de cada módulo do kit, de acordo com os procedimentos de cada Hemocentro;



Não utilizar reagentes com a validade vencida.



Nunca misturar componentes de lotes diferentes;


36 Revisão: 29/03/2012

Cuidados com as amostras biológicas 

A coleta das amostras de sangue periférico deve ser feita, preferencialmente, em tubo PPT contendo anticoagulante K2 EDTA e gel de poliester para separação de plasma e fração celular do sangue total. Coletar 5 mL de sangue total;



Homogeneizar a amostra por inversão após a coleta;



Centrifugar o tubo até oito horas após a coleta à 800g (em uma centrífuga com 100 mm de raio, corresponde a 2700 rpm) por 10 minutos;



Não utilizar tubos de coleta reciclados;



Não congelar o tubo após a coleta, pois o gel pode se desprender e alterar a carga viral do paciente;



Após a centrifugação conservar as amostras refrigeradas de 2ºC a 8°C por no máximo 72h até a realização do teste;



Os fatores interferentes para o uso da amostra são hemólise, lipemia e presença de bilirrubina.



Não utilizar tubos com anticoagulante heparina;

Influências pré-analíticas, tais como, anticoagulantes e temperatura 

Não deverão ser aceitas amostras que não forem coletadas no tubo BD PPT contendo anticoagulante K2 EDTA e gel de poliéster;



A temperatura do espaço físico destinado ao teste deve ser monitorada e mantida entre 15 e 25°C.



Utilizar água destilada/deionizada.


37 Revisão: 29/03/2012

Plataforma NAT Nacional A plataforma integrada para o Teste de Ácidos Nucléicos Brasileiro foi desenvolvida por Bio-Manguinhos para a Hemorrede Nacional, integrando tecnologias modernas existentes no mercado. A plataforma Brasileira NAT Multiplex HIV/HCV, contém os equipamentos JANUS (PerkinElmer) (Fig.: 24), BioRobot MDx (Qiagen) (Fig.: 25) e Termociclador ABI 7500 (Life Technologies) (Fig.: 26).  JANUS = Estação de pipetagem automática (funções: Preparo do pool, Confecção da mistura da reação de PCR e Pipetagem da mesma na microplaca de 96 poços).

Fig. 24: Fotografia do equipamento Janus – vista frontal.

 BioRobot MDx = Dispositivo de purificação simultânea de DNA e RNA (Lise, Extração e Purificação).

Fig. 25: Equipamento MDx (Visualização interna).


38 Revisão: 29/03/2012

 Termociclador ABI 7500 = PCR em Tempo Real (Amplificação e Detecção).

Fig. 26: Foto ilustrativa do equipamento ABI 7500.

As amostras biológicas a serem testadas serão misturadas em um conjunto (pool) de seis amostras que, ainda na etapa inicial, terá a partícula calibradora adicionada. O material completo (pool de amostras + partícula calibradora) será submetido à lise celular e o material genético será purificado e estabilizado. A mistura de PCR é acrescentada ao material genético que será levado ao equipamento especifico (termociclador) onde ocorrerá à amplificação do material em tempo real. À medida que a amplificação acontece, as sondas fluorescentes são liberadas e a intensidade do comprimento de onda é mensurada pelo sistema de filtros do equipamento, permitindo a detecção do alvo proposto.

Fluxo Metodológico (a) Preparo amostras em pool de seis ou individual (quando um “pool” de amostras apresentar resultado positivo, as amostras que formaram o “pool” serão testadas individualmente (teste “single”); (b) Extração e Purificação de ácido nucléico da amostra biológica (plasma); (c) Amplificação do ácido nucléico; (d) Detecção do mesmo por PCR em tempo real.

Esquema do Teste: Amostra Biológica

Extração MDx

“Pool” Janus


Amplificação ABI 7500

Detecção ABI 7500

Mistura de PCR Janus

39 Revisão: 29/03/2012

NAT – Teste de Ácido Nucléicos O teste de ácidos nucléicos (NAT) é utilizado para a diminuição da janela de detecção dos antígenos HIV (Vírus da Imunodeficiência Humana) e HCV (Vírus da Hepatite C) em amostras de sangue de doadores, com a consequente diminuição do risco transfusional causado por estes agentes. O objetivo do teste NAT é reduzir a janela imunológica para 10 dias tanto para HIV quanto para HCV, atualmente para o HIV a janela estimada é de 22 dias e para o HCV de 70 dias. No período da janela imunológica, não há produção sistêmica de anticorpos, a triagem desses agentes infecciosos pelo ensaio NAT, ocorre por rastreamento genômico, portanto, o tempo de duplicação viral, que é de 0,3 dia e 1 dia para os HCV e HIV, respectivamente, é de fundamental importância para a eficácia do ensaio. A região genômica selecionada para o rastreamento destes vírus, são regiões Cterminal do gene da integrase do HIV e 5’-não traduzida (5’-UTR) do HCV. Essas regiões foram escolhidas por terem uma boa estabilidade genética e alto grau de conservação entre os diversos tipos, genótipos e subtipos destes patógenos. A metodologia foi desenvolvida em pool de seis amostras, impactando no custo da utilização da mesma e no tempo gasto durante a execução da rotina. O consenso de se trabalhar em “pool” com seis amostras, foi estabelecido, pelos resultados de sensibilidade do limite de detecção, obtidos a partir dos testes de replicatas de painéis virais calibrados por padrões internacionais. Será adicionada aos pool de amostras a partícula calibradora, que participará em todas as etapas do processo imposto aos pool. Seu volume adicionado deve ser constante e relativo a 100 UI de vírus/mL, estando sempre perto do limite de detecção do teste. A partícula calibradora é um vírus HIV/HCV mimético biosseguro, que exerce a função de controlar as condições ideais da reação (intra-ensaio) validando os resultados das determinações e garantindo a qualidade metodológica. Este calibrador interno possui mutações genômicas, que o diferencia estruturalmente das características comuns do vírus selvagem, tornando-o não infeccioso. Durante a confecção dos pool o equipamento Janus identifica todas as amostras por código de barras, sendo possível o reconhecimento dos materiais pertencentes a cada pool, o que permite a rastreabilidade das amostras. Após a preparação dos pool o material é transportado para o equipamento BioRobot MDx onde será extraído o RNA. A tecnologia de extração com alta recuperação de ácido nucléico, baseada na utilização de partículas magnéticas, é realizada por uma estação robótica que executa a Elaborado pela DIACM Aprovado por Linda Khalili Boukai

40 Revisão: 29/03/2012

extração do genoma viral, além da transferência automática do material extraído na placa, previamente identificada pelo leitor de código de barras do equipamento. A metodologia de amplificação específica do alvo com sondas marcadas com fluorescência (Taqman Probe) será usada para determinar a presença dos HIV e HCV de forma discriminatória. Isso é possível devido à utilização de sondas especificas para cada alvo. O Kit nacional fornece material para 96 reações, tendo capacidade para processar 552 amostras primárias (92 pool de seis amostras + 2 controles negativos + 2 controles positivos). A detecção pela plataforma NAT Multiplex HIV/HCV Nacional se desenvolve em etapas, integrando três equipamentos com tecnologias distintas:

Etapas e Equipamentos: A. Preparo do Pool - JANUS B. Extração - BioRobot MDx C. Preparação e pipetagem da reação de PCR - JANUS D. Amplificação e detecção – Termociclador ABI 7500 E. Processamento de Dados e resultados

A) Preparo do Pool Para realizar o preparo do pool, com 6 amostras, equivalente a uma placa com 96 poços, utiliza-se 100 µL de cada uma das 552 amostras primárias. Cada amostra primária deve ser coletada em tubos dedicados ao NAT de flebotomia a vácuo do tipo PPT (K2 EDTA, com gel de poliéster para separação de plasma e fração celular do sangue total). A transferência é feita, gerando tubos secundários (tubos de poliestireno de 15 ml), onde será adicionada a partícula calibradora. Quando ocorrer resultado positivo para o pool todas as 6 amostras que o compõem serão obrigatoriamente re-testadas individualmente (single).


41 Revisão: 29/03/2012

Procedimento 1) Utilização do Janus 

Ligar o computador do Janus;

 Para o funcionamento correto da mini rede, o computador do equipamento Janus deve ser SEMPRE o primeiro a ser ligado (Fig. 27)!

Fig. 27: Computador acoplado ao Janus.



Na área de trabalho, abrir o programa com duplo clique no ícone WinPREP® for JANUS® (Fig. 28).

®

®

Fig. 28: Detalhe do ícone do programa WinPREP for JANUS na área de trabalho.

 Antes de iniciar a rotina, observar se há água destilada suficiente no galão de líquido do sistema Janus e se o galão de resíduos (descarte) precisa ser esvaziado. 

Quando encher o galão com água destilada, prestar atenção se o conector esta bem encaixado ao sistema para evitar falhas no seu reconhecimento.

 Antes de utilizar o equipamento para realizar qualquer protocolo, são necessários dois procedimentos (itens 1.1 e 1.2). Elaborado pela DIACM Aprovado por Linda Khalili Boukai

42 Revisão: 29/03/2012

1.1 - Inicialização do robô (Initialize): No software WinPREP® for JANUS™ só será utilizado para esta primeira etapa, para a inicialização do equipamento. Para inicia-lo basta clicar em: Utilities > Setup > Instrument > Initialize (Fig.29).

Fig.29: Tela do programa WinPrep, com as opções selecionadas em azul que precisam ser clicadas para a inicialização do robô.

1.2 - Remoção de bolhas e lavagem do sistema (FlushSysLiq) O Flush System Liquid é realizado para retirar bolhas no sistema de liquidos do robô, evitando problemas de pipetagem e de detecção. Todos os protocolos utilizados na plataforma NAT, Pooling de amostras; Reação de PCR; Consolidação de dados e o Flush System (FlushSysLiq), devem ser realizados abrindo o ícone, Janus Application Assistant (Fig.30), na área de trabalho, com um duplo clique.

Fig. 30: Detalhe do ícone do programa JANUS Application Assistant na área de trabalho.


43 Revisão: 29/03/2012

Dentro do software selecionar a aba “Select”. Para a realização do procedimento de lavagem, selecionar o último ícone dentro da janela Select Protocol, o FlushSysLiq. Verificar na janela “Answer Questions” se o volume está em 10.000 µL para o Flush e para o Wash. Clicar na aba “4.Run” (Seta laranja).

Fig. 28: Tela ilustrativa do procedimento de FlushSysLiq.


44 Revisão: 29/03/2012

 Clicar em START (Seta vermelha) para iniciar o Flush System Liquid.

Fig.29:Tela ilustrativa do procedimento de início do Flush System Liquid.

 Repetir este procedimento até que não se observem mais bolhas de ar nas mangueiras do equipamento (Fig.33 A e B) e seringas.

A

B Fig. 30: Mangueiras do equipamento Janus. Essas são verificadas com relação a presença de bolhas. A) As setas indicam bolhas no sistema; B) Visualização das mangueiras localizadas no braço robótico.


A

45 Revisão: 29/03/2012

1.3 . Procedimento Pool de seis amostras  O serviço de Hemoterapia deve gerar 96 etiquetas com códigos de barras, para os tubos secundários. As etiquetas nos tubos secundários devem ser coladas na vertical acima da marcação de 2 mL do tubo.  As etiquetas nos tubos primários devem ser coladas na vertical acima da altura do gel.  Verificar se os tubos primários (BD – PPT EDTA K2 com gel), depois de centrifugados contêm volume suficiente para a análise (mínimo de 1 mL).  A amostra não deve ser processada se a mesma apresentar vestígio de coágulo ou volume insuficiente.

 Atenção ao sentido dos tubos primários nas estantes. A leitura dos tubos é feita de trás (fundo do aparelho) para frente. Sendo assim, o tubo n° 1 é aquele que está na última posição na estante 1A (Fig. 34). 

B

A

Fig. 31: A) Estante com os tubos primários do equipamento Janus, numerados de 1 a 9. É possível notar que a estante 10 está vazia (só utilizada para abertura de pool) e as estantes 11 e 12 estão com os tubos secundários. B) Esquema ilustrativo mostrando a posição dos tubos primários na estante do Janus. Notar que a numeração começa de trás para frente (sensor do braço do laser) para frente (frente do equipamento).


46 Revisão: 29/03/2012

 A estante 10 da mesa de trabalho do equipamento deve permanecer vazia. Essa estante só é utilizada na abertura de pool.  O equipamento JANUS deve ser carregado no máximo com os 138 tubos primários, originando 23 pool de seis amostras (tubos secundários), por vez. Esse procedimento será repetido 4 vezes durante o processo para gerar ao final 92 tubos secundários.  Nas estantes TS1A e TS2A (exclusiva para os tubos secundários) colocar os 23 tubos secundários (15mL). Obs: Para o preparo dos 23 “pools” correspondentes as estantes 1B a 9B utilizar as estantes de tubos secundários TS1B e TS2B e assim sucessivamente até as estantes TS1D e TS2D.

 Verificar se todos os códigos de barras dos tubos primários e secundários estão posicionados corretamente (voltados para a janela frontal esquerda da rack) para evitar erros de leitura (Fig.35).  Verificar se todos os tubos encontram-se encaixados até o final da estante para evitar quebra dos mesmos devido ao movimento do braço do robô.

A

B

Fig. 32: Posição correta dos tubos nas racks. As etiquetas com os códigos de barras devem sempre ficar voltadas para a janela esquerda das racks. A – Tubos Primários. B – Tubos secundários.



Colocar as caixas de ponteiras condutivas de 175 µl (Fig. 36, seta azul).

Fig. 33: Mesa de trabalho do equipamento Janus. Setas azuis apontam para os locais onde são colocadas as caixas de ponteiras de 175 µL.


47 Revisão: 29/03/2012



Retirar a partícula calibradora do Módulo de Controle do freezer -70°C, esperar o descongelamento completo.



Homogeneizar a partícula calibradora por ressuspensão, utilizando uma pipeta automática de 1000 µl, ou por inversão.



Colocar o flaconete contendo a partícula calibradora nas primeiras posições da estante à esquerda (Fig. 37).

 Cuidado ao homogeneizar a partícula calibradora para não formar bolhas. Se isso ocorrer o Janus não pipetará a partícula nos tubos secundários.  A forma ideal para homogeneizar por ressuspensão é aspirar e dispensar o volume vagarosamente, de 4 a 5 vezes. Não é preciso aspirar todo o líquido contido nos flaconetes. Isso evita a formação de bolhas.

Fig. 34: Suporte para os flaconetes de partícula calibradora na mesa do Janus. Os dois flaconetes de partícula calibradora devem ser posicionados nas duas primeiras posições no lado esquerdo.


48 Revisão: 29/03/2012

O primeiro protocolo utilizado é o Pooling de Amostras que se encontra na aba “1. Select” Para selecioná-lo clicar sobre o mesmo (seta vermelha) e clicar em Next Step (seta verde). Também é possível pular as etapas “2.Gather” e “3.Place”, indo diretamente para a aba “4.Run”.

Fig. 35: Tela indicando o procedimento de realização do protocolo de Pooling de Amostras.


49 Revisão: 29/03/2012

Na aba Gather, irá aparecer todos os itens que serão utilizados neste protocolo. Clicar em Next Step ou ir diretamente para a aba “4.Run”.

Fig. 36: Lista dos itens que são necessários para a realização do protocolo de Pooling de Amostras.


50 Revisão: 29/03/2012

Na aba Place está indicado à localização correta de cada um dos itens. Clicar em Next Step.

Fig. 37: Tela indicando as posições de cada item necessário ao protocolo de pooling de amostras.


51 Revisão: 29/03/2012

Na aba Run é para executar a rotina. Ao selecionar Start dentro da janela principal. Abrirá uma janela Status (Fig. 41), a finalidade desse passo é informar para o equipamento o número de ponteiras a serem utilizadas. Dentro da aba Reset Tip Boxes, clicar no primeiro item Disposible Tips1 e selecionar Fill nas opções do lado direito. Proceder da mesma forma até o último Disposible Tips. Ao final clicar em OK (seta azul). Serão 9 caixas de tip no total, apesar de nesta etapa o equipamento utilizar somente 7 caixas, encher todas as caixas nesta etapa. O valor correto é 96/0.

Fig. 38: Tela onde é informado para o equipamento o número de ponteiras a serem utilizadas em suas devidas posições.

Abrirá a janela onde será incluído o quantitativo de amostras a serem realizadas na rotina (Fig.42). No campo “Número de amostras possíveis positivas” deverá ser informado o quantitativo de amostras em single (seta verde), no campo “número de amostras primárias” deverá ser informado o quantitativo de amostras que sofrerão o pooling (seta vermelha). Após incluir essas informações clicar em “Mapa de amostras”. O Software irá mostrar o desenho das racks. Após carregar o equipamento conforme o exposto no mapa, clicar em “Atualizar” (seta azul). O equipamento fará a leitura dos códigos de barras dos tubos.


52 Revisão: 29/03/2012

Fig. 39: Tela do Mapa de amostras, nesta tela aparecerá o perfil de preenchimento da primeira carregada, os perfis das outras carregadas irão aparecer ao final de cada etapa.

Após a leitura dos códigos de barras, o software irá indicar se há tubos faltando, tubos extra e duplicatas de códigos de barras dos tubos secundários. Quando há qualquer problema de leitura dos códigos de barras, essa janela de geração de mapa aparecerá novamente. Clicar em “Atualizar” (seta azul) para abrir a janela de releitura (Fig. 43).


53 Revisão: 29/03/2012

Figura 40: Tela de releitura dos códigos de barras.

A coluna Lane (Fig. 43) informa qual a rack onde o tubo não foi lido, a coluna Posição informa qual a posição da rack se encontra o tubo que não foi lido. Para fazer a releitura selecionar a linha com a “falha na leitura”, ler o código de barras com o leitor manual ou digitar o mesmo. Quando reler todos os códigos, certifique-se de que as racks estão todas posicionadas corretamente na mesa de trabalho do equipamento Janus e selecione Atualizar. Após o término da primeira etapa de preparo de 23 pools de seis amostras (a partir de 138 tubos primários). Retirar as estantes contendo os tubos primários A e carregar o equipamento com as estantes B. Retirar as estantes contendo os tubos secundários TS1A e TS2A e carregar o equipamento com as estantes TS1B e TS2B. Clicar em “Next” Após o término desta etapa, substituir as estantes conforme descrito acima seguindo o sequencial C e posteriormente as racks com a letra D.

 Tabela referente ao número total de amostras. O número de amostras em pool e o número de amostras singles. N° Amostras Totais 552 522 492 462 432 402 372 342 312


N° Amostras Pools 552 516 480 444 408 372 336 300 264

N° Amostras Singles -6 12 18 24 30 36 42 48

54 Revisão: 29/03/2012

 Pouco antes de terminar a etapa de pool (± 15 min.) retirar, do freezer, os Controles Negativo e Positivo, e esperar que descongelem completamente à temperatura ambiente.

 Quando o Janus é desligado, as Varispans descem. Com isso é importante sempre mover o braço robótico para a posição de repouso. Entrar em: UTILITIES > SETUP > INSTRUMENT > PARK ALL ARMS

Caso haja necessidade da realização de duas rotinas no mesmo dia, utilizando apenas uma plataforma, devem-se seguir as seguintes orientações: - Iniciar a segunda rotina após ter passado uma hora de duração no MDx da primeira rotina. - O protocolo da Reação de PCR da primeira rotina pode ser efetuado logo após o pooling da segunda, não haverá conflito de informações, desde que os códigos de barras dos tubos secundários sejam diferentes. * Se ao término da etapa de extração da primeira rotina no MDx, o Janus ainda estiver realizando o pooling das amostras da segunda, colocar a placa de RNA da primeira, no freezer a -80ºC até o momento de iniciar a reação de PCR Setup. CERTIFIQUE-SE que a placa esteja totalmente descongelada. - Iniciar a reação de PCR da segunda rotina, apenas quando estiver faltando 20 minutos para terminar a reação de amplificação da primeira, no equipamento ABI7500.


55 Revisão: 29/03/2012

Rotinas utilizando somente amostras em Single Seguir o protocolo de pooling normalmente até o momento em que aparece a tela do mapa de amostras (Fig. 44). Na aba “Modo de Carregamento” selecionar Ensaio de Amostras Simples para a realização de 92 amostras. Esta rotina, com apenas amostras em single, será feita em uma carregada, como mostra a figura abaixo:

Mapa de carregamento dos tubos primários com as amostras em single Mapa de carregamento dos tubos secundários.

Fig. 41: Mapa de amostras utilizando Ensaio de Amostras Simples.


56 Revisão: 29/03/2012

B) EXTRAÇÃO A extração é totalmente automatizada pelo Biorobô MDx (Qiagen) (Fig. 36) e utiliza tecnologia com alta recuperação de ácido nucléico, baseada nas propriedades de ligação seletiva da membrana de sílica. As amostras são lisadas com tampão de lise e protease sob condições desnaturantes (a temperatura de 56°C). O etanol auxilia na precipitação do material. O carreador permite a perfeita ligação do lisado à membrana de sílica. O material genético é absorvido pela membrana através de uma etapa de vácuo. O ácido nucléico ligado à membrana, passa por três etapas de lavagem sob vácuo para a purificação. A primeira é realizada com a adição do Tampão de Lavagem 1 e subseqüente vácuo (o equipamento pede a verificação visual de coágulos), em seguida realiza-se a adição do Tampão de Lavagem 2 e vácuo (as condições de sal e pH dos tampões de lavagem garantem a retirada das diferentes impurezas e dos inibidores de PCR das amostras), posteriormente adiciona-se etanol e é realizado mais um vácuo. Antes da eluição, a membrana de sílica passa por uma secagem onde o etanol restante ajuda na desidratação da placa. Após todas essas etapas o produto final eluído é livre de albumina sérica, outras proteínas, nucleases, sais inorgânicos e orgânicos e outros possíveis interferentes.

PROCEDIMENTOS 2. Utilização do MDx: Ligar o computador do equipamento de extração MDx.

Fig. 42: Computador do equipamento Janus.


57 Revisão: 29/03/2012

Ligar o equipamento MDx (no botão liga/desliga: de O para I) (Fig. 46).

Fig. 43: Seta indica botão liga/desliga do equipamento.

Abrir o software QIAsoft 4. O equipamento solicita informações sobre o nome do usuário e senha, conforme figura 47.

Fig. 44: Caixa de diálogo “Login” do programa QIAsoft 4.

 Sempre verificar se as luzes verdes, atrás do equipamento, do lado direito, estão acesas (Fig.48). Se não estiverem, verificar o problema indicado. Atenção: Dependendo da bomba de vácuo existente no equipamento, o status da luz do “Pump” será diferenciado. - Se a bomba for suspensa, a luz ficará apagada e só acenderá em caso de problemas. - Se a bomba não for suspensa, a luz permanecerá acesa, apagando somente em caso de problemas.


58 Revisão: 29/03/2012

Power Pump System Waste Vacuum

Fig. 45: Parte de trás do equipamento MDx. Mostrando em detalhes as 5 luzes verdes. Que são: Power (energia), Pump (bomba), System (sistema), Waste (descarte), Vacuum (vácuo).

Seguir as instruções para a realização das etapas de manutenção diária; Clicar na opção Tools da barra de ferramentas. Selecionar Reinitialize Robot. Ao término deste procedimento, selecionar Flush System, e ao fim deste, Flush Dispenser (Fig. 49)

Fig. 46: Tela do programa QIAsoft MDx.

Preparar o equipamento MDx, seguindo as instruções do software QIAmp One for all MDx cV98 para preparo dos reagentes e da mesa de trabalho.


59 Revisão: 29/03/2012

Na tela abaixo (Fig.50) ler o código de barras do cartão BIO, que vem dentro de cada módulo de extração. (Fig. 51).

Figura 47: Janela do programa QIAsoft MDx, para a leitura do código de barras do Cartão Bio que vem dentro do módulo de extração do kit NAT. .

A

B

Figura 48: A) Leitor de códigos de barras que fica ao lado do computador. B) Cartão Bio com o código de barras.


60 Revisão: 29/03/2012

2.1. Instruções gerais – Sistema de reposição e descarte de líquido: Para montagem da mesa de trabalho, siga as orientações abaixo (Fig. 52 a 54) e após a execução de cada etapa, selecionar continuar.

A.

B.

Fig. 49: A) Tela com “Instruções gerais” mostrando a etapa de reposição de água destilada do sistema. B) Inserido fotografia do galão de água destilada, dentro do armário embaixo do equipamento.

A..

B.

Fig. 50: A) Tela com “Instruções gerais” mostrando a etapa de descarte de água do sistema (sem risco biológico). B) Inserido fotografia do galão de descarte de água.


61 Revisão: 29/03/2012

A.

B.

Figura 51: A) Tela com “Instruções gerais” mostrando a etapa de descarte biológico (Vacuum Trap) e do frasco de condensação. B) Inserido fotografia do galão de descarte biológico.

 Após essa etapa de “reposição e descarte de líquidos”, verificar se todas as conexões dos galões e mangueiras estão desobstruídas e conectadas corretamente, permitindo o fluxo contínuo dos líquidos.

Fig. 52: Sistema de reposição e descarte de líquidos. Setas indicam as conexões dos galões que precisam ser verificadas. .


62 Revisão: 29/03/2012

2.2 - Preparo da Mesa de Trabalho e Abastecimento do Carrossel O software QIAsoft MDx descreve todo o procedimento de montagem da mesa de trabalho e do abastecimento do carrossel, orientando o usuário durante a execução das tarefas. Após seguir as orientações das telas e execução de cada etapa, clicar em “Next“

Figura 56: Tela com instruções para colocar o saco de descarte de ponteiras.

Figura 57: Tela com instruções para reconstituição dos tampões e do etanol.


63 Revisão: 29/03/2012

Figura 58: Tela com instruções para abastecimento do carrossel.

 Atenção na colocação dos frascos dentro do equipamento. O código de barras de cada um precisa estar voltado para fora. Se isso não ocorrer, o equipamento não conseguirá ler os códigos e acusará que os frascos não se encontram nos seus lugares.


64 Revisão: 29/03/2012

Figura 59: Tela com instruções para montagem da mesa de trabalho.



65 Revisão: 29/03/2012




66 Revisão: 29/03/2012

Figura 63: Tela com instruções para montagem da gaveta de ponteiras.

 Abastecer a mesa de trabalho apenas com as ponteiras de 1100µL; não utilizar as ponteiras de 300 µL, estas são utilizadas apenas pelos Engenheiros durante as manutenções.


67 Revisão: 29/03/2012

Figura 64: Tela com instruções para reconstituição da Protease.

 Para a reconstituição da Protease: Verter o frasco de solvente no frasco de Protease liofilizada e homogeneizar lentamente, a fim de evitar aquecimento e possível desnaturação da enzima.  Depois de reconstituída a Protease pode ser armazenada em temperatura de 15-25ºC, se mantendo estável até a validade indicada.


68 Revisão: 29/03/2012


Figura 66: Tela com instruções para preparação do Tampão de Lise.


69 Revisão: 29/03/2012

 CUIDADO ao transferir o tampão de lise para o recipiente descartável para que não haja formação de bolhas.




70 Revisão: 29/03/2012

Figura 69: Tela com instruções para montagem da mesa de trabalho, placa de eluição.

 CUIDADO com a posição da placa de Eluição. O código de barras deve estar voltado para a direita do equipamento. Assim, garantimos a posição correta da placa, posição 1A na esquerda superior. 


71 Revisão: 29/03/2012

Figura 70: Tela com alerta de movimentação do braço do robô.

Figura 71: Tela com instruções para montagem das amostras na mesa de trabalho.


72 Revisão: 29/03/2012

2.3 Carregamento das amostras na mesa de trabalho

Colocar 4 tubos secundários (15ml) etiquetados vazios nas 04 primeiras posições da estante do MDx conforme Figura 72:

Figura 7253: Fotografia das racks do MDx. Setas azuis apontam para a posição onde serão encaixados os tubos secundários do controle negativo. Setas vermelhas apontam para as posições onde serão encaixados os tubos secundários de controle positivo. As outras posições correspondem às amostras.

Controle Negativo

-

Controle Positivo

Posição 5 1° tubo secundário

Figura 543: Esquema ilustrativo das 12 racks do MDx. Em azul representa a posição dos tubos do controle negativo e em vermelho a posição dos tubos dos controles positivos.

Utilizando uma pipeta automática de 1000 µL (calibrada), homogeneizar e adicionar 600 µL do Controle Negativo nos tubos das posições 1 e 2, e 600 µL do Controle Positivo nos tubos das posições 3 e 4. Retirar os tubos secundários de amostras da estante do equipamento Janus e transferir para a estante do equipamento MDx. Os tubos secundários contendo o “pool” de seis amostras deverão preencher a primeira estante do MDx a partir da posição 5 (logo após os controles Negativo e Positivo).


73 Revisão: 29/03/2012

Figura 74: Tela com aviso para fechamento de porta.

 Após essa etapa, o equipamento iniciará o protocolo de extração automaticamente.

2.4 Verificação de coágulos Faltando aproximadamente 36 minutos para o término da extração, o equipamento MDx solicitará a intervenção do usuário para verificação visual da presença de coágulo nos poços da placa de vácuo (Fig. 75): Poços com coágulos

Fig.75: Janela de checagem de coágulos. A caixa de texto diz: “Verifique a placa de vácuo. Você pode ver algum poço com coágulo?”


74 Revisão: 29/03/2012

1. Retire a placa de vácuo do equipamento e verifique se há algum poço com coágulo. Se houver, selecione “YES”, aparecerá uma janela para identificação do(s) poço(s) (Fig. 76). Se não houver, selecione “NO”.

Figura 76: Janela para o usuário marcar a posição do(s) poço(s) com coágulo.

Recoloque a placa de vácuo na posição e continue o procedimento. Ao final do processo de extração, seguir as orientações descritas nas telas abaixo para retirada da placa de eluição e limpeza da área de trabalho.

Figura 77: Janela para a retirada da placa de eluição ao final do processo.


75 Revisão: 29/03/2012

 Após retirar a placa de eluição, colocá-la no freezer -80ºC a -60ºC, por no mínimo 20min.

Figura 78: Tela com instruções para descarte dos materiais da mesa de trabalho.

Figura 79: Tela com instruções para retirada dos acessórios laváveis da mesa de trabalho.


76 Revisão: 29/03/2012

 Deixar as peças submersas em detergente amônia quaternária 50% (solução de uso diluida 1:600. Ex.: 5 ml de detergente para 3 L de água).  Posteriormente lavar as peças em água corrente abundante, sendo a última lavagem com água destilada.  Deixar as peças secarem bem e antes da utilização expor a luz UV da capela (enviada para utilização na plataforma) por 15min.

Figura 80: Tela com instruções para lavagem do sistema de vácuo.


77 Revisão: 29/03/2012

Figura 81: Tela com instruções para descarte dos tampões e etanol.

Figura 82: Tela com alerta de movimentação do braço do robô.


78 Revisão: 29/03/2012

Figura 83: Tela com instruções para descarte das amostras.

Figura 84: Tela com instruções para retirada do saco de descarte de ponteiras.


79 Revisão: 29/03/2012

Figura 85: Tela exibida ao final do protocolo.

C) Protocolo de Reação de PCR - JANUS Após o término da limpeza do equipamento MDx, o JANUS já pode ser preparado para a realização da reação de PCR. - Passado os 20min da placa de eluição no freezer, retirar a mesma e colocá-la para descongelar no Janus (no local indicado no software). - Ligar o bloco resfriado (INHECO) do equipamento JANUS e aguardar que chegue até a temperatura de trabalho (6°C ± 2°C); - Retirar do freezer os reagentes (Iniciadores, Sondas, Mistura PCR, Água DEPC) e aguardar o descongelamento à temperatura ambiente, exceto a Enzima RT, que deverá ser colocada diretamente, na sua posição determinada, no bloco resfriado (quando este já estiver com a temperatura de 6°C ± 2°C). A Sonda deve ser descongelada ao abrigo da luz. - Carregar o equipamento (conforme mostrado na Figura 86) com os reagentes necessários para a realização da reação de PCR (este quantitativo é suficiente para a realização da reação de PCR para 96 testes: 92 pools + 02 controles negativos + 02 controles positivos).


80 Revisão: 29/03/2012

A

B

C

D

E

A

B

C

D

E

Fig. 86: Desenho Ilustrativo das posições dos reagentes. Circulo A: Iniciadores, Círculo B: Sondas, Círculo C: Enzima RT, Círculo D: Mistura de PCR, Círculo E: Água DEPC.

 O tempo de descongelamento da placa de eluição (placa com o material extraído) é de aproximadamente 30 a 45 minutos em temperatura ambiente entre 15ºC a 25ºC. Deve-se observar o descongelamento total da placa. - Colocar a placa de PCR e o tubo de 5 mL para a reação de mistura de PCR no equipamento Janus;

 Ao colocar a placa óptica e a placa de eluição no equipamento Janus, certifique-se de que ambas estejam com o poço A1 voltado para o canto superior esquerdo.


81 Revisão: 29/03/2012

- O protocolo de Reação de PCR encontra-se na aba 1. Select. Para selecioná-lo clicar sobre o mesmo (seta vermelha) e clicar em Next Step (seta verde). Também é possível pular as etapas 2.Gather e 3. Place, indo diretamente para a aba 4.Run .

Figura 87: Tela ilustrativa indicando o procedimento de Reação de PCR.


82 Revisão: 29/03/2012

Na aba Gather, irá aparecer todos os itens que serão utilizados neste protocolo. Clicar em Next Step ou ir diretamente para a aba “4.Run”.

Fig.88: Listagem de todos os itens necessários para realização do protocolo de Reação de PCR.

Na aba Place está indicado a localização correta de cada um dos itens. Clicar em Next Step (seta verde).

Fig. 89: Tela indicativa das posições de cada item necessário para reação de PCR.


83 Revisão: 29/03/2012

Na aba Run, clicar em Start (seta vermelha).

Figura 90: Tela ilustrativa do início da reação de PCR.

Abrirá uma janela Status, dentro da aba Reset Tip Boxes, verifique se o Disposible Tips 8 e 9 estão completos (96/0). Se estiver, selecione “OK”; se não estiver selecione cada um, clique em Fill e em “OK”.

Figura 91: Tela onde é informado para o equipamento o número de ponteiras a serem utilizadas em suas devidas posições.


84 Revisão: 29/03/2012

Abrirá a tela para ser inserido o código de barra da placa de PCR (seta azul). Ler o código de barras da Placa de reação (Óptica) com leitor manual do equipamento Janus. Clicar em “OK” (seta vermelha) (Fig. 92).

Fig. 92: Tela que solicita a inserção do código de barras da placa de reação (Óptica) com o auxílio do leitor manual do Janus.

Abrirá a tela para ser inserido o código de barra da placa da Qiagen (seta azul). Ler o código de barras com o leitor manual do JANUS. Clicar em “OK” (seta vermelha) (Fig. 93).

Fig. 93: Tela que solicita a inserção do código de barras da placa de eluição com o auxílio do leitor manual do Janus.


85 Revisão: 29/03/2012

Abrirá a tela perguntando sobre as condições do Inheco e se os reagentes estão na posição devida. Clicar em “OK” (seta vermelha) (Fig.94).

Fig. 94: Tela de verificação da temperatura do inheco (6ºC).

Abrirá a tela perguntando se a placa de PCR e o tubo de 5 mL estão posicionados corretamente no Janus . Clicar em “Ok” (seta vermelha) (Fig.95).

Fig. 95: Tela de verificação do posicionamento do tubo de 5mL.


86 Revisão: 29/03/2012

Após a mistura de PCR ser transferida para a placa de Reação, aparecerá uma janela no software do JANUS solicitando a placa de eluição. Retirar a tampa da placa e verificar se esta se encontra totalmente descongelada. Selecionar “OK” na janela emitida. Após o JANUS transferir o RNA para a placa de reação, vedar esta placa com o selo óptico, com o auxílio da espátula (ABI). Observar a placa para ver se há bolhas nos poços. Se houver, fazer movimentos firmes de cima para baixo com a placa para retirar as bolhas. Colocar a placa de reação no equipamento de detecção ABI 7500 Real Time PCR System.

 Não tocar o fundo da placa! - Recolocar a tampa na placa de eluição e armazená-la no freezer a – 70°C até o final da rotina com emissão de laudo.

D) Amplificação e Detecção Amplificação A metodologia de amplificação específica do alvo com sondas marcadas com fluorescência é usada para determinar a presença de: HIV, HCV e da partícula calibradora de forma discriminatória. O equipamento utilizado na etapa de amplificação e detecção é o ABI 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems/LifeTechnologies).

Detecção A técnica possibilita a dosagem dos produtos de PCR durante o transcorrer da mesma em tempo real. Isto é conseguido através de uma sonda de DNA sintético que tem duas modificações em suas extremidades. A emissão de luz é diretamente proporcional à massa de produto de PCR que está sendo sintetizado, possibilitando a dosagem em tempo real.


87 Revisão: 29/03/2012

4. Procedimento para Amplificação e Detecção – Real Time 7500 - Ligar o equipamento de PCR em tempo real e o seu computador, 15 min. antes de utilizá-lo, para que o sistema Peltier de aquecimento da placa de reação se estabilize.

- Selecionar o ícone 7500 System Software

Fig. 96: Icone do software 7500, na área de trabalho.

Após a inicialização do software, irá aparecer uma caixa de texto pedindo para escolher o usuário. Selecionar NAT. Clicar “OK”.

Fig. 97: Tela de login do software 7500.

Dentro da tela inicial do programa selecionar TEMPLATE.

Fig.98: Icone do Template de dentro do software.

Abrirá a janela de seleção de arquivos do Windows. Selecionar o arquivo denominado “NAT” e clicar em “Open”. Elaborado pela DIACM Aprovado por Linda Khalili Boukai

88 Revisão: 29/03/2012

Selecionar Set up > Experiment Properties. Em Experiment Name, seta vermelha, colocar o código de barras da placa óptica (utilizando o leitor manual de código de barras do equipamento ABI 7500) (Fig. 99).

Fig.99: Tela do programa 7500 Software.

Clicar em Save e selecionar Save as Clicar no ícone Após o fim da corrida, clicar no ícone Analyse e depois em Save. Clicar no ícone Export .

Fig.100: Tela do programa 7500 Software. Imagem mostra a área EXPORT selecionada.


89 Revisão: 29/03/2012

Abrirá a janela abaixo; selecionar somente a opção RESULTS e alterar a opção File type para *.txt. No campo “Export File Name” estará o código de barras da placa, apagar o “_data”. em “Export File Location” aparece o diretório onde o arquivo será gravado.

Fig.101: Tela do programa 7500 Software.

Clicar em “START EXPORT”, seta verde (Fig.101).

Fig. 102: Tela de informação do export.

Clicar em “Close Export Tool” e fecha o software.


90 Revisão: 29/03/2012

E) Processamento de dados e Resultados Este procedimento é realizado no computador do equipamento JANUS. O protocolo de Consolidação dos Dados encontra-se na aba “1. Select”. Para selecioná-lo clicar sobre o mesmo (seta vermelha).

Fig.103: Tela para realização do protocolo de consolidação dos dados.

Selecionar 4. Run e Clicar em Start.

Fig. 104: Tela indicando o início do protocolo de Consolidação de Dados.


91 Revisão: 29/03/2012

Nesta etapa, basta clicar direto em “OK” (seta vermelha), uma vez que ele não utiliza nenhuma ponteira (tip).

Fig. 105: Tela de Reset Tip Boxes

Posteriormente, selecionar a rotina que deseja processar na opção “Novos Relatórios” (o arquivo selecionado ficará marcado com V); - Exemplo: 298_11022010_001_RJ

Fig.55: Quadro onde lista as rotinas a serem consolidadas.

Clicar em Gerar, seta vermelha. Ao final da consolidação dos dados a opção Fechar estará habilitada, selecioná-la para encerrar o protocolo, seta verde.


92 Revisão: 29/03/2012

 Se houver necessidade de Reconsolidar a rotina. Selecioná-la na opção “Todos os Relatórios” (o arquivo selecionado ficará marcado com V);

E.1 Geração do laudo de resultados no Software de Bio-Manguinhos Clique no ícone localizado no desktop do computador do Janus.

Fig.107: Ícone do software de Bio-Manguinhos.

Abrirá a tela abaixo:

Fig. 108: tela de login do software.

Digite o nome de usuário e a senha. Clique em Login

Fig. 109: Tela de comandos do software.

Para gerar o laudo, dê um clique em Processa Rotina, seta vermelha (Fig. 109).


93 Revisão: 29/03/2012

Fig. 110: Tela de seleção das rotinas.

Nesta tela serão mostradas todas as rotinas para geração dos laudos (Fig.110). Digite o número do lote utilizado para realização da rotina, no campo “Lote”. Selecione a rotina desejada e clique em “Sim”. Aparecerá o status do processamento da rotina (Processo Finalizado. Rotina OK ou Rotina Inválida) e a pergunta se o usuário deseja gerar nova rotina (Fig.111). Se houver a necessidade de gerar nova rotina, clicar em “Sim”, seta vermelha e refazer o processo (Fig.111).

Fig. 111: Tela com o Status da rotina


94 Revisão: 29/03/2012

Para consultar a rotina, clicar em Consultar Rotina (Fig.112):

Fig. 112: Tela de comandos do software.

Aparecerá a tela abaixo:

Fig. 113: tela de visualização de rotinas geradas

Nesta tela, o usuário poderá visualizar o conteúdo de uma rotina gerada selecionando a data em que a mesma foi gerada. Em seguida clicar em “Visualizar” (Fig.113).


95 Revisão: 29/03/2012

Clicar duas vezes na rotina para visualização do laudo em PDF (Fig. 114).

Fig. 114: Laudo em PDF.

E.2 Interpretação dos Resultados E.2.1: Interpretação do Laudo Detecção Amostra Não detectável Controle interno OK Controle interno Não OK

Procedimento Liberar o resultado das amostras. Repetir a amostra. Se confirmar o resultado, acionar a assistência técnica de BM relatando o fato.

Amostras em pool Detectável

Refazer as 6 amostras, que constituem o pool,

Controle interno OK

individualmente.

Amostra em single Detectável Controle interno OK


Seguir o fluxograma descrito a seguir.

96 Revisão: 29/03/2012

 Ao confrontar os resultados da plataforma NAT com os da sorologia, caso haja alguma amostra não detectável para o NAT e reagente na sorologia, seguir conforme o fluxograma supracitado. Doador de sangue

Flebotomia para sorologia

TESTE “GOLD STANDARD” NESTE TRABALHO – ROTINA SOROLOGIA

Flebotomia para NAT BioM

Execução de sorologia

Descarte da bolsa Execução do NAT BioM

Convocação do doador

+ NAT HCV

NAT HIV

+

Bolsa em quarentena +

– pos+

+

ELISA HCV

Bolsa em quarentena

– pos+ Caracterização virológica molecular da amostra: UFRJ

– pos+

ELISA HIV

– pos+ Convocação do doador de sangue

Acompanhamento sorológico do doador de sangue -soroconversão?-

+

+

ELISA HCV – pos+

ELISA HIV – pos+ Liberação da bolsa

Descarte da bolsa Convocação do doador

Confirmatório: Western blot HIV ou RIPA HCV

Figura 115: Fluxograma de ações dos resultados na triagem sorológica.


97 Revisão: 29/03/2012

E.2.2 Interpretação das curvas de amplificação no ABI 7500 Se a corrida a ser analisada não estiver exposta na tela, deve-se buscá-la no seguinte caminho: Área de Trabalho > Pasta NAT > Selecionar o número da corrida> Clicar Open. Clicar na opção Analysis (seta roxa). Para melhor visualização da curva, selecionar as opções Target (seta verde) e marcar a opção Threshold (seta rosa). Primeiramente, a curva deve ser avaliada pela opção Amplification plot, e em seguida pela opção Multicomponent plot (setas vermelhas) (Fig. 116).

Fig. 116: Tela para análise das corridas.


98 Revisão: 29/03/2012

A. Controle interno e amostras não detectáveis O Ct ideal do controle interno é de 33 (+2,47) (Fig. 117). O controle interno aparecerá “não OK”, no laudo, quando o Ct da partícula ultrapassar o valor máximo de 35,47 ou quando não houver amplificação do mesmo (Fig.118). Nesses casos será necessário a repetição dessas amostras (O resultado informado no laudo será “Repetir Amostra”). Para determinar se uma amostra é detectável para HIV e para HCV, deve-se verificar se as curvas estão ultrapassando a linha do threshold (analisando o Amplification Plot). Se a linha não estiver ultrapassando o threshold, esta amostra é não detectável (Fig.118). A

B

Fig. 117:Gráficos representativos de controle interno OK e amostras não detectáveis para HIV e HCV. A Análise pelo Amplification Plot: Curva vermelha representa o controle interno ultrapassando a linha do Threshold. B – Análise pelo Multicomponent plot: Curva rosa representa o controle interno com curva padrão de positividade, linha verde representa o HIV, linha azul o HCV e linha vermelha a referência passiva (ROX).

A

B

Fig.118: Gráficos representativos de controle interno “Não OK”. A - Análise pelo Amplification Plot: tracejado vermelho representa o controle interno que não sofreu amplificação. B – Análise pelo Multicomponent plot: linha rosa representa o controle interno, linha verde representa o HIV, linha azul o HCV e linha vermelha a referência passiva (ROX), não se observa presença de curva.


99 Revisão: 29/03/2012

B. Controles Negativos e Positivos Nos controles negativos, há apenas a curva referente à partícula calibradora. Se ocorrer curvas referentes ao HIV ou HCV ultrapassando a linha do Threshold (Fig. 119), a rotina sairá como inválida no laudo (Fig.120). A

B .

Figura 119: Gráficos representativos de controles negativos dentro do padrão esperado. A- Análise pelo Amplification Plot: Curva referente a partícula calibradora. B- Análise pelo Multicomponent Plot: linha rosa representa o controle interno, linha azul o HCV e linha vermelha a referência passiva (ROX).

A

B .

Figura 120: Gráficos representativos de controles negativos positivando. A- Análise pelo Amplification Plot: A curva verde ultrapassando a linha do threshold representa que houve amplificação para HIV. B- Análise pelo Multicomponent Plot: linha rosa representa o controle interno, linha azul o HCV, linha vermelha a referência passiva (ROX) e a linha verde representa o HIV. Nesta análise, houve amplificação para HIV, presença de uma discreta curva.


100 Revisão: 29/03/2012

Nos controles positivos o Ct ideal para HIV e HCV é de 24 (± 2.47) (Fig. 121). Qualquer valor fora deste intervalo, mínimo de 21,53 e máximo de 26,47, a rotina sairá como inválida no laudo. A

B .

Fig. 121: Gráficos representativos de controles positivos dentro do padrão esperado. A- Análise pelo Amplification Plot: há duas curvas ultrapassando a linha do threshold referentes a HCV e HIV. B- Análise pelo Multicomponent Plot: linha rosa representa o controle interno, linha verde representa o HIV, linha azul o HCV e linha vermelha a referência passiva (ROX), houve absorção elevada de fluorescência tanto para HIV quanto para HCV.


101 Revisão: 29/03/2012

C. Perfis dentro do padrão esperado A amostra pode ser positiva caso a curva esteja ultrapassando a linha do threshold dentro de um perfil esperado, tanto para HIV quanto para HCV (Fig 122 e 123). A.

B .

Fig. 56: Gráficos representativos de amostras positivos para HCV. A- Análise pelo Amplification Plot: A curva referente ao HCV está ultrapassando a linha do threshold . B- Análise pelo Multicomponent Plot: linha rosa representa o controle interno, linha verde representa o HIV, linha vermelha, referência passiva (ROX) e a linha azul o HCV. Nesta análise, observa-se absorção de fluorescência mais alta para HCV apresentando uma curva característica de positividade.

A .

B.

Fig.123: Gráficos representativos de amostras positivos para HIV. A- Análise pelo Amplification Plot: A curva referente a HIV está ultrapassando a linha do threshold . B- Análise pelo Multicomponent Plot: linha rosa representa o controle interno, linha verde representa o HIV, linha vermelha referência passiva (ROX) e a linha azul o HCV. Nesta análise, observa-se absorção de fluorescência mais alta para HIV apresentando uma curva característica de positividade.


102 Revisão: 29/03/2012

D. Perfis fora do padrão esperado Existem casos em que o perfil encontra-se fora do padrão esperado. - Ocasionado por poço vazio = sendo a causa possível problemas na pipetagem nos equipamentos ou presença de bolhas na placa (Fig.124).

B .

A .

C

Fig.124: Gráficos representativos de poços da placa vazia ou presença de bolhas. A- Análise do poço pelo Amplification Plot: não há uma curva com perfil esperado ultrapassando a linha do threshold. B- Análise pelo Multicomponent Plot: Não houve amplificação. C- Perfil da corrida pelo Amplification Plot: perfil fragmentado das curvas que apresentando poços vazios.


103 Revisão: 29/03/2012

- Por presença de backgrounds = pois ao analisar a curva pelo Amplification plot, a mesma ultrapassa a linha do threshold. Entretanto, quando analisado pelo Multicomponent plot pode-se observar que não houve uma curva satisfatória. (Fig. 125). A ..

B .

Figura 125: Gráficos representativos de amostras com backgrounds para HIV e HCV. A- Análise pelo Amplification Plot: A curva referente a HCV está ultrapassando a linha do threshold fora do padrão esperado. B- Análise pelo Multicomponent Plot: linha rosa representa o controle interno, linha verde representa o HIV, linha vermelha, referência passiva (ROX) e a linha azul o HCV. Não houve absorção considerável de fluorescência para HCV.

- Na figura 126, mostra o perfil de uma corrida de PCR ideal. Na figura 127, mostra um perfil de curvas com background.

A.

Fig. 126: Visão do gráfico no Amplification Plot apresentando curva ideal, ou seja, dentro do padrão esperado para o Kit NAT.


104 Revisão: 29/03/2012

A.

B.

C.

Fig. 127: Gráfico representativo de uma curva com background. A- Perfil de uma rotina apresentando uma curva fora do padrão esperado para o Kit NAT, visão no Amplification Plot: B- Análise de uma amostra com background pelo Amplification Plot: A curva referente ao HIV está ultrapassando a linha do threshold fora do perfil esperado. C- Análise pelo Multicomponent Plot: linha rosa representa a partícula calibradora, linha verde representa o HIV, linha vermelha, referência passiva (ROX) e a linha azul o HCV. Não houve absorção considerável de fluorescência.


105 Revisão: 29/03/2012

Conservação e Estocagem Armazenamento do Kit Visando à otimização dos resultados e a manutenção da qualidade do produto NAT, devese observar e armazenar os módulos na temperatura adequada conforme descrição no rótulo.

- Módulo de Controle: armazenar de -80ºC a -60ºC; - Módulo de Amplificação: armazenar -30ºC a -10ºC; - Módulo de Extração: armazenar de 15ºC a 25ºC;

Estas temperaturas deverão ser monitoradas, periodicamente, para garantir o ótimo grau de eficiência do ensaio. O uso de instrumentos de medição de temperatura com calibração, atualizada, é recomendável.

Condições de Transporte O transporte deve ser efetuado respeitando as condições ideais de temperatura, sendo os módulos controle e de amplificação transportados em gelo seco (-80ºC a -60ºC), mas deverão ser armazenados nas temperaturas indicadas, no rótulo externo, desde o ato do recebimento até a utilização do conjunto. O transporte da embalagem final contendo o módulo de extração deve ser transportado em bubina de gelo. Os módulos de Amplificação e controle devem ser transportados em gelo seco (-80°C a -60ºC). Para controle de temperatura de transporte do Kit, é enviado dentro da caixa um termômetro (Tag), que é acionado em Bio-Manguinhos e parado no ato do recebimento no cliente. Após o recebimento, solicitamos que seja encaminhado a Bio-Manguinhos uma pesquisa de satisfação de entrega, com informações do recebimento dos Kits e acessórios.


106 Revisão: 29/03/2012

Instrução de uso do Tag: Assim que receber o kit, deve-se pressionar o botão “Stop” do monitor de temperatura de 3 a 5 segundos. Quando o visor estiver nítido, observar o círculo (STOP ICON) na parte superior direita (conforme ilustrado na figura abaixo). Este círculo é o indicativo de que o procedimento foi executado corretamente. Para efetuar a leitura, deve-se esperar até que o visor esteja visível, em torno de dez minutos. Esse tempo não deve exceder, pois a temperatura não permanece muito tempo exposta no visor. A temperatura do kit deve estar entre -80oC a -60 oC, conforme descrito em bula. O visor do TAG deve estar apresentando o símbolo do SOL, na parte superior à esquerda. Este símbolo indica que o botão START foi acionado antes dos kits serem transportados aos hemocentros. Caso o símbolo do sino apareça no visor, isto é um sinal de que em algum momento do transporte houve uma variação na temperatura no kit.

Fig. 128: Imagem do visor do Tag de temperatura.

 Caso o kit não chegue nas condições apropriadas ou tenha algum outro problema, deve-se avisar imediatamente a DIACM (08000 - 210310).


107 Revisão: 29/03/2012

PROCEDIMENTOS DE MANUTENÇÕES EQUIPAMENTO MDx Devem ser realizados os seguintes procedimentos de manutenção para garantir uma operação confiável da estação de trabalho BioRobot MDx: 

Manutenção diária



Manutenção semanal



Manutenção mensal



Manutenção preventiva – a cada 6 meses agendadas pela DIACM.

Os procedimentos de manutenção diária, semanal e mensal deverão ser realizados pelo usuário. Para acessar as manutenções do equipamento MDx é preciso: 

Abrir o software QIAsoft MDx no computador do Robô.



Na barra de ferramentas clicar em: Environment



Selecionar: Maintenace (Fig.129).

Fig. 129: Imagem do software para seleção das manutenções.


108 Revisão: 29/03/2012

Fig. 130: Imagem da janela Maintenance no software do MDx.

As colunas mostradas na aba “New Maintenance” (Novas Manutenções) (Fig. 130) representam:  # - o número de colunas da tabela.  Date/Time – a data e a hora em que o procedimento foi emitido pelo software.  Item – o componente do BioRobot MDx que requer o procedimento de manutenção.  Task – uma breve descrição dos procedimentos demanutenção.  Type – a frequência do procedimento (Diário, Semanal, Mensal ou Bienal)  Operator – esta coluna permanece vazia Nesta aba encontram-se procedimentos de manutenções que estão pendentes e precisam ser realizados. Na aba “Maintenance” (Manutenções) se encontram os procedimentos diários, semanais, mensais e preventivas já realizadas. Manutenções

Frequência

Limpeza dos recipientes de líquidos

Diário

Limpeza da estação Tip-Disposal (onde as Tips são dispensadas) Limpeza da mesa de trabalho

Diário

Limpeza da janela do leitor de códigos de barras

Semanal

Manutenção do Sistema detector de líquido e sistema dispensador de alta velocidade Limpeza do carrossel de reagentes

Semanal

Manutenção do sistema dilutor

Semanal

Limpeza do recipiente de líquido do sistema

Mensal

Limpeza do descarte do condensador

Mensal

Limpeza da mesa de trabalho

Mensal

Limpeza do “Lab Hand”

Mensal

Manutenção semestral (feita pela Qiagen)

Semestral


Diário

Semanal

109 Revisão: 29/03/2012

Para a realização de manutenções pendentes deve-se: 1. Clicar duas vezes sobre o item desejado e ler a caixa de diálogo que aparecerá. 2. Após executar o solicitado, clicar em “YES” para confirmar a realização do procedimento de manutenção (Fig. 131).

Fig. 131 Caixa de diálogo com instrução para a realização das tarefas.

A seguir, o procedimento de manutenção passa da aba New Maintenance (Nova Manutenção) para Maintenance (Manutenção). Para visualização do procedimento realizado, selecionar a aba Maintenance. Nesta, a coluna Operador apresenta os nomes dos usuários que executaram os procedimentos.

O botão “RUN” no modo “Executar” fica amarelo se um procedimento de manutenção precisar ser realizado. Este botão volta para sua cor original (Cinza), no momento em que você confirmar que este procedimento de manutenção foi realizado.


110 Revisão: 29/03/2012

MANUTENÇÕES DIÁRIAS  “Liquid containers cleaning” – Limpeza dos recipientes de líquidos 1. Esvaziar o recipiente de líquido do sistema (galão sob a estação de trabalho) e o frasco de líquido do sistema (garrafa que fica no carrossel de reagentes). Ao abrir o recipiente de líquido do sistema, desconectar primeiro a tubulação e depois remover a tampa. Enxaguar o recipiente e o frasco completamente com água deionizada/destilada e reabastecêlos com nova água deionizada/destilada. Após reabastecer o recipiente de líquido do sistema com água deionizada/destilada, fechar primeiro a tampa e depois conectar a tubulação. 2. Executar o Flush System e o Flush Dispenser. 3. Esvaziar o sifão a vácuo (“vacuum trap”) e o descarte/lixo ( “Waste Container”). 4. Limpar e lavar os galões, os sifões e as tampas do “vacuum trap” e do “Waste Container” com detergente e enxaguar com água.

 Tip-Disposal Station Cleaning Maintenace - Limpeza da estação de descarte das ponteiras 1. Selecione “Tool” (Ferramenta)

“Move Arm To…” (mover braço para…) e selecione

“Middle” (Meio) ou “Right” (Direita) para mover o braço robótico para a posição adequada na mesa de trabalho. 2. Borrifar toda a estação Tip-Disposal com desinfetante a base de etanol (ou álcool 70%) e secar com papel toalha.  Worktable cleaning Maintenance – Limpeza da mesa de trabalho 1. Selecione “Tool” (Ferramenta)

“Move Arm To…” (mover braço para…) e selecione

“Left’ (Esquerda), “Middle” (Meio) ou “Right” (Direita) para mover o braço robótico para a posição adequada na mesa de trabalho. 2. Limpar com gaze umedecida em álcool 70%, toda a mesa de trabalho. Certifique-se que ao final do procedimento toda a mesa de trabalho estará limpa e seca.


111 Revisão: 29/03/2012

MANUTENÇÕES SEMANAIS  Bar Code Reader Windows Cleaning Maintenence – Limpeza da janela do leitor de códigos de barra 1. Inspecionar a janela do leitor do código de barra do: • Sistema de localização da amostra • Sistema de localização da placa da Qiagen (portátil e interno) • Sistema de localização de tampão 2. Se a janela estiver suja, limpar a superfície gentilmente com gaze seca.

 High-Dispensing System and Liquid Detectors Maintenance - Manutenção do Sistema de detector de líquido e sistema dispensador de alta velocidade 1. Limpar a superfície do cabeçote dispensador com gaze embebida em álcool 70%. 2. Faça um Flush Dispenser. Segure o Dispensador de Alta Velocidade e observe se o fluxo de água está saindo constante pelos 8 capilares. Se o fluxo de água não estiver constante, checar se os capilares de vidro estão quebrados. Entre em contato com a Assistência Técnica QIAGEN. 3. Calibrar a alta velocidade de distribuição do sistema e verificação de detecção de líquidos: • Na tela inicial do software selecionar na janela de tarefas o Protocolo de Manutenção I V3.0, seta vermelha (Fig. 132). • Clicar em “Run”.

Fig. 132 imagem do software para seleção do protocolo de manutenção.


112 Revisão: 29/03/2012

• Um assistente aparece e fornece as instruções necessárias, emitindo as telas abaixo:

Fig. 133 Tela com explicações sobre a função do protocolo

Fig. 136 Tela com instruções dos procedimentos. Códigos de barras da rack “015”.


113 Revisão: 29/03/2012

Ostras telas aparecerão como guia de montagem. Deve-se seguir o comando indicada nas janelas de diálogo de cada tela exibida no software. Ao final do procedimento será indicado se o protocolo passou ou falhou (Fig. 137). Se passar, seguir com as orientações de limpeza indicada pelo software. Se falhar, repetir o procedimento totalizando três vezes e enviar os arquivos gerados para Bio-Manguinhos.

Fig. 137 Tela indicando o status do resultado do protocolo.

A tela final do protocolo, após a limpeza da mesa, indica o diretório onde os arquivos gerados foram gravados no computador (Fig.138).

Fig.138: Tela final indicando o diretório dos arquivos gerados.


114 Revisão: 29/03/2012

 Reagent Carousel Cleaning Maintenance – Limpeza o carrossel de reagentes 1. Abrir a porta da torre técnica e retirar todos os frascos do carrossel de reagentes. Inspecionar a superfície interna para presença de líquido espirrado. Se espirros estiverem presentes: 2. Retirar o carrossel de reagentes e limpar os respingos. 3. Borrifar cuidadosamente o desinfetante à base de etanol (ou álcool 70%) sobre as superfícies interna e externa do carrossel de reagentes. Garantir que o desinfetante (ou álcool 70%) cubra todas as partes do carrossel de reagentes. 4. Enxaguar com água deionizada/destilada. 5. Retirar o excesso de água e secar com papel toalha. 6. Retornar o carrossel de reagentes para a torre técnica. MANUTENÇÕES MENSAIS 

System Liquid Container Cleaning Maintenance – Limpeza do recipiente de líquido do sistema

1. Desconectar a tubulação da tampa do recipiente do líquido do sistema. A seguir desenroscar e remover a tampa. Retirar o frasco do líquido do sistema do carrossel de reagentes. 2. Esvaziar o recipiente e o frasco do líquido do sistema. 3. Limpar o recipiente e o frasco com um detergente potente de acordo com as instruções do fabricante. 4. Enxaguar o recipiente e o frasco 3 vezes com água da torneira para remover qualquer traço de detergente. Repetir usando água deionizada/destilada. 5. Limpar a superfície interna da tampa e da tubulação com um papel toalha umedecido com detergente diluído. 6. Enxaguar 3 vezes a tampa e a tubulação com água da torneira para retirar todos os traços de detergente. Repetir usando água deionizada/destilada. 7. Reabastecer o recipiente e o frasco do líquido do sistema com água deionizada/destilada. 8. Fechar com a tampa do recipiente e reconectar a tubulação à tampa. Retornar o frasco ao carrossel de reagentes. 9. Realizar Flush System e Flush Dispenser.


115 Revisão: 29/03/2012



Worktable Cleaning Maintenance – Limpeza da mesa de trabalho

1. Selecione “Tool” (Ferramenta)

“Move Arm To…” (mover braço para…) e selecione “Left’

(Esquerda), “Middle“ (Meio) ou “Right” (Direita) para mover o braço robótico para a posição adequada na mesa de trabalho. 2. Retire todos os objetos removíveis da mesa de trabalho. Além disso, retirar a estação para

descarte de ponteiras: 

Desparafusar a porca que prende a estação para descarte de ponteiras



Levantar a estação para descarte de ponteiras. Não remover a base do coletor a vácuo da mesa de trabalho.

3. Desinfetar os objetos retirados submergindo-os em desinfetante. 4. A seguir, enxaguar 3 vezes os objetos com água da torneira para remover qualquer traço de desinfetante. Repetir usando água deionizada/destilada. 5. Retirar todo excesso de líquido e secar com papel toalha. 6. Devolver os objetos para a mesa de trabalho.  Robotic Handling System Cleaning Maintenance – Limpeza do “Lab Hand” 1. Limpar cuidadosamente as 2 hastes das garras do sistema de manipulação robótica com um pano livre de desprendimento de fibras ou com lenço umedecido com desinfetante à base de etanol. (ou álcool 70%) 2. Limpar as garras com um pano macio umedecido com água. A seguir retirar todo o excesso de líquido e secar com papel toalha.

MANUTENÇÕES SEMESTRAIS 

Biannual Maintenance Procedure – Manutenção semestral

Uma janela aparece a cada 6 meses informando que a manutenção preventiva está para vencer. O procedimento de manutenção preventiva deve ser realizado por um Especialista da Assistência Técnica QIAGEN.

Caso haja suspeita de contaminação no equipamento MDx, favor entrar em contato com o atendimento ao cliente de Bio-Manguinhos no telefone: 08000 - 210 310.


116 Revisão: 29/03/2012

EQUIPAMENTO ABI 7500 De acordo com o manual do equipamento de PCR em tempo real, ABI 7500, deverão ser feitas as seguintes calibrações: 

Mensal – Background



Semestral – ROI e pure dyes. Calibração do ABI 7500

A calibração do equipamento ABI 7500 deverá consistir nesta ordem: ROI > Background > Optical > Dyes (ROX, FAM, VIC, Dye 3). Retirar a caixa contendo todas as placas de calibração que serão usadas do freezer e deixar a temperatura ambiente para descongelar

A) Calibração ROI:

- Certifique-se que a placa esteja descongelada. * Não retirar a placa da caixa até iniciar a corrida devido a sua fotossensibilidade. Não jogar fora o pacote e a placa, pois elas serão utilizadas mais vezes.

- Remover a placa ROI do envelope metálico. Se a placa apresentar bolhas, realizar o mesmo procedimento durante a rotina para remoção de bolhas. Ver se o líquido está homogêneo em toda a placa (ou seja, ver se a quantidade de líquidos está igual para todos os poços, e verificar também se o líquido encontra-se no fundo do poço. Caso não esteja, repetir este procedimento.

- Colocar a placa ROI no equipamento. 1. No software ABI 7500, selecionar a opção “Instrument > Instrument Maintenace Manager”, seta vermelha (Fig. 139):

Fig. 139: imagem do software 7500.


117 Revisão: 29/03/2012

2. Na tela de calibração, selecionar o ícone amarelo, à esquerda, escrito “ROI”. Selecionar “START CALIBRATION”. 3. Na caixa de diálogo “Setup”, selecionar a opção “NEXT” até aparecer à janela do “RUN”. 4. Na caixa de diálogo “Run”, selecionar a opção “START RUN”. 5. Aparecerá uma caixa de diálogo de análise informando o status da calibração, se passou (“passed”) ou não (“failed”). 6. Retirar a placa do equipamento. Colocá-la dentro do envelope metálico e na caixa.

 Não é preciso guardar, nesse momento, a placa novamente no freezer, pois a mesma será utilizada na calibração Óptica.

B) Calibração Background

- Certifique-se que a placa esteja descongelada. - Executar o mesmo procedimento relatado acima para a calibração da placa ROI 1. Na tela de calibração, selecionar o ícone amarelo a esquerda escrito “Background”. Selecionar “START CALIBRATION”. 2. Na caixa de diálogo “Set up”, selecionar a opção “NEXT” até aparecer a janela do “RUN”. 3. Na caixa de diálogo do “Run”, selecionar a opção “START RUN”. 4. Aparecerá uma caixa de diálogo de análise (“analysis”) informando o status da calibração, se passou (“passed”) ou não (“failed”).

C) Calibração Óptica

- Certifique-se que a placa esteja descongelada. - Executar o mesmo procedimento relatado acima para as outras calibrações. 1. Na tela do Optical do “Instrument Maintenace Manager”, selecionar a opção “START CALIBRATION”.


118 Revisão: 29/03/2012

2. Na caixa de diálogo “Set up”, selecionar a opção “NEXT” até aparecer a janela do “RUN”. 3. Na caixa de diálogo do “Run”, selecionar a opção “START RUN”. E em seguida “NEXT” 4. Aparecerá uma caixa de diálogo de análise (“analysis”) informando o status da calibração, se passou (“passed”) ou não (“failed”). 5. Remover placa ROI do equipamento. Colocá-la na caixa e armazená-la no freezer.

D) Calibração do Dye

- Certifique-se que a placa esteja descongelada. * As placas que serão utilizadas serão a da ROX, FAM, VIC e TAMRA. Não retirar a placa da caixa até iniciar a corrida devido a sua fotossensibilidade. Não jogar fora o pacote e a placa, pois elas serão utilizadas mais vezes. 1. Na tela de calibração, selecionar o ícone amarelo a esquerda escrito “Dye”. Selecionar “START CALIBRATION”. 2. Clicar em “START CALIBRATION”. Aparecerá 4 janelas. 3. A primeira janela é a do “Overview” pede para selecionar os Dye que deseja calibrar (ROX>FAM>VIC). 4. Na segunda janela, a de “SET UP”, selecionar “NEXT” até aparecer à janela do “RUN”.

* No momento em que o software solicitar cada placa de Dye, preparar e carregar as placas da seguinte forma: - Executar o mesmo procedimento relatado acima para as outras calibrações.

 Verificar se a placa da Dye condiz com o Dye que esta sendo pedido pelo software. 5. Na janela do “Run” selecionar a opção “START RUN”, e em seguida “NEXT”. 6. Aparecerá uma caixa de diálogo de análise (“analysis”) informando o status da calibração, se passou (“passed”) ou não (“failed”). 7. Clicar em “NEXT”. 8. Clicar em “FINISH” 9. Preparar e correr a próxima placa que o software pedir. Elaborado pela DIACM Aprovado por Linda Khalili Boukai

119 Revisão: 29/03/2012

E) Calibração do DYE 3 Selecionar na lateral esquerda DYE (seta vermelha), Custom Dye Calibration (retângulo laranja) e Start Calibration (seta laranja).

Fig. 140: Tela para calibração

Na Figura 141 no campo 2. Select a dye or create a new dye (retângulo vermelho), selecionar New Dye e digitar DYE 3 (é necessário digitar exatamente dessa forma: letras maiúsculas e espaço entre a palavra e o número). No campo 6, marcar o quadrado (retângulo azul). Essa ação habilitará a opção Next (retângulo verde). Selecionar Next até aparecer Start Run (estará escrito num retângulo verde, no canto superior esquerdo).


120 Revisão: 29/03/2012

Fig. 141: Tela para calibração de Dye customizado.

Esta calibração é realizada com a placa de TAMRA, pois as sondas possuem o mesmo comprimento de ondas.


121 Revisão: 29/03/2012

BACKUP DOS EQUIPAMENTOS Devido ao grande número de arquivos que são gerados nas rotinas, os computadores dos equipamentos, podem apresentar lentidão impactando no bom funcionamento dos mesmos. Por isso é recomendado fazer backup dos arquivos:

BACKUP JANUS: Os arquivos que podem sofrer backup no computador do Janus são: Atualmente os arquivos .csv que podem ser apagados na pasta Bin são: BCMap_(id da corrida)_Scan1 BCMap_(id da corrida)_Scan2 BCMap_(id da corrida)_Scan3 BCMap_(id da corrida)_Scan4

BCOutput_(id da corrida)_Scan1 BCOutput_(id da corrida)_Scan2 BCOutput_(id da corrida)_Scan3 BCOutput_(id da corrida)_Scan4

CalibrationReagent (id da corrida)_WellMap1

Extract1 Extract2

PlateTransfer_(id da corrida)_WellMap

PoolingTransfer_(id da corrida)_WellMap1 PoolingTransfer_(id da corrida)_WellMap2 PoolingTransfer_(id da corrida)_WellMap3 PoolingTransfer_(id da corrida)_WellMap4

Test_numero do dataset_rpt

A pasta Bin encontra-se: Meu computador> C:\ > Packard > Janus > Bin


122 Revisão: 29/03/2012

BACKUP ABI 7500: Fazer uma cópia (CD ou DVD) da pasta onde os arquivos em extensão EDS são salvos ao final da corrida. Normalmente essa pasta é denominada “NAT” e está na área de trabalho (Desktop) do Windows. Após a cópia, todos os arquivos podem ser apagados de dentro dessa pasta. Executar a limpeza do disco: Iniciar > Programas > Acessórios > Ferramentas do Sistema > Limpeza de disco (disk cleanup) Executar a desfragmentação de disco: Iniciar > Programas > Acessórios > Ferramentas do Sistema > Desfragmentador de disco (Selecionar o drive C:/)

BACKUP MDx: Fazer uma cópia (CD ou DVD) da pasta USER DATA que se encontra: Meu Computador (My Computer) > C:\ > Arquivos de Programa (Program Files) > QIAsoft MDx > User Data . Nesta pasta estão os relatórios de execução, os arquivos de log, os relatórios de manutenção e também os relatórios de protocolos de serviço realizado pelos engenheiros. Após a cópia, todos os arquivos podem ser apagados de dentro dessa pasta. Executar a limpeza do disco: Iniciar > Programas > Acessórios > Ferramentas do Sistema > Limpeza de disco (disk cleanup) Executar a desfragmentação de disco: Iniciar > Programas > Acessórios > Ferramentas do Sistema > Desfragmentador de disco (Selecionar o drive C:/)


123 Revisão: 29/03/2012

ENVIO DE ARQUIVOS PARA A DIACM Problemas no MDx:  Quando ocorrer uma falha no MDx será pedido o envio de 3 arquivos com as seguintes extensões: rtf, pcl, msl. Esses arquivos são encontrados no seguinte caminho:

Meu Computador > C:\ > Arquivos de Programa (Program Files) > QIAsoft MDx > User Data > Log Files

Dentro da pasta Log Files estão os 3 arquivos da corrida que precisam ser enviados. Procurar pela data da corrida.  Se for pedido para correr algum protocolo de manutenção, os arquivos precisarão ser enviados. Eles são encontrados no seguinte caminho:

Meu Computador > C:\ > Arquivos de Programa (Program Files) > QIAsoft MDx > User Data

Dentro da pasta User Data, estão os arquivos da manutenção. Cada manutenção efetuada gera 3 arquivos: 2 com extensão csv e 1 com extensão rtf. Procurar pela data que foi executada a manutenção.

Problema na consolidação no Janus : Será pedido o envio dos seguintes arquivos: 1 – Arquivos do MDx: Serão enviados 2 arquivos com a extensão csv e rtf. Eles são encontrados no seguinte caminho no computador do Janus:

Meu Computador > C:\ > Qiagen 2 – Arquivo do ABI: Será enviado 1 arquivo com a extensão txt. Ele é encontrado no seguinte caminho no computador do Janus:

Meu Computador > C:\ > ABI File


124 Revisão: 29/03/2012

3 – Arquivos do Janus: Serão enviados todos os arquivos com a data correspondente a rotina rodada. Os mesmos são encontrados no caminho no computador do Janus:

Meu Computador > C:\ >Packard > Janus > Bin 4 – Se for necessário, será pedido o envio do arquivo FioCruz MetaData. O mesmo é encontrado no caminho no computador do Janus:

Meu Computador > C:\ >Packard > Janus > Integration

Para o envio dos relatórios de cada corrida efetuada, enviar os seguintes arquivos: 1 – Arquivo Word com o relatório da corrida 2 – Arquivo eds que se encontra dentro do computador do ABI 7500 3 – Arquivo PDF do laudo da rotina, que se encontra no seguinte caminho:

Meu Computador > C:\ > Nat Laudo > ArqJanus

Os arquivos devem ser enviados para o e-mail: [email protected]

 SALVAR TODOS ESSES ARQUIVOS EM CD. NUNCA UTILIZAR PENDRIVE !


125 Revisão: 29/03/2012

MENSAGENS DE ERROS DOS EQUIPAMENTOS: Os equipamentos fornecem mensagens de erros quando ocorrem problemas. A grande maioria dessas mensagens aparece em inglês. Para facilitar o entendimento das mesmas, segue abaixo os principais erros dos equipamentos com suas respectivas traduções.

Mensagens de Erros no Janus: ERRO: Liquid Handling Error Liquid not detected in tip X. O erro de detecção de líquido ocorre toda a vez que o volume a ser aspirado pelo equipamento em uma amostra ou reagente não é suficiente para finalizar a operação. Para prevenir esse erro, deve-se verificar se o volume das amostras é suficiente para a pipetagem. Caso haja alguma amostra com volume fora do padrão esperado, aparecerá uma tela de erro, indicando a agulha (tip) em que a detecção ocorreu e as opções para melhor gerenciamento do mesmo: Abort: Para a rotina no momento do erro; Retry: A checagem do erro é realizada novamente; Ignore: O erro é ignorado e a aspiração é realizada sem a detecção do líquido; Skip Sample: A amostra é ignorada a partir de então para todos os processos seguintes. Go to Bottom: A pipetagem é realizada do fundo do tubo ou frasco, sem a detecção do líquido. O que deve ser feito? -Tubo contendo gel (Tubos primários): clicar em Retry e aumentar o volume de amostra no tubo. - Tubo não contendo gel (Tubos secundários e frascos): clicar em Go to Bottom.

Fig. 142: Tela com a mensagem de Erro.


126 Revisão: 29/03/2012

ERRO : Dilutor Module Error Move error on tip: X O erro de movimento geralmente ocorre por algum elemento que evitou que a agulha realizasse o seu movimento completo. Clicar em Yes e analisar a causa do problema. Corrigido o problema, clicar em OK, na próxima janela.

Fig.143: Tela com a mensagem de Erro

ERRO: System liquid empty Refil bottle and press Continue to resume test Esse tipo de erro ocorre por dois motivos:

- Falta de água no galão: verificar se não há bolhas no sistema de mangueiras, se a resposta for positiva, o ensaio pode estar prejudicado e a melhor solução é encher o galão de água e realizar outro teste. Se negativa, encher o galão de água, e clicar em Continue. - Mal contato: Ao reconectar o cabo de detecção do nível de água do galão, ele pode voltar com mal contato. Dessa forma ao iniciar um procedimento, esta mensagem pode ocorrer. Checar o nível da água e, caso esteja na altura que permita a realização do ensaio, clique Ignore.



127 Revisão: 29/03/2012

 O preenchimento do galão com a rotina em andamento pode acarretar na formação de bolhas dentro do galão de água e do sistema de alimentação. Dessa forma as bolhas de ar são transferidas para o sistema de pipetagem, interferindo na qualidade do ensaio. ERRO 2: Liquid Handling Error Liquid not detected in tip X. Este tipo de erro ocorre quando a agulha afunda no gel do soro, mesmo que o volume das amostras seja suficiente. * A tela de erro é a mesma do Liquid Handling Error:


Nesse caso deve-se seguir o seguinte procedimento: 1. Clicar em Retry 2. Verifica o tubo se realmente havia material, caso não tenha, trocá-lo. Se tiver, transferir o soro para um tubo de plástico novo e colocá-lo na posição da amostra removida. 3. Limpar a agulha com gaze embebida em álcool isopropólico. 4. Clicar em Ok.


128 Revisão: 29/03/2012

Cuidados básicos para a prevenção de ERROS no Janus: •

Observe o volume dos reagentes e das amostras;

•

Centrifugue as amostras adequadamente;

•

Colagem correta das etiquetas dos tubos secundários (colar em cima do valor de 2 mL no tubo);

•

Verifique sempre se a etiqueta com o código de barras está voltada para a janela das racks;

•

Qualidade das etiquetas;

•

Volume de água no galão do Janus;

•

Verificar o posicionamento da mangueira dentro do galão de líquidos, para que esta não empurre para baixo o sensor de detecção de líquido (peça azul);

•

Verificação de bolhas nos microtubos da partícula calibradora, após mixagem, pois elas atrapalham o sensor de líquido, fazendo-o entender como nível de aspiração o contato com a bolha;

•

Verificação da altura dos tubos primários e secundários;

•

Posicionamento correto dos reagentes, placas, frascos, principalmente no

suporte do

controle de temperatura (INHECO) e das racks (qualquer dúvida basta colocar a seta do mouse sobre a mesma); •

Checagem das ponteiras.

•

Ao realizar a releitura de códigos de barras, seja cauteloso, pois em caso de duplicidade de valores de códigos de barras em tubos secundários, sua rotina será invalidada.


129 Revisão: 29/03/2012

Códigos de ERROS BioRobot MDx :


130 Revisão: 29/03/2012

Cuidados básicos para a prevenção de ERROS no MDx: •

Colagem correta das etiquetas dos tubos secundários (colar em cima do valor de 2 mL no tubo);

•

Qualidade e integridade das etiquetas dos tubos secundários;

•

Verifique sempre se o código de barras está virado para a janela à esquerda das racks.

•

Cheque a integridade do vidro do condensador;

•

Certifique-se de que as mangueiras estão bem conectadas e que não há torções ou dobramentos das mesmas;

•

Cheque o posicionamento das etiquetas dos galões para que nenhuma etiqueta cubra o sensor, impedindo detecção de líquido;

•

Cheque se os galões e sensores estão secos e limpos;

•

Verifique a mesa de trabalho para se assegurar de que todas as peças removíveis (ex: peças do sistema de vácuo, suporte da protease) estão corretamente encaixadas;

•

Verifique a bandeja das ponteiras, se está completamente encaixada;

•

Dentro da torre técnica, certifique-se que os códigos de barras dos rótulos dos reagentes estejam virados para a janela do carrossel para que seja possível a leitura dos mesmos;

•

Ao preparar as racks, lembre-se que as quatro primeiras posições são destinadas aos controles: negativo nas posições 1 e 2 e positivo nas posições 3 e 4 da primeira rack.


131 Revisão: 29/03/2012

Mensagem de erro do ABI 7500 : Quando o equipamento ABI 7500 não consegue se comunicar com o computador a seguinte mensagem não desaparecerá, mesmo clicando em “Retry”

Fig. 146: Tela com a mensagem de Erro

•

Desligar o computador e o equipamento. Ligar novamente.

•

Verificar o cabo de conexão entre o computador e o equipamento (verificar se está bem encaixado)

•

Retirar e reconectar o cabo no equipamento.

•

Trocar a porta USB onde o cabo está conectado no computador.

•

Chamar a equipe de TI do hemocentro para verificar se há algum problema com a conexão de cabos.

•

Se todas as conexões estiverem Ok, restaurar o Windows para o último dia em que o equipamento funcionou corretamente. Para isso entrar no caminho: INICIAR> PROGRAMAS> ACESSÓRIOS> FERRAMENTAS DO SISTEMA> RESTAURAÇÃO DO SISTEMA.

Cuidados básicos para a prevenção de ERROS no ABI 7500:  Após o término da PCR setup a placa deve ser corretamente selada com membrana óptica, que deve estar íntegra e sem amassados. O usuário deve certificar-se também da vedação de todos os poços;  Ao término do preparo da placa, deve-se verificar a presença de bolhas nas amostras. Se houver bolhas no fundo dos poços, removê-las com a centrifugação manual;  Ao inserir a placa no equipamento, verifique se a posição A1 está voltada para o canto superior esquerdo;

 Após o término da PCR, ao analisar a rotina, certifique-se de que toda a placa esteja selecionada.


132 Revisão: 29/03/2012

DESCONTAMINAÇÃO Ambiente 1. Limpar as pipetas com álcool 70% e se necessário com hipoclorito 2. Limpar as bancadas com álcool 70% e se necessário com hipoclorito 3. Trocar as luvas antes de pipetar os controles negativos e positivos do kit NAT. 4. Possuir preferencialmente duas pipetas, uma para pipetar os controles negativos e a outra o positivo, caso não possua, pipetar os controles negativos primeiro e posteriormente os controles positivos. 5. Limpar com álcool 70% suporte de transporte da placa de PCR. 6. Diminuir o fluxo de entrada e saída na sala de PCR.

Janus 1. Limpar as agulhas com álcool 70%. 2. Limpar com álcool 70% o suporte preto da placa de PCR que fica na mesa de trabalho.

MDx 1. Realizar diversas vezes “Flush and Wash”. 2. Fazer a limpeza com etanol 70% na mesa de trabalho do MDx. 3. Desinfetar a bacia onde as peças do MDx são colocadas de molho. 4. Limpar a peça extensora do MDx. 5. Se necessário, limpar a peça extensora do MDx com Hipoclorito (1:1. Ex.: 50mL de hipoclorito para 50 mL de água deionizada) por 15 minutos. Posteriormente, lavar bastante em água corrente e colocar a peça de molho no detergente fornecido por Bio-Manguinhos. 6. Se necessário, aumentar a concentração do detergente que é colocado na bacia de lavagem. Para cada 3 litros de água pode ser usado 5 mL de detergente. 7. No caso de contaminação do local, as tips que sobram no MDx devem ser descartadas e a cada rotina, utilizar somente tips novas. Seguir esse procedimento até resolver o problema de contaminação. 8. Se o problema persistir, por favor, entrar em contato com o atendimento ao cliente de BioManguinhos (08000-210 310)


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ABI Caso durante a calibração background seja observado algum poço com suposta contaminação, seguir o seguinte procedimento: 1. Desligar o equipamento; 2. Abrir a tampa do equipamento; 3. Levantar o pino e empurrar a frente, expondo assim o bloco; 4. Limpar o poço contaminado com água (com uma pipetada calibrada, dispensar 200 µL de água, aspirar e dispensar e aspirar novamente e secar com um papel que não solte pelos o poço); 5. Colocar novamente a placa background, caso o poço ainda esteja contaminado, dispensar e aspirar 200 µL de álcool e repetir o passo 4 com água, certifique-se que o poço esteja completamente seco; 6. Colocar novamente a placa background, caso o poço ainda esteja contaminado, dispensar e aspirar 200 µL de hipoclorito 2%, e repetir o passo 5 e o 4 com água, certifique-se que o poço esteja completamente seco; 7. Caso a contaminação persista, favor entrar em contato com o suporte de Bio-Manguinhos (08000-210 310).

Cuidados adicionais para os hemocentros no uso da plataforma NAT Visando à melhor utilização do Kit e da Plataforma NAT HIV/HCV de Bio-Manguinhos, recomendamos a realização de alguns procedimentos e orientamos seguir as sugestões abaixo que poderão aperfeiçoar o desempenho do Produto e da plataforma: 1 – Controle do acesso ao laboratório É importante que somente a equipe técnica capacitada para processar o Kit NAT HIV/HCV e outros colaboradores autorizados pela chefia do laboratório tenham acesso à sala de testes, evitando, assim, possíveis riscos de contaminação de amostra/rotina e a manipulação equivocada dos equipamentos. 2 – Organizações gerais do laboratório a) É imprescindível que a sala onde o teste é realizado esteja completamente livre de caixas, sacos plásticos e qualquer outro material que possam acumular poeira e sujeira;


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b) Recomendamos que não sejam colados papéis nas paredes e bancadas. Neste sentido, deve-se manter o menor volume possível de papéis no interior do laboratório; c) Os materiais como insumos ou acessórios devem ser guardados no interior de armários, quando possível , ou estocados fora do laboratório; d) A limpeza de superfícies, bancadas e equipamentos deve ser realizada antes e depois de cada rotina de processamento de amostras; e) O lixo deve ser recolhido diariamente. 3 – Instalação e utilização de lâmpadas UV na rotina A fim de prevenir contaminações ambientais, recomendamos enfaticamente a instalação de lâmpadas UV na sala dos equipamentos Janus e MDx, bem como na sala do ABI 7500. Para uma desinfecção eficiente de ambiente, os seguintes fatores são importantes: tempo de exposição, o tamanho da sala e a posição da lâmpada.

a) O tempo de 30 minutos para exposição costuma ser suficiente para uma desinfecção eficaz. Como a exposição prolongada à luz UV é prejudicial à saúde, deve-se garantir que as salas não sejam usadas durante os períodos de desinfecção. Recomenda-se a colocação de avisos e o trancamento das salas durante o período de uso da luz UV; b) Recomendamos que a cada 5,7 m2 de sala seja efetuada a instalação de uma lâmpada UV; c) A distância recomendada para ambientes é de até 2,44 m (8 pés) da lâmpada até a superfície alvo.


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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS - Ascher, M. S. & Wilber, J. C. Immunofluorescence for Serodiagnosis of Retrovirus Infection. Arch.Pathol.Lab.Med. 114: 246-248, 1990. - BioManguinhos BioRobot MDx – User Manual_v1.1_7/10 - Farah, S.B. DNA, Segredos e Mistérios. 2ª ed. São Paulo, Sarvier, 2007 - Gallo, D.; Hoffman, M. N.; Yeh, E.T.; George, J. G. & Hanson, C. V. Comparison of Indirect Immunofl uorescence and Membrane Fluorescence Assays for the Diferentiation of Antibodies to Human Immunodeficiency Virus Types 1 and 2 J. Clin. Microbiol. 30: 2275-2278, 1992. - Manual de Instruções NAT – LATED. Versão setembro 2010. - Rossetti, Ma L. Doenças Infecciosas – Diagnóstico Molecular – 1ª edição. Ed Guanabara Koogan; 2005. - Sandstrom, E. G.; Schooley, R. T.; Ho, D. D.; Byington, R.; Sarngadharan, M. G.; MacLaren, M. E.; Essex, E.; Gallo, R. C. & Hirsch, M. S. Detection of Human anti-HTLV-III Antibodies by Indirect Immunofluorescence Using Fixed Cells. Transfusion, 25/41: 308-12, 1986. - Sullivan, M. T.; Mucke, H.; Kadey, S. D.; Fang, C. T. & Williams, A. E. Evaluation od an Indirect Immunofl uorescence Assay for Confi rmation of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Antibody in U.S. Blood Donor Sera. J. Clin. Microbiol., 30: 2509-2510, 1992.


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Guia de Treinamento NAT HIV-HCV

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