COLORACION ZIEHL-NEELSEN PRINCIPIO
La Coloración de Ziehl- Neelsen es una coloración diferencial útil en la identificación de Micobacterias, aunque no permite la diferenciación de distintas especies. La característica de ácido-resistencia ácido-resistencia de estos microorganismos microorganismos hace de esta coloración un método rápido en el diagnóstico, presuntivo, de infección micobacteriana. Las micobacterias son coloreadas de rojo por la Fucsina y retienen el color a pesar de la acción del ácido y del alcohol Esta coloración es útil en la detección de bacterias del género Micobacterium en muestras de esputo. La presencia de bacilos rojos sobre fondo azul constituye un diagnóstico casi definitivo de tuberculosis. La Coloración de Ziehl-Neelsen utiliza tres reactivos. El colorante primario es la fucsina que tiñe toda la preparación de rojo brillante. Como mordiente se utiliza flameado de la preparación con el colorante. La solución decolorante elimina el colorante primario excepto el de los bacilos ácido alcohol resistente. (BAAR). Por último el azul de metileno tiñe de azul el resto de la preparación. preparación. Los BAAR se observan en rojo, todo el resto (contraste) aparece en celeste o azul. UTILIDAD
Diagnóstico de enfermedades infecciosas producidas por: a. Micobacterias
→
Micobacterium tuberculosis (Tuberculosis) y Mycobacterium Mycobacterium
leprae (Lepra). Nocardiosis (similar a tuberculosis t uberculosis)) b. Bacterias del género Nocardia → Nocardiosis y Micetoma actinomicótico (micosis subcutánea). FUNDAMENTO
Los BAAR poseen una pared celular rica en lípidos y ácidos carboxílicos (ácido micólico) que tienen la propiedad propiedad de unirse excepcionalmente excepcionalmente fuerte al colorante frio (fucsina de Ziehl) cuando se usa el calor como mordiente. Una vez que se forma este complejo colorante-pared, ni siquiera la acción conjunta del ácido y del alcohol puede deshacerlo, ya que las paredes retienen el colorante en f orma "resistente". TECNICA
Se realiza el frotis. Se aplica el colorante frio sobre la muestra y se deja reposar. Luego se emplea la llama de un mechero para calentar la muestra hasta la aparición de vapores blancos. El calor se emplea como mordiente, gracias al calor los lípidos de la pared dejan pasar el colorante para que se combine con los ácidos carboxílicos de la pared, así se forma el complejo colorante-pared. Se deja reposar y se lava con
agua. Las bacterias que no han formado el complejo en su pared (no BAAR) no retendrán el colorante, el exceso del mismo será arrastrado por el agua. Se aplica el colorante 2rio, se deja reposar y se lava con agua.
FUNCION DE: LA Fucsina-Fenicada, Acido-Alcohol, Azul de Metileno
Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido, después de la coloración con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistente. Las micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parásitos coccídeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificación de lo ácidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento aumenta la energía cinética de las moléculas del colorante lo cual también facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloración son de color rojo y la que no se ven de color azul, ya que se utiliza azul de metileno como coloración de contraste. En el método de coloración de Ziehl-Neelsen, se utilizan loas sustancias: 1.- Fucsina-fenicada (se recomienda mas esta aunque se puede utilizar cristal
violeta) 2.- Acido-alcohol (decolorante) 3.- Azul de metileno (también se puede utilizar verde de malaquita para mejor
contraste) La fucsina-fenicada debe aplicarse con calor para que el colorante penetre las paredes de las Mycobacterias, que tienen altas cadenas de lípidos y ceras. Al aplicarse el acido-alcohol, las bacterias acido-alcohol resistentes no se desteñirán, mientras que otras que tal ves se tiñeron se decoloraran, mostrando al microscopio solo las BAAR, por ultimo el azul de metileno, se aplica como colorante de contraste pero también se puede utilizar el verde de malaquita, en si la función del cristal violeta en la coloración de Ziehl-Neelsen es teñir las Mycobacterias con la aplicación del calor, pero se recomienda mejor la fucsina-fenicada.
PROCEDIMIENTO DE LA COLORACION DE ZIEHL-NEELSEN Coloración • Disponer dos varillas de vidrio en forma paralela, a una distancia de
aproximadamente 5cm entre una y otra una sobre un soporte dentro del lavabo/pileta de coloración; • Filtrar la cantidad de fucsina necesaria para las tinciones a realizar en la jornada. Si el número de baciloscopias a colorear es pequeño, se puede filtrar la fucsina
directamente cuando se la deposita sobre el extendido a través de un pequeño embudo con papel de filtro.
• Colocar sobre el soporte las láminas fijadas conservando el orden numérico con el
extendido hacia arriba y manteniendo una separación de al menos 1cm entre ellas. • Cubrir totalmente la superficie del extendido con fucsina básica fenicada recién
filtrada. Dispensar el colorante con suavidad, sin salpicar y sin tocar con el gotero o con el embudo los extendidos. • Con la llama de un hisopo embebido en alcohol calentar suavemente por debajo de
los extendidos, con movimientos de vaivén, hasta que observe que se desprenden los primeros vapores blancos. No calentar con mechero. • En caso de derrame del colorante, reponer la fucsina, no dejar secar el preparado. • En el término de aproximadamente 5 minutos calentar tres veces hasta emisión de vapores; esto es suficiente para que la fucsina penetre adecuadamente en el bacilo y
se fije a sus lípidos. No hervir la fucsina porque la pared de los bacilos puede destruirse y colorearse mal. • Con una pinza, levantar cuidadosamente la lámina portaobjetos desde el extremo
más cercano al operador. Enjuagar con abundante agua a baja presión, con un frasco o un grifo. Lavar muy suave y cuidadosamente la superficie eliminando totalmente la solución de fucsina. Girar el extendido y lavar con cuidado también la parte posterior. • Inclinar el portaobjetos para eliminar el exceso de agua y así evitar diluir los reactivos
que se utilizarán a continuación.
Decoloración • Cubrir la totalidad del extendido con solución decolorante y dejar actuar
aproximadamente 3 minutos. • Enjuagar con abundante agua a baja presión. • Verificar que el extendido se ha decolorado (las partes más gruesas del extendido a
lo sumo conservan un leve tinte rosado). Si se observan cúmulos rojos o coloración rosada intensa, volver a cubrir con solución decolorante, dejarla actuar entre 1 y 3 minutos y enjuagar nuevamente. • Eliminar el exceso de agua inclinando el portaobjetos .
Coloración de fondo • Cubrir todo el extendido con solución de azul de metileno. • Dejar actuar durante un minuto. • Enjuagar las lá minas en ambas caras con agua a baja presión y limpiar la parte
inferior con un algodón si ha quedado coloreada. • Observar si las lám inas conservan la numeración clara y visible. Si no es así volver a
numerarlas. • Dejar secar las lá minas a temperatura ambiente, apoyándolas en posición vertical en
un soporte sobre un papel absorbente. No apoyar papel absorbente sobre el extendido.
COLORACION DE ZIEHL NEELSEN
CUBRIR CON FUCSINA FILTRADA
CALENTAR HASTA EMISIÓN DE VAPORES TRES VECES DURANTE 5 MINUTOS
LAVAR CON AGUA
CUBRIR CON DECOLORANTE DURANTE 3 MINUTOS
LAVAR CON AGUA
CUBRIR CON AZUL DE METILENO DURANTE 1 MINUTO
LAVAR CON AGUA
SECAR AL AIRE
