PRACTICA 3: La Coloracion de Gram

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA PRÁCTICA NÚMERO 3

Facultad de Ciencias Médicas Cátedra de Microbiología Tercer Semestre

TECNICAS DE TINCION PARA LA MICROSCOPIA OPTICA

LA COLORACIÓN DE GRAM

REALIZADO POR: Sthefani Gualpa S. REVISADO POR: Dr. Roberto Aguirre.

Cátedra de Microbiología – Universidad Central del Ecuador

UNIDAD DE COMPETENCIA: Identi Identific fica a práct práctica icamen mente te los micro microorg organi anismo smoss patóge patógenos nos con los alteraciones orgánicas por ellos producidas: con responsabilidad y orden. ELEMENTO DE COMPETENCIA: Comprende los pasos necesarios para realizar la tinción de Gram adem además ás de reco recono noce cerr los los micr microo oorg rgan anis ismo moss Gram Gram posi positi tivo voss y negativos, al igual de la aplicabilidad clínica de la tinción con orden e iniciativa. NÚCLEOS DE CONOCIMIENTO: Técnica de tinción – La Coloración Gram. Realización de tinción por el método de Gram a partir de colonias. Visualizar al microscopio de gérmenes Gram positivos y Gram negativos. Ver la utilidad clínica de la coloración por el método de Gram. ACTIVIDADES TRABAJO AUTÓNOMO: Guía de prácticas descriptiva. Realización de una coloración Gram individual y visualización en el microscopio. CRITERIOS DE EVALUACIÓN: Comprender la aplicabilidad clínica de la tinción Gram y la morfología bacteriana en cuestión de distinción entre Gram positivas y Gram negativas.

“Aprender es como remar contra corriente: en cuanto se deja, se retrocede”. Edward Benjamin Britten (1913-1976) (1913-1976) Compositor británico.


COLORACIÓN DE GRAM. OBJETIVO: ✔ Comprender los pasos necesarios para realizar la tinción de Gram ✔ Reconocer los microorganismos Gram positivos y negativos, al igual de la aplicabilidad clínica de la tinción. FUNDAMENTOS DE LA PRÁCTICA: La tinción de Gram fue creada por Hans Christian Gram a fines del siglo XIX y puede utilizarse para separar la mayoría de las especies bact bacter eria iana nass en dos dos gran grande dess grup grupos os,, a sabe saber, r, las las que que ca capt ptan an el colorante básico, cristal violeta (es decir las bacterias gran positivas), y las que pierden ese colorante por el lavado con el decolorante alcohol o acetona (es decir las bacterias gram negativas).

TECNICAS DE TINCION PARA LA MICROSCOPIA OPTICA. Preparación del extendido: Los métodos métodos de tinción se utilizan en forma forma directa directa con las muestras muestras del paciente o se aplican a los preparados obtenidos a partir del desarrollo de los microorganismos en cultivos. Por lo general las muestras se colocan sobre el portaobjeto con un hisopo que contiene el material del paciente o con una pipeta dentro de la cual cual se encuentr encuentra a la muestr muestra a de líquid líquido o aspira aspirado do (Fig (Fig 1). El material que se va a teñir se coloca en forma de una gota (si la mues muestr tra a es liqu liquid ida) a) o se rota rota (si (si la esta esta e un hiso hisopo po)) sobr sobre e la superficie de un portaobjeto limpio y seco.



A

B

Fig 1.- frotis obtenidos por rotación de un hisopo (A) y de os ito o con conla icontaminación eta eta B de la mues muestr tra alos del del medios acien aciente te de sobr sobre e un Es importante osit evitar de cultivo; por lo

tanto, una vez que el hisopo toco la superficie de un portaobjetos no estéril no debe utilizarse para la inoculación posterior de medios de cultivo. Para la tinción tinción de los microorganis microorganismos mos que crecen en cultivos cultivos puede utilizarse una aguja estéril para transferir una pequeña cantidad del cultivo desarrollado en un medi edio solido a la super erfficie del portaobjetos. Este material se emulsiona en una gota de agua o solu soluci ción ón sali salina na 0.9% 0.9% esté estéri rill sobr sobre e el port portao aobj bjet eto. o. En ca caso so de cantidades pequeñas que puedan perderse incluso en una gota de solución fisiológica se puede utilizar n aplicador de madera estéril para obtener el material; luego este material se frota directamente sobre el portaobjetos que se va a teñir se deja secar y se fija al portao portaobje bjeto to median mediante te su coloca colocació ción n sobre sobre una una platin platina a calien caliente te (a 60⁰C) durante por lo menos 10 minutos o cubriéndolo con metanol al 95% durante 1 minuto. Para examinar los microorganismos que crecen en medio líquido se aplica una muestra aspirada del caldo de cultivo sobre el portaobjetos, se seca y se fija antes de la tinción. La preparación de los frotis varía de acuerdo con el tipo de muestra que se va a procesar y con los métodos de tinción que se van a utilizar. No obstante la regla general para la preparación de frotis es que que debe debe apli aplica cars rse e una una ca cant ntid idad ad de ma mate teri rial al sufi sufici cien ente te sobr sobre e el portaobjeto para maximizar las posibilidades de detectar y diferenciar los microorganismos. Por último, el método de tinción que se debe utilizar esta determinado por el tipo de microorganismo buscado.

TINCION DE GRAM “Aprender es como remar contra corriente: en cuanto se deja, se retrocede”. Edward Benjamin Britten (1913-1976) (1913-1976) Compositor británico.


La tinció tinción n de gram gram es la técnic técnica a princi principal pal utilizada utilizada para para el examen examen microscópico de las bacterias. Casi todas las bacterias de importancia clínica pueden detectarse con este método. Las únicas excepciones son: Los microorganismos que se hallan casi con exclusividad dentro de las células huésped (p. ej., clamidias). Los que carecen de pared celular (p. ej., micoplasmas y ureoplasmas). Los que tienen un tamaño insuficiente para ser observados por el microscopio óptico (p. ej., espiroquetas). Los que tienen una diferente composición en su pared y no captan los colorantes (p. ej., mycobacterias).

MATERIALES: ✔ Portaobjetos ✔ Cubreobjetos ✔ Asas de inoculación ✔ Mechero Bunsen ✔ Pipetas ✔ Hisopos ✔ Colorantes PROCEDIMIENTO: El procedimiento clásico de la tinción de Gram consiste en fijar el material orgánico a la superficie del portaobjetos del microscopio ya por calor o con metanol. Después de la fijación el primer paso en la tinción de Gram es la aplica aplicació ción n del color colorant ante e princi principal pal crist cristal al violet violeta a (meti (metill rosani rosanilin lina a o violeta de genciana). Luego se aplica un mordiente, el yodo de Gram (lugol), para que el colorante alcalino se una a la pared celular a través de enlaces químicos. La decoloración distingue las bacterias grampositivas de las gramnegativas. Después de la decoloración los micro microorg organi anismo smoss aparec aparecen en como como grampo gramposit sitivo ivoss retien retienen en el crista cristall violet violeta a y los gramn gramnega egativ tivos os lo pierde pierden. n. El agrega agregado do colora colorante nte de contra contraste ste safra safranin nina a (Contr (Contrati atinci nción) ón) teñirá teñirá de color color rosa rosa o rojo rojo las bacterias gramnegativas claras.



PRINCIPIO: Lass dife La difere renc ncia iass de co comp mpos osic ició ión n de las las pare parede dess de las las bact bacter eria iass grampositivas, que contienen una gruesa capa de peptidoglucano con numerosos enlaces cruzados de acido teicoico, y las paredes de las células gramnegativas, en las que la capa de peptidoglucano es más delgada, explican las diferencias de la tinción de Gram entre estos dos grupos principales de bacterias bacterias es probable que que la gran cantidad de enlaces cruzados de acido teicoico de los microorganismos gram positivos positivos contrib contribuya uya a su capacidad capacidad de resistir resistir la decoloración decoloración con alcohol.(Fig. 2) Si bien el colorante de contraste puede ser captado por los microorganismos gram positivos, su color violeta no se altera.

Fi . 2.- Estructura de aredes bacterianas GRAM +

*Los microorganism microorganismos os gram positivos positivos que perdieron la integridad integridad de la pared celular debido al tratamiento antibiótico, al envejecimiento o a la acción de enzimas autolíticas permiten que el violeta se elimine durante la decoloración y pueden aparecer como gram variables, con algunas células coloreadas de rosa y otras de violeta.



Sin embargo, con propósitos de identificación, estos microorganismos se consideran gram positivos verdaderos. Por otro otro lado, lado, las bacter bacterias ias gram gram negati negativas vas raras raras veces veces (o nunca) nunca) reti retien enen en el cris crista tall viol violet eta a si el proc proced edim imie ient nto o de tinc tinció ión n se ha realizado de manera apropiada. Las células huésped, como los eritrocitos y los leucocitos (fagocitos), pierden el cristal violeta con la decoloración y aparecen de color rosa en los frotis preparados y teñidos de manera correcta.

OBSERVACION DE LA TINCION DE GRAM. Una vez teñido el frotis se observa con el objetivo de inmersión (1.000x). Cuando el material orgánico se tiñe con Gram (p. ej., frotis directo) el portaobjetos se evalúa en busca de la presencia de células bacterianas así como de las reacciones Gram, (Fig. 3) las morfologías (p. (p. ej., ej., co coco coss y baci bacilo los) s) y la disp dispos osic ició ión n (p. (p. ej., ej., ca cade den nas pare pares, s, racimos) racimos) de células células observada observadass (Fig.4). (Fig.4). Esta informació información n a menudo menudo propor proporcio ciona na un diagno diagnosti stico co prelim prelimina inarr con respec respecto to a los agente agentess infecciosos y con frecuencia se utiliza para el tratamiento directo inicial del paciente.

Fi .3..3.- Reac Reacci cion ones es Gram Gram..



Fig 4. Clasificación de las bacterias de acuerdo a su morfología

Si bien la evaluación de la tinción de Gram del frotis directo se utiliza de ruti rutina na co como mo una una ayud ayuda a en el diag diagno nost stic ico o de las las infe infecc ccio ione ness bact bacter eria iana nas, s, es posi posibl ble e que que se dete detect cten en –y no debe deben n igno ignora rars rseehalla allazg zgo os ines inespe perrado ados per pero impo imporrtan tantes tes de otras tras etio etiolo logí gías as infecciosas infecciosas.. Por ejemplo, las células células y los elementos elementos micóticos micóticos por lo general se tiñen como grampositivos pero pueden captar el cristal violeta violeta de manera manera deficiente deficiente y aparecer aparecer como gram variables variables (p. ej., rosa rosa y violet violeta) a) o gram gram negati negativos vos.. Dado Dado que con la tinció tinción n de Gram Gram pueden detectarse otros agentes infecciosos además de las bacterias, todas las células o las estructuras inusuales observadas en el frotis deben evaluarse de nuevo antes de descartarse como no importantes.

TINC INCIÓ IÓN N DE GRA GRAM DE LAS BACTE CTERIAS IAS QUE CRE CRECEN EN CULTIVOS. CULTIVOS. (Frotis indirectos). La tinc tinció ión n de Gram Gram tamb tambié ién n dese desemp mpeñ eña a un pape papell clav clave e en la identificación de las bacterias en crecimiento en cultivos. De manera similar a los frotis directos, en los preparados a partir del crecimiento bacteriano se evalúan las reacciones de Gram, las morfologías y las “Aprender es como remar contra corriente: en cuanto se deja, se retrocede”. Edward Benjamin Britten (1913-1976) (1913-1976) Compositor británico.


disposiciones de las células bacterianas. Si se va a teñir más de una muestra en el mismo portaobjeto, puede utilizarse un lápiz de cera para crear divisiones.es útil dibujar una especie de “mapa” de ese portaobjetos de modo que los resultados de las diferentes tinciones de Gram puedan registrarse de manera organizada. Los resultados del examen del frotis se utilizaran para determinar comprobaciones ulte ulterrior iores par para la iden identi tifi fica caci ció ón y la ca carrac acte terrizac izació ión n de los los microorganismos aislados a partir de la muestra del paciente. .

BIBLIOGRAFÍA 1.Ko 1.Kon nem eman an,, E. Diag Diagn nostic stico o micr microb obio ioló lógi gico co,, Edito ditorrial ial médic édico o panamericana, 2.Jawetz Ernest, Microbiología médica, 17ª edición en español, Manual moderno, México, México 2002. 3.Bailey 3.Bailey & Scott, Scott, Diagnóstic Diagnóstico o microbioló microbiológico, gico, 11ª edición, edición, Editorial Editorial Panamericana, Buenos Aires – Argentina, 2 004. 4. Salazar Wilson, Guías de práctica de Laboratorio de Microbiología, Depart. de publicaciones de la Facultad de Ciencias Médicas, Quito – Ecuador, 2007.


PRACTICA 3: La Coloracion de Gram

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