PRACTICA Nº 4 MÉTODOS DE COLORACIÓN Marco teórico 1
Colora raci ció ón Sim Simpl ple: e:
Aquella coloración coloración en la que se utiliza sólo un colorante, el cual va a er!itir visualizar la !or"olo#$a %e los !icroor#anis!os& 2 Color loraci ció ón Gram: La %i"erenciación %e 'ra! se (asa en el color que a%quieren las (acterias cuan%o se tratan tratan con con el colora colorante nte crista cristall viole violeta ta se#ui% se#ui%o o or una soluci solución ón )o%o) )o%o)o%u o%ura% ra%a a %e otasio, otasio, ara lue#o lue#o so!eterlas so!eterlas a una %ecolora %ecoloración ción %esu*s %esu*s %e la cual se usa una coloraci coloración ón %e %e contras contraste, te,
casi sie!re sie!re sa"ran sa"ranina ina&& Las (acterias (acterias
#ra!+os #ra!+ositiva itivass
coloración azul o !ora%a- son resistentes a la %ecoloración ) conservan el co!le.o cristal cristal violeta+)o% violeta+)o%o, o, los !icroor#an !icroor#anis!o is!oss #ra!+ne# #ra!+ne#ativo ativos, s, to!an la coloració coloración n %e contraste coloración rosa o ro.a-& 3 Colora Coloración ción Ácido Ácido – Resis Resisten tente te (Colora (Coloració ción n de Ziel Ziel Neelse Neelsen!: n!: En este !*to%o %e tinción, el colorante ri!ario, "ucsina /ci%a, se "or!ula con "enol ara er!itir el aso a trav*s %e las are%es celulares %e las !ico(acterias& El ortao(.eto se calienta ara "acilitar la enetración ) se utiliza alco0ol et$lico co!o %ecolorante& %ecolorante& Sin e!(ar#o, el reactivo se reara con /ci%o clor0$%rico ara a)u%ar a la %ecoloración %ecoloración %e las c*lulas que no son /ci%o 1 resistentes& 4
Colo Co lora raci ción ón de Es Espo pora ras: s:
2ara la o(servación %e esoras, es necesario que el colorante enetre la are% %e la esora esora,, la cual cual es relat relativa iva!en !ente te i!er! i!er!ea( ea(le le,, razón razón or la que que se neces necesita ita %e calenta!iento& " Colo Colora raci ción ón Ne Ne#a #ati ti$a $a:: La t*cnica %e la tinción ne#ativa incorora !ateriales tales co!o la ni#rosina o la tinta c0ina, que al estar co!uesta %e art$culas %e!asia%o #ran%es ara enetrar en una c*lula, er!iten o(servar al#unos !icroor#anis!os que er!anecen sin te3ir ) que resaltan so(re un "on%o oscuro4 se utiliza rincial!ente ara o(servar la c/sula (acteriana& 4% 2 Com&etencias Caacita ) a%iestra al estu%iante ara que el- la-5 -
Realice !anual!ente !anual!ente !*to%os %e tinción 0a(ituales 0a(ituales usa%os en la rearación %e l/!inas %e o(servación
-
Descri(a !inuciosa!ente !inuciosa!ente sus o(servaciones, o(servaciones, al !icroscoio
4%3
'ateriales e)*i&os C*lti$os +acterianos: -
Cultivo %e Escherichia coli
-
Cultivo %e Staphylococcus aureus
-
Cultivo %e Klebsiella
L/!ina "i.a%a con "rotis %e Mycobacterium tuberculosis ,
Coloración sim&le: +
Azul %e Metileno
2
Coloración Gram: +
6ioleta %e #enciana colorante ri!ario-
+
Lu#ol !or%iente-
+
alco0ol 1 acetona %ecolorante-
+
7ucsina (/sica colorante %e contraste
3%
Coloración Ácido – Resistente:
+
7ucsina "enica%a al 89 colorante ri!ario-
+
Alco0ol 1 /ci%o %ecolorante-
+
Azul %e !etileno colorante %e contraste4% Coloración de -s&oras:
+
Solución %e azul %e !etileno
+
Solución satura%a alco0ólica %e eosina
5. Coloración negatia:
+
Tinta c0ina
4
Procedimiento
, Coloración sim&le: +
2reara un "rotis a artir %el cultivo roorciona%o&
+
7i.a al calor& +
Cu(re el "rotis con el colorante Azul %e Metileno ) %e.a actuar or : a 8 !inutos&
+
Lava con a#ua ) %e.a secar&
+
O(serva al !icroscoio con o(.etivo %e in!ersión&
2 Coloración Gram: +
2reara "rotices %e cultivos %e E. coli y S. aureus&
+
De.a secar al aire ) "i.a con calor&
+
Cu(re los "rotices con reactivo %e cristal violeta %urante un !inuto&
+
Lava los ortao(.etos con a#ua corriente %urante 8 se#un%os& +Cu(re el "rotis con la solución %e lu#ol ) %e.a actuar %urante ; !inutos&
+Lava con a#ua corriente, ) alica lenta!ente el alco0ol 1 acetona ) se#uir/ a#re#an%o 0asta que la tintura )a no "lu)a %el "rotis& +
Lava in!e%iata!ente con a#ua corriente&
+
Cu(rir/ el "rotis con la solución %e sa"ranina %urante :< se#un%os&
+
Lava con a#ua corriente ) %e.a secar la rearación&
+
O(serva al !icroscoio utilizan%o el lente %e in!ersión&
3 Coloración Ácido – Resistente: +
Cu(re el "rotis roorciona%o con "ucsina "enica%a al 89 car(ol"ucsina- ) %e.arlo reosar %e :< a =< se#un%os antes %e calentarlo&
+
Calienta la rearación con suavi%a%, 0acien%o asar el !ec0ero %e alco0ol or %e(a.o %el ortao(.eto& Se#uir calentan%o 0asta que se o(serve el %esren%i!iento %e vaores& Evitar que el colorante 0ierva& Reetir ; veces !/s&
+
En"r$a ) lava con a#ua corriente&
+
Decolora con alco0ol 1 /ci%o 0asta que no arrastre colorante&
+
Lava con a#ua corriente&
+
Cu(rir/ el "rotis con azul %e !etileno, %urante > !inuto&
+
Lava con a#ua corriente&
+
De.a secar al aire& +
O(serva al !icroscoio con lente %e in!ersión& Las (acterias /ci%o 1 alco0ol resistentes se ti3en %e ro.o ) los %e!/s !icroor#anis!os %e color azul
4
Coloración de -s&oras: +
?a#a un "rotis "ino ) "i.e a la lla!a& +
Cu(re con azul %e !etileno ) calienta 0asta 0ervir en "or!a inter!itente or > !inuto&
+
Lava con a#ua %estila%a& +Cu(re con una !ezcla %e solución satura%a alco0ólica %e Eosina or :< se#un%os&
+ +
Lava con a#ua %estila%a ) %e.a secar al aire&
E@a!ina al !icroscoio con lente %e in!ersión&
"
Coloración ne#ati$a: +
Coloca varias asa%as %e cultivo en un ortao(.etos li!io, cerca %e uno %e los (or%es&
+
Coloca un volu!en i#ual %e tinta c0ina cerca %el cultivo& +
Mezcla (ien con el asa ) lue#o e@tien%e la !ezcla a lo lar#o %el ortao(.etos, utilizan%o la t*cnica %el "rotis san#u$neo&
+
De.a secar el "rotis&
+
Cu(re con sa"ranina %urante >< se#un%os, lue#o en.ua#a con cui%a%o ) %e.a secar al aire&
+
O(serva al !icroscoio con lente %e in!ersión& Al e@a!inar la rearación, la c/sula aarecer/ co!o una zona transarente que ro%ea a la are% celular&
+ 'ateriales e)*i&os Cultivo %e Esc0eric0ia coli Cultivo %e Sta0)lococcus aureus
Alco0ol+ cetona
Microscoio
A#ua %estila%a
Tu(os %e ensa)o
Cultivo %e le(siella
Lu#ol
Ba"ranina
Cristal violeta
2laca 2etri ) soorte %e varillas %e vi%rio Mec0ero %e (unsen
PR.C-/I'I-NT.:
2rearar un "rontice %e cultivos %e E. coli o de S. aureus&& A#re#ar una #ota %e
a#ua co#ien%o un !icroor#anis!o ) e@an%irlo or to%o el ortao(.eto, "la!ear en el !ec0ero %e (unsen 0asta que se seque&
Lue#o el ortao(.eto se colocó en un soorte %e varillas %e vi%rio ) se roce%ió a cu(rir los el ortao(.eto con reactivo %e cristal violeta %urante un !inuto& lue#o se en.ua#o con el a#ua %estila%a
na vez realiza%o esto se cu(re el "rontis con la solución %e lu#ol ) %e.a actuar %urante ; !inutos& Lue#o se vuelve
a
%estila%a&
en.ua#ar
con
el
a#ua
Alicar lenta!ente el alco0ol 1 acetona ) se#uir/ a#re#an%o 0asta que la tintura )a no "lu)a %el "rotis& lavar in!e%iata!ente con a#ua %estila%a&&
Cu(rir/ el "rotis con la solución %e
sa"ranina
se#un%os& %estila%a
%urante
Lava )
rearación&
%e.a
con
:< a#ua
secar
la
O(serva utilizan%o
al el
!icroscoio lente
%e
in!ersión&
OBSERVACIONES:
Se i%enti"icaron (acilos 'ra! ne#ativos
C0-1TI.NARI.
> Fu* i!ortancia tiene la are% celular (acteriana en la coloración %e 'ra!G La are% celular es resonsa(le %e lo que le suce%e al colorante utiliza%o en la Tinción %e 'ra!& La roie%a% %e te3irse o no %e violeta oscuro 'ra! ositivas o 'ra! ne#ativas- or esta coloración es un criterio %e clasi"icación i!ortante correlaciona(le con otras roie%a%es (acterianas &Las 'ra!+ositivas co!o las 'ra!+ne#ativas catan la !is!a canti%a% %e cristal violeta C6- e io%o I-& El co!le.o C6+I sin e!(ar#o es atraa%o %entro %e la c*lula 'ra! ositiva or la %es0i%ratación ) la re%ucción %el ta!a3o %e los oros %e la are% resultante %el roceso %e lava%o con solvente& En contraste en las 'ra! ne#ativas la "ina ) ro(a(le!ente %iscontinua- caa %e eti%o#licano no i!i%e la e@tracción or el solvente %el co!le.o& &
; Cu/les son las %i"erencias qu$!icas i!ortantes que e@lican el esta%o /ci%o+ resistenteG Tinción %i"erencial5 M*to%o /ci%o resistente BIE?L+NEELSENLas are%es celulares %e ciertos ar/sitos ) (acterias contienen /ci%os #rasos /ci%os !icólicos- %e ca%ena lar#a 8< a H< /to!os %e car(ono- que les con"ieren la roie%a% %e resistir la %ecolorac$ón con alco0ol+/ci%o, %esu*s %e la tinción con colorantes (/sicos& 2or esto se %eno!inan /ci%o+alco0ol resistentes& El "rotis se ti3e %urante unos 8 !in con 7ucsina "enica%a alican%o calor suave& Lavar con a#ua& Decolorar con alco0ol et$lico H89 con un :9 %e Cl? concentra%o& Lavar ) te3ir %urante :<+=< se# con Azul %e Metileno color %e contraste-& Lavar ) secar 2ROCEDIMIENTO5
M.
M. TUBERCULOSIS
