LA TINCIÓN DE GRAM Es la tinción diferencial más utilizada en Bacteriología pues permite separar las bacterias en dos grandes grupos, las Grampositivas y las Gram-negativas. La tinción de Gram reuiere cuatro soluciones! colora rant nte e bási básico co ue ue en cont contac acto to con con las las c"lu c"lula las s carg cargada adas s 1. Prime Primerr colora colorante nte. Es un colo negativamente, reacciona con ellas coloreándolas. El más utilizado es el cristal violeta.
2. Solución mordiente. #i$a las tinciones y aumenta la afinidad entre el colorante y las c"lulas. Los mordie mordiente ntes s emple empleado ados s suelen suelen ser sales sales metáli metálicas cas,, ácidos ácidos o bases, bases, como, como, por e$emp e$emplo, lo, una solución diluida de yodo.
. A!ente decolorante. Es un disolvente orgánico, por e$emplo, alco%ol acetona &'!'(. ". Colorante de contra#te. Es un colorante básico de distinto color ue el primer colorante, como, por e$emplo, la safranina. Los dos grupos bacterianos a los ue anteriormente nos referíamos difieren en el color con el ue finalmente aparecen. Las bacterias Gram positivas se te)irán de azul por el cristal violeta y no perderán esta coloración durante los pasos sucesivos. Las bacterias Gram negativas perderán la coloración inicial del cristal violeta en los siguientes pasos y se te)irán de rosa debido a la safranina. La diferencia está determinada por la composición de su envoltura celular. Las bacterias gram positivas poseen una malla de peptidoglicano en su parte más e*terna, mientras ue las bacterias gram negativas, recubriendo una fina capa de peptidoglicano, presentan una membrana e*terna ue envuelve toda la c"lula.
Pr$ctica# de Micro%iolo!&a Cl&nica El m"todo de tinción es el siguiente! '. +e prepara el frotis, se seca y se fi$a. . +e cubre con cristal violeta durante un minuto. . Lavar suavemente con agua destilada para eliminar el e*ceso de colorante. . +e traza con lugol un minuto. El lugol act/a como mordiente aumentando la afinidad del colorante por la bacteria. 0. Lavar con agua el e*ceso de lugol. 1. +e gotea alco%ol-acetona de forma continua %asta ue la preparación de$e de perder color y se lava enseguida con agua abundante. 2. +e cubre la preparación con un colorante de contraste, como la safranina, durante un minuto. 3. +e lava con agua y se seca al aire, observándose a continuación con el ob$etivo de inmersión. 4( 5bserv 5bservaci ación ón de las tincio tinciones nes de bacter bacterias ias al micros microscop copio. io. Las bacter bacterias ias Gram-p Gram-posi ositiv tivas as presentarán una coloración violeta mientras ue las Gram-negativas la presentarán ro$a o rosa. La identific identificación ación de las bacterias bacterias Gram-posi Gram-positiva tivas s puede ser problemáti problemática, ca, solamente solamente cuando cuando las bacterias Grampositivas se encuentran en crecimiento e*ponencial &cultivos $óvenes( la reacción es clara6 en fase estacionaria &cultivos vie$os( las bacterias Gram-positivas pueden parecer Gramnegativas.
Tinción Ma'(Gr)n*ald+Giem#a en ,roti# #an!u&neo
Com-onente# de la tinción Esta t"cnica combina los principios de coloración desarrollados por 7ay Grun8ald y Giemsa, usando soluciones colorantes! 9
+olución 7ay Grun8ald! :ontiene eosina &colorante aniónico( y ;zul de metileno & colorante catiónico(, disueltos en metanol.
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+olución Giemsa! :ontiene Eosina, ;zul de metileno y productos de o*idación de este segundo compuesto.
Princi-io de la tinción Los componentes celulares se clasifican por e sta tinción en! 9
:omponentes aniónicos & ácidos(! ;l unirse a los tintes catiónicos se ti)en en tonos azules. +on llamados
?;, @?;, proteínas, mitocondrias, ribosomas.
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:omponentes catiónicos &básicos(! +e unen a Eosina, ti)endo en variados tonos ro$os y naran$a. +e les llama acidófilos o eosinófilos. E$! Aemoglobina.
/a#e# de la tinción Ma' Grun*ald(Giem#a 1° Fijación: +umergir los frotis secos por minutos en solución de 7ay Grun8ald. 2° Lavado y rehidratación: >e$ar por ' minuto en agua destilada y escurrir el agua. 3° Tinción con Giemsa: +umergir por '0 minutos en Giemsa. Luego retirar y escurrir. osteriormente se retiran los frotis montados y se de$an secar para su posterior lectura al microscopio óptico con aumento 'CCD.
0%#eración al micro#co-io na vez te)idos los frotis y observados con ob$etivo de inmersión con aceite &aumento 'CCD( al microscopio se puede distinguir! 9
?/cleos! ;zul-p/rpura
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:itoplasma! Fioleta pálido-marrón
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Eritrocitos! @osado
9
Gránulos de neutrófilos! Fioleta-marrón
9
Gránulos de eosinófilos! ?aran$a
9
Gránulos de basófilos! ;zul-negro
9
Gránulos de linfocitos! /rpura
Princi-ale# cuadro# identi,ica%le# 9
;nemia! :oncentración disminuida de eritrocitos en sangre. >ebe ser complementado para informarse con niveles de #ierro s"rico y %ematocrito para conocer su causa.
9
7icrocitosis! >isminución del tama)o normal de los eritrocitos, observable en anemia ferrop"nica.
9
Aipocromía! Eritrocitos de tonalidad pálida, con aumento de la claridad central.
9
Leucocitosis! ;umento de leucocitos en sangre, originada principalmente en caso de infecciones.
Identi,icación de cuadro# mali!no# en ,roti# #an!u&neo +i el ecnólogo identifica en el paciente alguna c"lula sospec%osa, como en el caso de observar la#to# en #an!re -eri,3rica, y se sospec%a de alg/n tipo de leucemia u otra enfermedad %ematológica se informa al clínico para solicitar nuevamente un e*amen o indagar con otro tipo de procedimientos, como mielograma o biopsia medular o linfática seg/n sea el caso. Estos datos deben ser complementados con el estado del paciente y evaluación gen"tica. Es fundamental informar %allazgos de este tipo con la mayor precisión y rapidez posible para atender de forma oportuna al paciente.
Par$#ito# identi,ica%le# en ,roti# ambi"n se puede identificar por frotis enfermedades parasitarias como! 9
Enfermedad de :%agas
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7alaria
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o*oplasmosis
9
>engue
En este caso el ecnólogo informa inmediatamente al m"dico el %allazgo identificado y se solicitan e*ámenes serológicos para confirmar el cuadro ue padece el paciente, para tomar medidas rápidamente para iniciar un pronto tratamiento y cuidado en estos casos ue pueden ser muy graves.
USO Equipo para coloración de bacilos ácido-alcohol resistentes en muestras clínicas y/o a partir de cultivos microbianos. FUNDAMENTO La propiedad que presentan algunas bacterias de resistir la decoloración con ácidos fuertes después de ser coloreadas con solución de fucsina caliente permite reunirlas ba!o la denominación general de bacterias "ácidoresistentes# o "ácido-alcohol resistentes#. La ácido-alcohol resistencia es la capacidad de incorporar ciertos colorantes y retenerlos después de someterlos a la acción de ácidos y alcohol y está determinada por la presencia en la pared celular de los ácidos micólicos que son ácidos grasos de cadenas rami$cadas de alto peso molecular %&' a (' átomos de carbono). Las micobacterias son bacilos ácido-alcohol resistentes cortos ligeramente curvos. El género *ycobacterium incluido en esta clasi$cación comprende especies patógenas para el hombre animales y especies sapró$tas. El grado de "ácidoalcohol resistencia# es variable entre las especies de este género y está relacionado muchas veces con las condiciones culturales no pudiendo utili+arse esta diferencia para distinguirlos entre sí. Los bacilos "ácido-alcohol resistentes# %,) se observan de color ro!o al ser coloreados con los colorantes para iehl 0eelsen mientras que otros gérmenes y células toman distintos tonos de a+ul debido al a+ul de metileno que se utili+a como colorante de contraste. La coloración de iehl 0eelsen consituye una técnica sencilla rápida y económica de ba!a sensibilidad pero es una valiosa herramienta para detectar los casos de tuberculosis pulmonar. Contenido y composición Ziehl Neelsen Equipo 1ódigo ,233&245 6 7ucsina para iehl 0eelsen8 1arbolfucsina8 envase 9 2'' ml. 6 :ecolorante para iehl 0eelsen8 solución de alcohol ácido8 envase 9 2'' ml. 6 +ul de *etileno para iehl 0eelsen8 envase por 2'' ml
Fijado del extendido: *ediante calentamiento suave ;ameándolo sobre la llama. Esto se efect1. 6
Coloación: 1olocar un peque?o tro+o de papel de $ltro un poco más largo que el tama- ?o del preparado sobre el portaob!eto. !mpotante: el papel de $ltro tiene que estar por encima del e9tendido. 1ubrir el e9tendido con 7ucsina para iehl 0eelsen %carbolfucsina). 7lamear por deba!o del portaob!eto hasta el desprendimiento de vapores blancos %evitar
que se produ+ca la ebullición por e9ceso de calor). :e!ar enfriar @ minutos y repetir el ;ameado hasta nuevo desprendimiento de vapores blancos. :e!ar enfriar @ minutos. 1uando esté frio mediante el uso de pin+as quitar y descartar el papel de $ltro. - Lavar con agua corriente. - 1ubrir con :ecolorante para iehl 0eelsen. :e!ar 5 minutos. eali+ar sucesivos lavados hasta que no se desprenda mas colorante %apro9imadamente 5 minutosA pero en el caso de preparados más gruesos puede requerirse mayor tiempo). - Lavar con agua corriente. - 1ubrir con +ul de *etileno para iehl 0eelsen. :e!ar =' segundos. - Lavar con agua corriente durante =' segundos. - Becar el e9tendido.
!ntepetación de los es"ltados 1ubrir el e9tendido con una gota de aceite de inmersión y observar al microscopio óptico con aumento 2'''C. Dbservar al microscopio no menos de 2'' campos. Los "bacilos ácido-alcohol resistentes# %,) aparecen de color ro!o sobre un fondo a+ul claro mientras que otros gérmenes o células toman distintas tonalidades de a+ul.
