Tinción de Ziehl Neelsen La tinción de Ziehl-Neelsen (BAAR) es una técnica de tinción diferencial rápida y económica, para la identificación de microorganismos patógenos, por ejemplo M. tuberculosis. Fue descrita por primera vez por dos médicos alemanes, Franz Ziehl (1859 a 1926), un bacteriólogo y Friedrich Neelsen (1854 ( 1854 to 1894), un patólogo. 1.- Fundamento
Este método se basa en que las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácido graso|ácidos grasos (por ejemplo, el ácido micólico) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistencia|bacilos ácido-alcohol resistentes o BAAR. Las Mycobacterium|micobacterias como Mycobacterium tuberculosis|M. tuberculosis y Mycobacterium marinum|M. marinum y los parásitos coco (bacteria)|coccídeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de ZiehlNeelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese l a pared bacteriana que contiene ceras. 2.- Técnica
Esta técnica puede realizarse tanto en muestras histológicas como citológicas. 2.1 - Variante histológica
Para demostrar la presencia de BAAR en cortes de tejido en parafina. Los reactivos necesarios para su realización son los siguientes: Ácido periódico 5% Carbol fucsina de Ziehl (fucsina fenicada). Preparar mezclando en el orden dado: a) 0,5 0,5 g fuc fucsi sina na bási básica ca b) 50 cc cc agu agua a dest destililad ada a c) 5 cc cc eta etano noll abs absol olut uto o d) 2,5 g crist cristale aless de fenol fenol derre derretid tidos os Hematoxilina Alcohol ácido 1%: a) Alcohol de 70º b) Ácido clorhídrico El procedimiento es el siguiente: Desparafinar e hidratar los cortes Ácido periódico 5%, 10 min Lavar con agua destilada Fucsina fenicada, 15 min Decolorar en alcohol ácido al 1% Lavar con agua destilada Hematoxilina, 10 min Azulidificar con, por ejemplo, carbonato de litio Deshidratar, aclarar y montar preparaciones • • • • • • • • •
2.2 - Resultados
BAAR: rojo. Núcleos: azul. 2.3 - Variante clásica o "en caliente"
Ésta y la siguiente variantes son para preparaciones citológicas. 1) Hacer un frotis de la muestra de esputo. I. La fijación al calor asegurará de que el frotis quede adherido al portaobjetos. Un frotis muy delgado puede darle resultados falsamente negativos y un frotis muy grueso puede desprenderse del portaobjetos durante la tinción. II. Utilizando pinzas, coloque los portaobjetos en una gradilla de tinción con los extendidos hacia arriba. Coloque todos los portaobjetos orientados uniformemente, con el frotis hacia arriba. Nunca tiña más de 12 portaobjetos a la vez. 2) Dejar el frotis sobre el puente de tinción. 3) Aplicar fucsina-fenicada. III. Deje que el colorante permanezca sobre los portaobjetos durante 5 minutos. Mantenga el calor durante este período. 4) Calentar con un mechero hasta la emisión de vapores (3-5 minutos). I. Se requiere el tiempo adecuado para que la fucsina fenicada penetre y tiña la pared celular de la bacteria. No deje que hierva o se seque el colorante. II. Lave suavemente el colorante de cada portaobjetos con agua corriente fría hasta que toda la tinción libre quede lavada. Lave suavemente de manera que el extendido no se barra del portaobjetos. Retire el exceso de agua. 5) Decolorar con alcohol-ácido. III. Cubra cada portaobjetos con la solución decolorante, tal como alcohol ácido y manténgalo sobre el portaobjetos durante 3 minutos. Si no se decolora suficientemente, el contenido del esputo que no son bacilos TBC puede permanecer teñido. Enjuague con agua una vez más los portaobjetos y quite el exceso de agua. Si los portaobjetos aún están rosa, aplique una cantidad adicional de la solución decolorante de 1 a 3 minutos. 6) Aplicar azul de metileno (1 minuto). I. Aplique la solución de contraste, azul de metileno, durante 1 minuto. 7) Enjuagar con agua I. Vuelva a enjuagar con un leve chorro de agua e incline cada portaobjetos hasta drenar el exceso de agua. Finalmente, coloque cada portaobjetos en una gradilla a que sequen al aire. II. Ahora coloquele una pequeñita gota de aceite de inmersión y haga la observación al microscopio con 10 x 100
2.4 - En "frío" o o o
o o o o
Hacer un frotis. Dejarlo en el puente de tinción. Aplicar fucsina-fenicada (solución con fenol y mayor concentración de fucsina). Dejar en vasos coplin durante 20 minutos. Decolorar con alcohol acido. Lavar con agua del grifo. Contrastar con azul de metileno
2.5 - Algunos microorganismos ácido-alcohol resistentes Mycobacterium: fuertemente ácido-alcohol resistente. Nocardia y Actinomices: débilmente ácido-alcohol resistente.
Parásitos coccídeos (Cryptosporidium) de muestras [fecales].
