c ÷Y
1.Y Mengisolasi DNA dari rambut 2.Y Melakukan isolasi DNA dari rambut dan mengamplifikasinya dengan teknik PCR 3.Y Mempelajari teknik pemisahan protein berdasarkan perbedaan berat molekul dengan menggunakan elektroforesis gel poliakrilamid SDS.
÷÷ Y ÷ ÷ ÷ DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitokondria dan kloroplas. Perbedaan di antara ketiganya adalah: DNA nukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu, DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Hal ini sangat berbeda dengan DNA nukleus yang memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot berbeda dengan struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear dan memiliki protein histon (Klug & Cummings 1994: 315--316; Raven & Johnson 2002: 94). DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan komponenkomponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan pasangan basa. Pasangan basa pada DNA terdiri atas dua macam, yaitu basa purin dan pirimidin. Basa purin terdiri atas adenin (A) dan guanin (G) yang memiliki struktur cincin-ganda, sedangkan basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan timin (T) yang memiliki struktur cincin-tunggal. Ketika Guanin berikatan dengan Sitosin, maka akan terbentuk tiga ikatan hidrogen, sedangkan ketika Adenin berikatan dengan Timin maka hanya akan terbentuk dua ikatan hidrogen. Satu komponen pembangun (building block) DNA terdiri atas satu gula pentosa, satu gugus fosfat dan satu pasang basa yang disebut nukleotida (Lewis 2003: 176--178). 1|Page
c DNA terdapat pada seluruh jaringan dan cairan tubuh. Oleh karena itu DNA genom dapat diisolasi dari semua bahan biologis yang mengandung selberinti, seperti darah, semen, rambut, tulang, liur dan lain-lain. Bahan yang paling sering digunakan untuk tujuan isolasi DNA adalah darah dan rambut beserta akarnya, karena kedua bahan tersebut relatif mudah diperoleh. DNA genom yang diisolasi dapat digunakan untuk identifikasi DNA suatu organisme, baik dengan metode PCR ( polymerase chain reaction) atau menggunakan enzim endonuklease restriksi (͟DNA fingerprinting͟). Hasil pemeriksaan dari kedua teknik tersebut kemudian dapat digunakan untuk diagnosis penyakit infeksi yang disebabkan oleh virus atau bakteri, mendeteksiadanya mutasi gen yang menimbulkan penyakit keganasan, penyakit herediter, menentukan jenis kelamin prenatal serta sebagai alat bantu forensik dalam bidang kedokteran. Darah (whole blood) dan sumsum tulang mamalia mengandung baik sel-sel berinti (sel darah putih) maupun sel-sel tidak berinti (sel darah merah). Untuk mengisolasi DNA dari darah dan sumsum tulang, sel darah merah yang tidak mengandung DNA genom harus dilisiskan dahulu agar dapat dipisahkan dari sel darah putih. Sel-sel darah putih yang sudah dipisahkan kemudian dilisiskan dengan bantuan bahan pengawet DNA yaitu, deterjen anionik yang dapat melarutkan komponen seluler. Bahan pengawet DNA juga dapatmengurangi aktivitas DNAse yang terdapat di dalam sel. Bila perlu dapat ditambahkan RNAse untuk menyingkirkan kontaminasi RNA. Selanjutnya dengan presitasi garam, DNA genom dipisahkan dari protein plasma dan inti. Akhirnya DNA genom diisolasi dengan presipitasi dengan alkohol dan pelarutan kembali endapan yang terbentuk dari larutan dapar yang mengandung suatu bahan pengawet DNA. Hasil isolasi DNA dikatakan baik apabila didapatkan DNA yang murni dan utuh Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsisp isolais DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar ½|Page
c akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung (Mader 193). Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell 2002). Isolasi DNA dengan teknik sentrifugasi akan mengendapkan DNA. Supaya hasil isolasi berupa DNA murni yang tidak tercampur dengan molekul-molekul lain maka dalam proses isolasinya dicampurkan berbagai macam larutan. Larutan A berfungsi sebagai resuspensi yaitu penggabungan kembali pelet yang telah terbentuk dengan larutan yang dicampurkan. Selain itu larutan A juga berfungsi sebagai buffer dan pengkelat. Pemilihan buffer tersebut dilihat dari kemampuan buffer menghasilhkan arus listrik. Larutan B yang terdiri atas SDS dan NaOH berfungsi sebagai larutan pelisis. NaOH sendiri dapat mendenaturasi protein. Sedangkan larutan C befrungsi untuk merenarutasikan kembali. Etanol 70% yang digunakan dalam proses isolasi berfungsi untuk mengeluarkan endapan garam karena Na+ bermuatan positif dan DNA bermuatan negatif. Larutan ddH2O yang ditambahkan berfungsi agar endapan DNA yang dihasilkan didapat dengan konsentrasi yang cukup tinggi. Larutan di vortex untuk memudahkan bakteri tersuspensi. Bakteri yang telah diendapkan tersebut kana lisis dengan penambahan larutan buffer. Agar proses lisisnya bakteri sempurna maka larutan dibolak-balik secara halus. Bakteri yang telah lisis ini ditandai dengan munculnya lendir. Ciran DNA yang dihasilkan kemudina dipisahkan dari endapannya. Cairan ini ditambahkan RNAse untuk melisiskan RNA supaya hasil yang diisolasi berupa DNA murni. DNA yang telah diisolasi diuji kualitas dan kuantitasnya melalui elektroforesis dan spektrofotometer. Elektroforesis memisahkan DNA, RNA, dan protein berdasarkan bobot molekul dan muatanya dengan menggunakan media pemisah. DNA bermuatan negatif sehingga pada elektroforesis DNA akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan pergerakan ini tergantung pada ukuran molekul DNA, kerapatan media gel yang dilalui DNA, serta arus listrik yang diberikan untuk bermigrasi molekul DNA. Sebelum proses elektroforesis suspensi DNA dicampur dengan peyangga muatan berwarna .
ë|Page
c Penambahan warna ini berfungsi untuk menambah densitas sehingga DNA bearada di bagian bawah sumur, selain itu pewarna ini digunakan untuk memudahkan meletakan contoh DNA ke dalam sumur dan bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan sehingga dapat digunakan sebagai tanda migrasi DNA. DNA hasil elektroforesis yang terlihat di atas lampu UV dapat dilihat pergerakannya. Hasil elektroforesis DNA total menunjukkan adanya pita-pita DNA yang diisolasi dari bakteri á yang kemungkinan adalah DNA plasmid. Hal ini dapat dilihat dari pergerakannya yang tinggi. Pergerakan DNA di agarose berhubungan dengan besar molekul. Sehingga pergerakan yang tinggi ini menunjukan ukuran DNA yang tidak terlalu besar. Plasmid merupakan DNA sirkuler yang ukurannya relatif kecil. Hal ini menunjukkan bahwa DNA total yang diisolasi mempunyai keutuhan yang tinggi. Akan tetapi pada beberapa kelompok pergerakan DNA tiadak dapat diamati. Kejadian ini dapat terjadi karena kesalahan teknis saat memasukan DNA ke dalam sumur gel agarose. Bisa jadi DNA yang dimasukan tidak masuk benar-benar ke dalam sumur gel sehingga saat elektroforesis DNA tidak bergerak. Selain itu kesalahan juga dapat terjadi karena DNA yang telah masuk ke dalam sumur tersedot kembali masuk ke dalam pipet mikro. Sehingga sumur tidak berisi DNA. Kuantifikasi DNA total dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm menunjukkan bahwa rendemen isolasi DNA konsentrasinya berkisar antara 19610 ng/ µL dan 19800 ng/ µL tiap 1500 µL bahan biakan á Tingkat kemurnian DNA plasmid yang diisolasi dilihat dari nilai absorban pada panjang gelombang 260 nm dibadi nilai absorban pada panjang gelombang 280 nm. Kemurnian DNA plasmid kelompok 8 menunjukan hasil sebesar 1,115. Nilai ini belim termasuk nilai DNA murni karena isolasi DNA murni nilainya lebih besar atau sama dengan 1,8.
|Page
c p p Reaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal sebagai PCR ( ) merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu relatif singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini dirintis oleh Kary Mullis pada tahun 1983 dan ia memperoleh hadiah Nobel pada tahun 1994 berkat temuannya tersebut. Penerapan PCR banyak dilakukan di bidang biokimia dan biologi molekular karena relatif murah dan hanya memerlukan jumlah sampel yang kecil.
Secara prinsip, PCR merupakan proses yang diulang-ulang antara 20ʹ30 kali siklus. Setiap siklus terdiri atas tiga tahap. Berikut adalah tiga tahap bekerjanya PCR dalam satu siklus: 1.Y Tahap peleburan ( ) atau denaturasi. Pada tahap ini (berlangsung pada suhu tinggi, 94ʹ96 °C) ikatan hidrogen DNA terputus (denaturasi) dan DNA menjadi berberkas tunggal. Biasanya pada tahap awal PCR tahap ini dilakukan agak lama (sampai 5 menit) untuk memastikan semua berkas DNA terpisah. Pemisahan ini menyebabkan DNA tidak stabil dan siap menjadi templat (patokan) bagi primer. Durasi tahap ini 1ʹ2 menit. 2.Y Tahap penempelan atau . Primer menempel pada bagian DNA templat yang komplementer urutan basanya. Ini dilakukan pada suhu antara 45ʹ60 °C. Penempelan -|Page
c ini bersifat spesifik. Suhu yang tidak tepat menyebabkan tidak terjadinya penempelan atau primer menempel di sembarang tempat. Durasi tahap ini 1ʹ2 menit. 3.Y Tahap pemanjangan atau elongasi. Suhu untuk proses ini tergantung dari jenis DNA polimerase (ditunjukkan oleh P pada gambar) yang dipakai. Dengan Taq-polimerase, proses ini biasanya dilakukan pada suhu 76 °C. Durasi tahap ini biasanya 1 menit. Lepas tahap 3, siklus diulang kembali mulai tahap 1. Akibat denaturasi dan renaturasi, beberapa berkas baru (berwarna hijau) menjadi templat bagi primer lain. Akhirnya terdapat berkas DNA yang panjangnya dibatasi oleh primer yang dipakai. Jumlah DNA yang dihasilkan berlimpah karena penambahan terjadi secara eksponensial. Daerah target yang berupa DNA untai ganda dipisahkan secara denaturasi termal pada suhu 94-960C menjadi untai DNA tunggal. Temperatur kemudian diturunkan agar primer menempel pada daerah spesifik DNA target untai tunggal. Suhu untuk tergantung pada Tm ( ) dari hibrida antara primer-cetakan. Pada umumnya seseorang menggunakan program
untuk memprediksi Tm yaitu berdasarkan
urutan primer dan konsentrasinya, serta konsentrasi garam secara keseluruhan. Suhu terbaik ditentukan dengan optimasi. DNA polimerase kemudian digunakan untuk pemanjangan primer dengan adanya dNTP dan buffer yang cocok. Pemanjangan primer terjadi pada suhu 720C untuk kebanyakan cetakan. Dengan cara demikian akan dihasilkan duplikat daerah target DNA untai ganda. Begitu siklus berlangsung, maka cetakan asli maupun kopi terget (hasil amplifikasi) berperan sebagai substrat untuk reaksi denaturasi, dan pemanjangan primer. Proses siklus ini diulang sebanyak 20-40 kali sampai diperoleh DNA target untai ganda yang dapat diamati secara jelas pada elektroforesis gel agarosa (Newton and Graham, 1994). Jumlah siklus optimum tergantung pada kadar DNA target. Jumlah siklus yang terlalu banyak akan meningkatkan jumlah dan kompleksitas produk non spesifik sedangkan jumlah siklus yang rendah akan didapat perolehan yang kecil.
D|Page
c Jika siklus diulang beberapa kali, maka daerah yang dibatasi oleh dua primer akan diamplifikasi secara eksponensial yang hasil akhirnya (produk PCR, berupa untai ganda) dapat dirumuskan sebagai (2n-2n)X, dengan n adalah jumlah siklus, 2n adalah hasil pertama yang diperoleh setelah siklus pertama dan hasil kedua yang diperoleh setelah siklus ke dua dengan panjang tidak tertentu, dan X adalah jumlah kopi cetakan DNA (Newton and Graham, 1994). Dengan demikian satu molekul DNA yang diamplifikasi sebanyak 20 siklus akan menghasilkan sekitar (220-40) produk PCR yang dapat diamati secara jelas berupa pita DNA pada elektroforesis gel agarosa. Banyaknya siklus yang disarankan untuk masingmasing jumlah kopi atau molekul dapat dilihat pada tabel . Tabel Hubungan jumlah molekul cetakan dan jumlah siklus PCR Jumlah molekul cetakan
Jumlah siklus
3,0.105
25-30
1,5.104
30-35
1,0.103
35-40
50
40-45
(Innis and Gelfand, 1990) ¦ Y
Primer PCR adalah oligodeoksi ribonukleotida pendek, atau oligomer, yang didesain
komplemen dengan urutan ujung target produk PCR. DNA sintetik ini biasanya sepanjang 15-25 nukleotida dan memilki kandungan G+C minimal sebanyak 50%. Primer dapat berupa urutan DNA yang telah diketahui (primer spesifik) atau urutan DNA turunan yang diprediksi dari urutan asam amino protein yang disandi, dinamakan . Masing-masing dari dua buah primer tersebut komplemen dengan untai yang berbeda pada urutan target beruntai ganda, maka kedua primer tersebut tidak ada kaitan satu sama lain. Urutan primer harus dijaga agar tidak membentuk struktur dupleks atau
antar dirinya sendiri. Î|Page
c Ujung 3͛ primer harus cocok atau komplemen dengan target agar polimerisasi berjalan efisien. Ujung 5͛ primer dapat memiliki urutan yang tidak komplemen dengan target, sehingga mengandung sisi enzim restriksi atau sisi promotor yang akan tertempel pada produk PCR. Y
á Amplifikasi urutan DNA tertentu dengan PCR memerlukan DNA polimerase yang stabil
terhadap panas dan primer. Polimerase yang digunakan dalam PCR antara lain , , dan , yang dihasilkan bakteri termofilik secara berurutan Semua polimerase tersebut stabil pada suhu >950C (suhu denaturasi DNA), dan beraktifitas pada suhu 700C (Baktir, 2000). DNA polimerase Ampli memerlukan ion magnesium sebagai kofaktor, dan mengkatalisis reaksi pemanjangan suatu primer yang menempel pada cetakan pada 720C. Keempat dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) dipakai sesuai dengan aturan pasangan basa komplemen untuk memperpanjang primer, sehingga terjadi pengkopian urutan target (Baktir, 2000). Y
Magnesium klorida merupakan kofaktor bagi DNA polimerase yang dipakai dalam PCR,
dan kadarnya harus dioptimasi untuk setiap pasangan primer/cetakan. Kebanyakan komponen reaksi mengikat ion magnesium, termasuk primer, cetakan, produk PCR dan dNTP. Kadar dNTP dalam campuran reaksi cukup tinggi, dimana kemampuannya mengikat magnesium sebesar 1:1. Karena keberadaan ion magnesium bebas sebagai kofaktor enzim sangat penting dalam PCR, maka total ion magnesium harus melebihi total dNTP. Khusus dalam proses optimasi awal MgCl2 1,5 mM ditambahkan dalam campuran reaksi PCR dengan adanya 0,8 mM dNTP total, maka ion magnesium bebas yang tinggal dalam larutan (untuk DNA polimerase) adalah 0,7 mM (Baktir, 2000).
å|Page
c Y
Bufer PCR untuk DNA polimerase terdiri dari 50 mM KCl dan 10 mM Tris-HCl, pH 8,3
pada suhu kamar. Bufer ini memberikan kekuatan ion dan kapasitas bufer yang diperlukan selama reaksi. Penambahan KCl sampai kadar 50 mM diperlukan untuk memudahkan proses . Tetapi kadar KCl >50 mM dan NaCl=50 mM akan menghambat aktivitas DNA polimerase .
÷ Dewasa ini telah banyak dilakukan isolasi DNA yang bertujuan untuk mengembangkan ilmu pengetahuan terutama dalam ilmu Genetika. IsolasiDNA telah banyak dilakukan dan dikembangkan di dunia ilmiah karenateknologi ± teknologi modern telah menjamah ilmu genetika. Isolasi DNAini dapat dilakukan dengan cara dan bahan sederhana, hingga denganteknologi modern. Mengenai hal ini, pada dasarnya isolasi DNA dapatdilakukan dari berbagai sumber, antara lain organ manusia, darah, daun,daging buah, kalus, akar batang, daging dan sisik ikan. Namun, penggunaantumbuhan sebagai sumber lebih banyak dilakukan dalam pengisolasianDNA dewasa ini.
Pengisolasian DNA pada sumber dilakukan terutamauntuk pengenalan DNA secara lebih jelas karena dari isolasi ini DNA dapatterpisah dari kumpulannya, yaitu kromosom. Setelah dilakukan isolasi, biasanya DNA akan dielektroforesis.Elektroforesis dilakukan untuk memisahkan, mengidentifikasi,mengkarekterisasi dan purifikasi dari molekul DNA/ RNA. Elektroforesismerupakan cara pengamatan DNA dengan bantuan sinar Ultra violet. Cara pemisahan dengan elektroforesis ini merupakan alat pendukung yang sangat pokok dalam teknologi DNA rekombinan, dengan aplikasi yang begitu luas baik untuk pemisahan untai tunggal atau untai ganda molekul DNA.Elektroforesis digunakan untuk pengamatan DNA dalam penampakanflouresensinya.
ÿ|Page
c DNA adalah molekul utama yang mengkode semua informasi yangdibutuhkan untuk proses metabolisme dalam organisme. DNA ini tersusunatas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen, dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida. DNA terdapat di dalam setiap selmakhluk hidup yang sangat berperan penting sebagai pembawa informasihereditas yang menentukan stuktur protein dan proses metabolisme lain.
Lamdji (1998, dalam wahyuni: 2009) mengatakan bahwa penelitiankeragaman genetik tanaman buah merupakan salah satu kegiatan pentinguntuk mendukung pemuliaan tanaman. Perbedaan tanaman dapat dideteksimelalui beberapa penanda, antara lain dengan pola pita DNA. DalamWahyuni (2009), Nicholl (1993) dan Surzycki (2000) pun menyatakan adatiga langkah utama dalam ekstraksi DNA, yaitu perusakan dinding sel (lisis), pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA.
Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akantetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakaridadalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jikaisolasi DNA dilakukan dengan sample buah, maka kadar air pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda-beda pula. Semakintinggi kadar air, maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit,sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit.
Untuk mendeteksi potongan-potongan DNA berupa bands-DNA padagel agarose digunakan pewarna yang mengandung fluoresen dengankonsentrasi rendah, seperti intercalating a gent ethidium bromide (EtBr).Hanya sedikit DNAs 1ng dapat dideteksi secara langsung dengan cara geldiletakkan pada media UV-transilluminator (Fatchiyah,2006)
10 | P a g e
c Fachiyah (2006) pun mengemukakan beberapa faktor yangmempengaruhi Elektroforesis migration rate selama DNA bergerak menembus gel agarose, sebagai berikut:
Y Molekul yang lebih besar akan bergerak lebih lambat, missal DNA linier lebih cepat dibanding DNA sirkuler. Jarak migrasi molekul DNA pada geladalah laju terbalik proporsional log-10 dari jumlah pasangan basa. ½Y Fragmen DNA yang bervariasi ukuran molekulnya akan berberak sesuaidengan konsentrasi dari gel agarose yang digunakan. Rumusnya adalah:log Q = log QS -Kr T dimana QS adalah free electrophoresis mobility, Kr adalah retardation coefficient, dan T adalah gel konsentrasi serta Q adalahelectrophoretic mobility DNA. ëY Laju migrasi juga tergantung pada bentuk/konformasi DNA, kita tahu bahwa ada 3 macam bentuk DNA yaitu super-helix circular (I), circular-opened (II), dan linier (III). Meskipun ketiga bentuk itu mempunyai beratyang sama tetapi laju migrasi pada gel elektroforesis berbeda. Perbedaan laju migrasi ini karena konsentrasi gel agarose ÔY kekuatan arus listrik dan ionik buffer yang digunakan ÔY densitas kembaran superheliks pada bentuk I ÔY pada beberapa kondisi bentuk I lebih cepat dibanding bentuk III ÔY tergantung juga kenaikan kuantitas EtBr: konsentrasi EtBr meningkat, pengikatan DNA meningkat pula sehingga mobilitas meningkat tajam,contoh untuk bentuk I ÔY konsentrasi EtBr kritis antara 0.1 Q g/ml-0.5 Q l/m Y ¦ Voltage rendah menyebabkan laju migrasi DNA linier proporsional.Idealnya untuk DNAs 2kb pada gel agarose bergerak s 5v/cm. Arah dari bidang elektris konstans untuk DNA 50-100kb bergerak dengan laju yang sama, akan berubah secara periodik sesuai kecepatan pergerakan DNAakan berubah juga. 11 | P a g e
c
-Y ¦ Baik komposisi basa maupun temperature tidak begitu berpengaruh,mobilitas DNA stabil pada temp. 4-30 r C . Dan elektroforesis gel agarosedilakukan pada suhu kamar DY ¦ Iintercalating agent ethidium bromide (EtBr) adalah pewarna fluoresenuntuk deteksi asam nukleat, EtBr ini akan mengikat pada sela-sela pasangan basa DNA. EtBr dapat mengurangi mobilitas DNA linier sampai15%. Hanya sedikit DNA s 1ng dapat dideteksi secara langsung dengancara gel diletakkan pada media UV-transilluminator. EtBr dapat digunakanuntuk mendeteksi single- atau double-stranded asam nukleat (DNA atauRNA). Meskipun, affinity dari EtBr-dye ini untuk single stranded asamnukleat relative rendah dan pendaran fluorensen minimum. PERHATIAN!EtBr ini powerful mutagen , pengguna harus selalu memakai sarungtangan pada saat bekerja, dan lindungi mata anda dengan kaca pelindung pada saat mengamati di atas UV-transilluminator ÎY ¦ Buffer elektroforesis yang digunakan harus sesuai dengan pelarut yangdigunakan untuk pembuatan gel agarose. Missal: ÔY Tris-acetate; umum dipakai untuk preparative, kemampuannya palingrendah, tetapi efektif untuk isolasi DNA dari gel agarose baik elektroelusi maupun gel ekstraksi. ÔY Tris-borat; resolusi cukup baik, tapi untuk mengisolasi kembali DNAdari agarose kurang effektif, karena ada interaksi dengan agarose
1½ | P a g e
c ÷÷÷ Y Y u : 'Y Mikrotube
'Y Incubator
'Y Mikropipet dan tipps
'Y Alat pengering rambut
'Y Pipet Pasteur
'Y Wadah pencetak Gel Agarosa
'Y Sentrifugator
'Y Set Elektroforesis dan Power Supply
'Y Vortex
'Y Wadah Plastik Untuk mewarnai Gel
'Y Penangas Air
'Y Mesin PCR
'Y Rak mikrotube
'Y UV Transluminator
Y à 'Y DNA >Y Akar Rambut >Y Larutan Pelisis Protein >Y Larutan Pelisis sel >Y Air Es >Y Aquadest 'Y PCR >Y Sampel DNA (DNA supernatan) >Y Primer soluction 'Y Elektroforesis ÊY Sampel DNA ÊY Gel agarosa ÊY Warna Biru Brofenol ÊY Dapar TAE ÊY Marker
1ë | P a g e
c ÷ Y
'Y ÷ u
ë akar rambut yang ujungnya
Dimasukan dalam
Ditambahkan 1-0ml
terlihat putih, diambil
tube 1,-ml
lysis solution
Di dinginkan dengan air mengalir
Di inkubasi -D 0c di
selama ë0 detik
water bath 1- menit
Di vortex
Di inkubasi dengan air mendidih (10
Di dinginkan denag air es
Di vortex
menit) dengan tujuan agar melysiskan sel
selama ½ menit
10 detik
Dimasukan dalam tab 0,- ml
ditambahkan supernatan
Dimikrosentifugase
sebanyak½0 ë0 ml
selama ë0 detik
Diukur dengan UV Vis pada panjang gelombang ½å0 nm
'Y p p
DNA supernatan diambil ½0ȝl, dan
Ditambahkan Primer
diletakkan kedasar tabung PCR
soluction ½0 ȝl dan ditutup
Hasil Amplifikasi Diamati Dengan
Tabung PCR dimasukkan kedalam alat PCR
Teknik Elektroforesis
1 | P a g e
c 'Y
á p ·el agarosa disiapkan, dan dibuat sumur gel
pada tiap sumur dimasukkan masing masing 1½ ȝl sampel hasil PCR yang sebelumnya telah dicampur dengan ½ ȝl Loading buffer
·el agarosa diletakkan pada alat elektroforesis.
Dapar TAE dimasukkan kedalam ruang
(sumuran berada pada kutub negatif alat ini)
elektroforesis hingga batas permukaan gel
Dihubungkan dengan power supply, dimasukkan ke dalam
Marker disiapkan
alat elektroforesis dan proses dijalankan dengan tegangan Î- volt selama - menit
Setelah selesai, wadah pencetak diangkat, gel (sumuran) didorong dan dimasukkan kedalam
Sampel dimasukkan kedalam sumuran
wadah yang berisi larutan pewarna.
dan sumur pertama diisi oleh marker
D0 ȝl DNA bio safe
Pita yang terbentuk divisualisasi dengan alat UV transluminator,
dituangkan kedalam wadah
bila pita belum jelas, gel direndam kembali pada larutan pewarna
tadi, dan ditutup.(10menit)
dan diamati kembali dengan sinar UV
1- | P a g e
c Y ÷p ÷
Y ÷ u
Pemisahan bagian putih dari ujung rambut untuk kemudian di masukkan ke dalam tabung dan di tambah kan 150 µl lysis solution
Proses inkubasi di dalam waterbath selama 15 menit pada suhu 56 o C
Proses Inkubasi di dalam air mendidih selama 10 menit untuk melysiskan sel
Proses inkubasi di dalam air es selama 2 menit, kemudian di vortex lagi selama 2 menit
Mikrosentrifugase selama 30 detik dengan 5000 rpm
Pengambilan supernatant
1D | P a g e
c ½ Y p
Pengambilan Supernatant
Penambahan primer solution pada tabung mikrotube
Setting alat PCR untuk mengaplifikasi DNA
Y á
Penimbangan Serbuk gel
Pemanasan Serbuk gel + Aquadest hingga mengental menjadi agar
1Î | P a g e
c
Penuangan Gel dingin ke dalam alat sisir
Hasil pita yang terbentuk di bawah sinar UV
÷ Y p Percobaan ini bertujuan mengisolasi dan mengamplifikasi fragmen D-loop DNA mitokondria dari sel folikel rambut secara in vitro dengan teknik PCR. Kemudian menganalisis fragmen DNA hasil PCR dengan metode elektroforesis menggunakan agarosa. PCR merupakan teknik untuk amplifikasi dan produksi fragmen DNA dalam jumlah banyak dari sumber DNA yang jumlahnya sangat kecil, yang tanpa proses ini sulit untuk diidentifikasi. Sumber DNA yang digunakan dalam percobaan ini adalah sel folikel rambut. Sel ini berkembang karena adanya suatu sumber energi. Energi tersebut dihasilkanoleh mitokondria. Oleh karena itu dapat disimpulkan bahwa di dalam sel folikel rambut pastilah mengandung banyak mitokondria. Folikel rambut kaya akan DNA. Rambut yang rontok dengan sendirinya jika diisolasi DNAnya, maka akan diperoleh hasil yang kurang memuaskan. Oleh karena itu, untuk memperoleh hasil yang maksimal digunakan folikel rambut yang masih segar yang bisa didapatkan dengan mengambil beberapa helainan rambut dari kulit kepala langsung (Sporgsmaaluk, 2008). Pada percobaan ini fragmen DNA mitokondria yang digunakan adalah daerah D-loop. Dipilihnya daerah D-loop ini karena D-loop merupakan daerah hipervariabel, yang mana pada setiap etnis berbeda (polimorfisme), sehingga DNA pada daerah ini bisa digunakan 1å | P a g e
c untuk keperluan identifikasi dan forensik. Selain itu pada D-loop terdapat daerah yang merupakan titik awal proses replikasi dan daerah promotor transkripsi. Karena laju mutasi pada DNA mitokondria tinggi, yaitu sepuluh kali dari DNA inti, maka tingkat polimorfisme tinggi sehingga dapat digunakan untuk identifikasi. Meskipun tingkat atau laju mutasi DNA mitokondria tinggi, namun tidak akan mengganggu kerja tubuh yang ada, karena pada DNA mitokondria terdapat D-loop yang tidak memiliki histon, yaitu suatu protein yang mengkode sekitar seperempat asam amino terutama arginin dan lisin yang berfungsi mengepak dan menyusun DNA menjadi unit-unit struktural, sehingga tidak ada protein berbeda yang diekspresikan yang dapat merusak kerja tubuh. Dapat terjadinya mutasi ini secara umum terjadi pada DNA mitokondria yang terdapat di dalam matriks melalui suatu reaksi oksidatif yang juga terjadi di matriks. Reaksi ini menghasilkan superoksida yang apabila bereaksi dengan DNA mitokondria menyebabkan mutasi.Sedangkan secara spesifik penyebab utama mudahnya mtDNA termutasi karena D-loop tidak memiliki histon yang merupakan pelindung DNA sehingga akan mudahdiserang mutan dan akhirnya terjadi mutasi. Prosedur pertama dalam percobaan ini yaitu membuat template DNA yang digunakan untuk reaksi PCR. Melisis sel folikel rambut yaitu dengan cara memotong kecil-kecil bagian akar rambut yang memiliki ujung putih, sekitar satu centimeter, kemudian memasukkannya ke dalam tabung mikro, ditambah dengan buffer lisis, Proteinase K, dan akuabides dengan volume total untuk masing-masingnya sebesar 300 mikro L, baru setelah itu disentrifugasi. Buffer lisis mengandung 50 mM tris-HCl pH 8,5 ; 1 mM EDTA pH 8,0; dan 0,5% Tween-20. Prosedur lisis dilakukan untuk memecah membran sel dan membran organel (inti dan mitokondria) sehingga DNA akan dapat diisolasi. Perusakan membran sel dan organel sel yaitu dengan menggunakan enzim Proteinase K yang dapat memutuskan ikatan peptidadari protein penyusun membran sehingga lapisan membran rusak. Tween-20 bersifat seperti detergen (pengemulsi) yang dapat menyebabkan integritas dari fosfolipid dan protein hidrofob sehingga DNA dapat keluar. Setelah DNA keluar (baik DNA intimaupun DNA mitokondria), enzim nuklease telah menunggu di luar untuk memfragmentasinya, dan hal ini tidak diharapkan. Oleh karena itu ditambahkan EDTA pH 8,0 yang dapat membentuk khelat dengan Mg2+ atau logam lain yang berfungsi sebagai kofaktor enzim nuklease, 1ÿ | P a g e
c sehingga enzim nuklease menjadi tidak aktif dan DNA tidak akan terfragmentasi. Penambahan EDTA ini tidak boleh berlebihan atau kekurangan, artinya pengkhelatan tidak boleh terlalu kuat dan tidak boleh terlalu lemah karena akan mengganggu proses PCR yang juga memerlukanlogam Mg2+. Sedangkan tris-HCl pH 8,5 berfungsi sebagai buffer yangmengondisikan
agar
enzim
Proteinase
K
bekerja
pada
pH
optimum.
Setelah penambahan buffer lisis, ditambahkan akuabides dan kemudian diinkubasi pada suhu 56°C selama 1 jam. Inkubasi pada suhu ini dimaksudkan untuk mengaktifkan kerja enzim Proteinase K karena pada suhu tersebut memiliki aktivitas optimum. Setiap 15 menit inkubasi dihentikan, kemudian tabung divortex agar reagen-reagen yang tadi ditambahkan tercampur sempurna. Setelah 1 jam, kemudian diinkubasi lagi pada suhu 95°C selama 5 menit. Penginkubasian pada suhu ini berguna untuk mendenaturasi atau menginaktifkan enzim Proteinase K. Enzim Proteinase K perlu dinonaktifkan karena bila tidak, enzim proteinase K akan memotong enzim Taq polimerase yang berperan penting dalam proses PCR. Kemudian dilakukan sentrifugasi. DNA mitokondria akan berada di supernatan bukan di residu, karena perbedaan beratmolekul dari DNA mitokondria dan DNA inti maka dengan sentrifugasi keduanya dapat terpisah. Sentrifugasi merupakan suatu metode pemisahan berdasarkan perbedaan kecepatan sedimentasi dari partikel-partikel molekul yang disebabkan olehmedan sentrifugal. Kecepatan sedimentasi ini dipengaruhi oleh bentuk molekul, beratmolekul atau radius molekul. Setelah itu supernatant disimpan dalam freezer -20°C untuk mencegah kerusakan atau denaturasi protein dalam sebuah tabung mikro. Prosedur berikutnya perbanyakan fragmen DNA mitokondria secara in vitrodengan PCR. Terlebih dahulu dibuat master mix yang merupakan campuran dari buffer PCR 10x (tris-HCl 100 mM pH 9, KCl 500 mM, dan MgCl 215 mM) dengan primer M1 dan M2, dNTP, akuabides, dan terakhir adalah DNA Taq polimerase.Perlu diperhatikan pada saat belum digunakan semua reagen harus disimpan pada suhu serbuk es (sekitar -20°C) yaitu untuk menjaga keakuratan volume. Pada saat pemipetan, tip pipet harus menempel pada dinding tabung agar reagen yang dikeluarkan tip pipet volumenya sesuai karena penambahan reagen harus dilakukan secara kuantitatif.Buffer PCR berfungsi untuk mendapat pH optimum untuk enzim Taq DNA polimerase.
½0 | P a g e
c Dalam buffer PCR ini terdapat ion Mg yang berfungsi : 1.Y Sebagai kofaktor enzim DNA polimerase untuk meningkatkan aktivitasnya. 2.Y Meningkatkan kelarutan dNTP sehingga reaksi kimia dalam PCR akan lebihmudah.Konsentrasi MgCl2 yang digunakan harus diperhatikan. Konsentrasi Mg yang rendahakan menyebabkan produk PCR yang rendah, tapi Mg dengan konsentrasi yang terlalu banyak menyebabkan hasil PCR tidak spesifik. Primer M1 dan M2 yang digunakan merupakan komplemen dari template primer yang digunakan dan hendaknya memenuhi pertimbangan sebagai berikut : -Y Diketahui ukuran nukleotidanya -Y Tidak terjadi dimerisasi antar primernya sendiri -Y Memiliki % GC yang tinggi (minimum 50%) -Y Tingkat homologinya tinggi Primer M1 dan M2 masing-masing terdiri dari 20 nukleotida. Jumlah ini akan menentukan suhu annealing yang akan digunakan dalam reaksi PCR. Basa dNTP yang mengandung dATP, dGTP, dCTP, dan dTTP, merupakan sumber basa yang akan menempel di template. Sedangkan enzim Taq DNA polimerase selain berfungsi memperbanyak dan memperpanjang primer, juga akan membaca basa yang terdapat pada template dan akan mendatangkan pasangan basa yang sesuai. Penggunaan konsentrasi Taq DNA polimerase yang tinggi berakibat produk yang dihasilkan tidak akan spesifik.Setelah master mix dibuat dengan final volume 25 mikro L, kemudian ditambahkan10 mikro L template mtDNA yang telah dibuat. Kemudian tabung divortex agar semua reagen tercampur sempurna, lalu disentrifugasi selama 10 detik (impuls) untuk mencampur dan mengumpulkan larutan di dasar tabung. Tabung kemudian disimpan dalam es sambil menunggu set-up mesin PCR. Setelah siap, tabung dimasukkan kedalam mesin PCR dan prosesnya dimulai. Reaksi yang terjadi di dalam mesin PCR : 1.Denaturasi pada suhu 94°C, 1 menit, 2. Annealing pada suhu 50°C, 1 menit 3. Extension pada suhu 72°C, 1 menit ½1 | P a g e
c Tahap pertama reaksi PCR adalah denaturasi pada suhu 94°C selama 1 menit. Pada tahap ini rantai ganda DNA akan terbuka membentuk rantai DNA tunggal. Apabila suhu denaturasi di bawah 94°C, dikhawatirkan sebagian template akan terdenaturasi, sedangkan bila suhu di atas 94°C, maka enzim Taq polimerase akan kehilangan setengah aktivitasnya. Enzim Taq polimerase yang digunakan merupakan suatu bakteri termofilik yang stabil pada suhu tinggi yaitu Thermos aquaticus, sehingga pada suhu 94°C tidak terdenaturasi padahal suhu optimumnya adalah 72°C.Tahap kedua adalah annealing pada suhu 50°C selama 1 menit. Annealingmerupakan proses penempelan primer pada template. Suhu annealing dapat ditentukan melalui perhitungan Tm : Tm = 4(G + C) +2(A + T) Tm atau temperature melting merupakan suhu yang menunjukkan pada saat DNA terdenaturasi 50%. Suhu annealing pada proses PCR kali ini adalah 55°C. karena primer M1 dan M2 yang digunakan terdiri atas nukleotida yang apabila kita hitung dapat diperoleh 55°C suhu annealing. Tapi penentuan suhu annealing biasanya 5°Cdi bawah Tm. Tapi pada suhu 55°C ini merupakan suhu optimum terjadinya penempelan primer pada template. Suhu annealing tidak boleh lebih dari 60°C karena dikhawatirkan primer tidak akan menempel pada template, dan tidak boleh lebih rendah juga dari 60°C karena primer akan menempel di tempat yang tidak spesifik bahkan pada satu siklus dapat terjadi penempelan dua primer. Tahap terakhir adalah extension yaitu tahap pemanjangan primer akibat adanya enzim Taq DNA polimerase. Extension ini terjadi pada suhu 72°C dimana merupakan suhu optimum enzim Taq polimerase. Setelah annealing, primer ini kemudian diperpanjang, membentuk salinan tambahan deretan atau urutan template diantara dua primer oligonukleotida. Setelah pemanjangan primer lengkap, duplex DNA didenaturasi dengan pemanasan sampel beberapa saat yang menghasilkan kira-kira dua kali template untai tunggal untuk primer annealing pada siklus selanjutnya. Pada percobaan ini siklus dilakukan berulang sebanyak 30 kali.
½½ | P a g e
c Setelah reaksi PCR selesai, maka hasilnya dikarakterisasi menggunakan elektroforesis agarosa. Agarosa yang digunakan agarosa konsentrasi tinggi disebut ͚Agarosa Minigels´. Agarosa minigels digunakan karena pemisahannya cepat dari sejunlah kecil fragmen DNA dengan ukuran 0,3± 1,0 kb. Sedangkan fragmen DNA yang digunakan adalah 0,4kb. Gel agarosa ini dibuat dengan melarutkan sebanyak 0,4 gram agarosa dalam 40 mL buffer TAE ( tris asetat 0,04M, EDTA 0,001 M pH 8) sambil dipanaskan hingga mendidih agar agarosa larut semuanya. Kemudian didinginkan hingga 50-60°C dan ditambahkan ethidium bromida. Dalam hal ini buffer TAE sebagai media penghantar arus, dimana fragmen mtDNA akan bergerak dengan perbedaan kecepatan akibat adanya perbedaan kekuatan ionik. Fragmen DNA akan memisah berdasarkan ukuran pasangan basa. Untuk melihat pita DNA maka harus menodai gel dengan ethidium bromida yang merupakan warna fluorosence yang menginterkhelat DNA dan kemudian dapat dilihat dengan sinar UV. Agarosa merupakan suatu koloidal laut yang dimurnikan dari alga. Ketika dididihkan dalam suatu larutan buffer, agarosa akan larut dan ketika didinginkan akan memadat membentuk gel. Pendinginan dilakukan sekitar suhu 50-60°C, apabila terlalu panas akan merusak karet-karet penyimpan agar. Selain itu, viskositasnya rendah sehingga akan menimbulkan gelembung-gelembung, sehingga apabila dituangkan dikhawatirkan ada udara yang terjebak. Ethidium bromida ditambahkan setelah agarosa bersuhu sekitar 5060°C. Senyawa ini berfluorosence merah-orange dibawah sinar UV dan tingkat fluorosence bertambah ketika terikat pada DNA untai tunggal. Stuktur ethidium bromida cukup kompleks dikenal juga dengan nama phenenanthridium-3,8-diamino-5-etil-6-fenilbromida.Ethidium bromida dapattersisipkan diantara basa asam nukleat dan memberikan deteksi dalam gel. Ethidium bromida ini terdapat dalam bentuk bubuk atau larutan yang larut dalam air. Kristal atau bubuknya tidak berbau dan menunjukkan warna merah tua. Dapat tersisipnya ethidium bromida diantara basa asam nukleat, karena ethidium bromida sedikit mirip pasangan basa dan dapat masuk ke dalam rantaiganda DNA di antara pasangan basanya. Hal tersebut sangat mutagen. Ethidium bromida merupakan fluoresence yang lemah. Fluorosensi terjadi karena electron tereksitasi ke tingkat energi yang lebih tinggi (dengan UV 365 nm). Ketika electron kembali pada tingkat energi yang lebih rendah, ½ë | P a g e
c menimbulkan perbedaan energi (sinar tampak). Fluorosensi ethidium bromida bebas dalam larutan rendah, karena electron dapat mengalir diantara dua level energi, dalam tingkatan energi vibrasi. Ketika ethidium bromida terikat pada DNA yang lebih kaku maka jalur pengeluaran energy rendah. Jalur fluorosensi ini yang umum terjadi dimana Ethidium bromida tidak tersisipkan lebih panjang di antara pasangan basa yang bersesuaian dengan stemakseptor tRNA valin. Karena itu tersisipnya akan berada di antara pasangan basa padastruktur stem-loop panjang bagian bawah. Dengan demikian ethidium bromida lebih suka sisi penyisipannya dekat dari basa RNA helical stem. Gambar : Penyisipan Ethidium Bromida pada Pasangan Basa
Setelah penambahan ethidium bromida, agarosa cair dituangkan ke dalam cetakan yang memiliki sisir untuk membentuk sumur gel. Setelah cetakan jadi, pada tiap sumur dimasukkan masing-masing 12 mikro L sampel hasil PCR yang sebelumnya telah dicampur dengan 2mikro L oading buffer. Loading buffer terdiri atas sukrosa 50%,EDTA Ph 8,0 dan brom fenol biru yang digunakan sebagai pewarna guna mempermudah pengamatan berpindahnya noda dalam gel dan memonitoring sejauh mana proses elektroforesis telah berlangsung, dengan adanya warna biru yang bergerak dalam agar. Selain itu, penambahan sukrosa ini sebagai pemberat bagi sampel sehingga sampel tenggelam ke dalam sumur gel.
Setelah sumur diisi, kemudian dimasukkan ke dalam alat elektroforesis dan proses dijalankan dengan tegangan 75 volt selama 45 menit. Tegangan yang digunakan tidak boleh dinaikkan karena fragmen besar akan berpindah sebanding dengan kecepatan fragmen kecil. Diketahui elektroforesis merupakan suatu pemisahan zat berdasarkan pengaruh
½ | P a g e
c medan listrik. Karena adanya aliran listrik yang mengalir pada gel, maka fragmen DNA bergerak ke kutub positif (ditandai dengannoda biru bergerak ke kutub positif). Hal ini karena molekul DNA relatif lebih kecil sehingga bergerak lebih dulu daripada molekul lain yang besar, selain itu DNA ini bermuatan negatif akibat adanya gugus fosfat pada ujung 5nya. Setelah proses elektroforesis selesai, untuk menunjukkan hasil PCR berhasil atau tidak atau ingin mengetahui DNA mitokondria yang diisolasi itu benar dengan yang diinginkan, maka divisualisasi di bawah lampu UV. Agarosa dikeluarkan dari buffer. Setelah dikenakan sinar UV terlihat pita berwarna merah-orange
Gambar tersebut memperlihatkan hasil yang positif untuk sel folikel rambut, dimana pada sumur 1 merupakan marker. Namun pada hasil praktikum yang dilakukan, tidak terlihat adanya pita yang muncul dari sumur-sumur yang telah diisi sampel tadi. Hal ini dikarenakan kesalahan pada saat meletakkan sumur elektroforesis. Posisi yang seharusnya diletakkan pada kutub negatif., malah diletakkan pada kutub positif, sehingga elusi terjadi pada arah terbalik. Pita yang seharusnya terus memanjang, akhirnya malah terjatuh pada cairan buffer akibat pendeknya area elusidasi. Sempat dilakukan pemindahan posisi pada saat disadari bahwa posisi tersebut terbalik, namun hasil yang terlihat setelah diamati pada sinar UV, yang terlihat hanyalah pita yang berasal dari Markernya saja. Pita tidak terlihat jelas pada hasil gambar berikut:
½- | P a g e
c
Pemotongan gel agarosa juga terlihat tidak merata, hal ini juga akanberpengaruh pada hasil yang diperoleh, akibat daerah elusi dengan dapar tidak seimbang, sehingga pergeseran pita tidak optimum.
÷÷ Y
÷p
Dari hasil pecobaan yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa: 1.Y D-loop DNA mitokondria dari sel folikel rambut dapat diisolasi dengan cara lisis. 2.Y D-loop DNA mitokondria dapat diamplifikasi secara in vitro dengan teknik PCR. 3.Y Fragmen D-loop DNA mitokondria hasil PCR dapat dianalisis dengan metode elektroforesis. 4.Y Pita DNA tidak diperoleh kemungkinan diakibat kesalahan pada saat meletakkan sumur elektroforesis.
½D | P a g e
c p >Y Stryer, lubert. 2000. . Jakarta : EGC >Y Muray, Robert K.2009. ½Î. Jakarta : EGC >Y Lehninger. 1982. Jakarta : Erlangga
½Î | P a g e
