Makalah Aplikasi Pcr Fix

MAKALAH APLIKASI PCR MATERI SOLID PHASE PCR Disusun untuk memenuhi tugas Mata Kuliah Aplikasi PCR Dosen Pembimbing Ibu Aminah , M.Si

Disusun oleh : Richi Dwi N Friska Sumayyah Nida Azizah

ANALIS KESEHATAN TANGERANG TINGKAT 2 B POLTEKKES KEMENKES BANTEN

Tahun Ajaran 2013 / 2014

KATA PENGANTAR

Kami Panjatkan Puji Syukur Kehadirat Tuhan Yang Maha Esa atas rahmat dan hidayah-Nya yang telah diberikan kepada kami . Sehingga , kami dapat mempu menyelesaikan tugas ini dengan baik dan tepat pada waktunya . Adapun tujuan dari tugas ini , yaitu agar mahasiswa / mahasiswi dapat mengerti , memahami , dan mengetahui pengertian dari solid phase PCR tersebut . Adapun isi dari tugas ini , yaitu : 1. Pendahuluan 2. Isi 3. Penutup Sehubungan dengan hal tersebut , kami mengucapkan terima kasih kepada Ibu dosen pengajar yaitu Ibu Aminah , M.Si yang telah memberikan tugas ini serta teman teman satu kelompok atas kejasamanya dalam pembuatan tugas ini . Atas perhatian Ibu , kami mengharapkan saran dan kritik untuk perbaikan pada tugas-tugas selanjutnya .

Tangerang , 8 September 2014

PENULIS

DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR .............................................................................................. i DAFTAR ISI ......................................................................................................... ii

BAB 1 . PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang .................................................................................................. 1.2 Tujuan ............................................................................................................... 1.3 Rumusan Masalah ............................................................................................ 1.4 Manfaat .............................................................................................................

BAB 2 . PEMBAHASAN 2.1 Pengertian PCR ............................................................................................... 2.2 Pengertian Solid Phase .................................................................................... 2.3 Komponen-komponen PCR ……………………………………………………….. 2.4 Peralatan khusus yang digunakan ……………………………………………….. 2.5 Tahapan proses …………………………………………………………………….. 2.6 Aplikasi …….………………………………………………………………………… 2.7 Kelebihan dan Kekurangan ………………………………………………………...

BAB 3 . PENUTUP 3.1 Kesimpulan ...................................................................................................... 3.2 Kritik dan Saran ................................................................................................

DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................ iii

BAB 1 PENDAHULUAN A . Latar Belakang PCR dapat memperkuat molekul DNA juta kali lipat, namun ketiadaan atau adanya amplikon harus diverifikasi oleh metode lain seperti elektroforesis gel, blotting selatan, sequencing atau berbagai teknik hibridisasi. perlunya karakterisasi amplikon memakan waktu. satu teknik yang menawarkan cepat, sensitif dan spesifik hibridisasi. adalah enzim terkait uji oligonukleotida sorben (ELOSA). Ini adalah fase padat roti hibridisasi assay yang memungkinkan deteksi yang sangat spesifik dan sensitif dari asam nukleat sasaran. seperti yang disarankan oleh namanya, protokol dari ELOSA sangat dekat dengan yang terkenal ELISA dan hanya melibatkan incubations sangat sederhana dan langkah-langkah mencuci. seluruh prosedur memakan waktu sekitar 4 jam. Fase padat PCR: mencakup beberapa arti, termasuk Amplifikasi Polony (di mana koloni PCR diturunkan dalam matriks gel, misalnya), Jembatan PCR (primer yang kovalen terkait dengan permukaan padat-dukungan), Fase Padat PCR konvensional (di mana PCR asimetris diterapkan di hadapan primer bantalan dukungan solid dengan urutan pencocokan salah satu primer berair) dan Fase Padat Peningkatan PCR (di mana Fase Padat PCR konvensional dapat ditingkatkan dengan menggunakan Tm tinggi dan bersarang primer dukungan yang solid dengan aplikasi opsional dari 'langkah' termal untuk mendukung priming dukungan yang solid). Teknologi chip DNA ini menjadi area penting dari penelitian high-throughput di jalur biologis dan penyakit dasar. Teknologi yang digunakan untuk menghasilkan chip DNA berkembang pesat. Secara historis, analisis gen dilakukan oleh hibridisasi probe berlabel dengan target DNA yang pasif teradsorpsi ke dukungan padat seperti nitroselulosa, membran nilon atau slide kaca berlapis lisin . Kovalen hubungan DNA ke permukaan menjadi pendekatan yang lebih disukai karena memungkinkan lampiran lebih stabil di bawah kondisi yang digunakan untuk hibridisasi. Langsung 5'-end lampiran DNA adalah kepentingan tapi cair PCR biasanya merupakan prasyarat untuk menghasilkan 5'-end DNA functionalised sebelum lampiran. Atau, molekul asam nukleat pendek dapat langsung disintesis ke dukungan solid dengan ujung-3. Dalam sintesis situ oligonukleotida 5'-end , kemungkinan membalik orientasi lampiran, dari 3'ke 5'-end, setelah sintesis pada manik-manik lateks. Sebuah pendekatan alternatif untuk melampirkan DNA target untuk analisis pada chip DNA adalah untuk memperkuat target DNA ditangkap .

B . Tujuan Adapun tujuan dari makalah ini , yaitu : 1. Agar mahasiswa dapat mengerti mengenai pengertian PCR 2. Agar mahasiswa dapat mengerti mengenai solid phase PCR

C . Rumusan Masalah Adapun rumusan masalah dari makalah ini , yaitu : 1. Apa pengertian dari PCR ? 2. Apa pengertian dari solid phase PCR ? 3. Apa hubungannya solid phase dengan DNA ?

D . Manfaat Adapun manfaat dari makalah ini , yaitu : 1. Mahasiswa dapat mengerti mengenai PCR 2. Mahasiswa dapat mengerti mengenai solid phase PCR

BAB 2 PEMBAHASAN

A. Pengertian PCR Reaksi Polimerase Berantai atau dikenal sebagai Polymerase Chain Reaction (PCR), merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk melipatgandakan suatu sekuens nukleotida tertentu secara in vitro. Metode ini dikembangkan pertama kali oleh Karry B. Mulis pada tahun 1985. Metode ini sekarang telah banyak digunakan untuk berbagai macam manipulasi dan analisis genetic. Pada awal perkembanganya metode ini hanya digunakan untuk melipatgandakan molekul DNA, tetapi kemudian dikembangkan lebih lanjut sehingga dapat digunakan pula untuk melipatgandakan dan melakukan kuantitas molekul mRNA. Dengan menggunakan metode PCR dapat meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah semula, sekitar 106-107 kali. Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya. Pada setiap siklus PCR akan diperoleh 2n kali banyaknya DNA target. Kunci utama pengembangan PCR adalah menemukan bagaimana cara amplifikasi hanya pada urutan DNA target dan meminimalkan amplifikasi urutan non-target. Metode PCR dapat dilakukan dengan menggunakan komponen dalam jumlah yang sangat sedikit, misalnya DNA cetakan yang diperlukan hanya sekitar 5µg, oligonukliotida yang digunakan hanya sekitar 1 mM dan reaksi ini biasa dilakukan dalam volume 50-100 µl. DNA cetakan yang digunakan juga tidak perlu dimurnikan terlebih dahulu sehingga metode PCR dapat digunakan untuk melipatgandakan suatu sekuens DNA dalam genom bakteri. Konsep asli teknologi PCR mensyaratkan bahwa bagian tertentu sekuen DNA yang akan dilipatgandakan harus diketahui terlebih dahulu sebelum proses pelipatgandaan tersebut dapat dilakukan. Sekuen yang diketahui tersebut penting untuk menyediakan primer, yaitu suatu sekuens oligonukleotida pendek yang berfungsi mengawali sintesis rantai DNA dalam reaksi berantai polimerasi. Fase padat PCR adalah mencakup beberapa arti, termasuk Amplifikasi Polony (di mana koloni PCR diturunkan dalam matriks gel, misalnya), Jembatan PCR (primer yang kovalen terkait dengan permukaan padat-dukungan), Fase Padat PCR konvensional (di mana PCR asimetris diterapkan di hadapan primer bantalan dukungan solid dengan urutan pencocokan salah satu primer berair) dan Fase Padat Peningkatan PCR (di mana Fase Padat PCR konvensional dapat ditingkatkan dengan menggunakan Tm tinggi dan bersarang primer dukungan yang solid dengan aplikasi opsional dari 'langkah' termal untuk mendukung priming dukungan yang solid).

1. DNA dapat terikat kovalen dengan matriks padat, misalnya, CovaLink NH strip. Molekul-molekul DNA terikat secara eksklusif pada 5'-end oleh ikatan phosphoramidate. Primer amobil dapat berfungsi sebagai primer bersarang untuk meningkatkan spesifisitas PCR 2. probe primer Non-radioaktif dapat digunakan (primer hilir); probe terbiotinilasi 5 'adalah umum digunakan. Sensitivitas berada di urutan yang sama seperti untuk probe berlabel radioaktif 3. Hybridisation di piring microwell adalah, karena mudah penanganan pelat microwell, sangat menjanjikan Metode untuk tujuan diagnostik. Selain itu, piring microwell memungkinkan penggunaan non-radioaktif probe, dengan keuntungan lebih lanjut dari kuantifikasi amplikon (Gambar 2)

B. Komponen – Komponen PCR Ada beberapa macam komponen utama dalam proses PCR, yaitu antara lain: 1. DNA cetakan DNA cetakan, yaitu fragmen DNA yang akan dilipatgandakan. Fungsi DNA templat di dalam proses PCR adalah sebagai cetakan untuk pembentukan molekul DNA baru yang sama. Templat DNA ini dapat berupa DNA kromosom, DNA plasmid ataupun fragmen DNA apapun asal di dalam DNA templat tersebut mengandung fragmen DNA target yang dituju.Reaksi pelipatgandaan suatu fragmen DNA dimulai dengan melakukan denaturasi DNA template (cetakan) sehingga rantai DNA yang berantai ganda (double stranded) akan terpisah menjadi rantai tunggal (single stranded). Denatirasi DNA dilakukan dengan menggunakan panas selama 1 – 2 menit, kemudian suhu diturunkan menjadi sekitar sehingga primer akan “menempel” (annealing) pada cetakan yang telah terpisah menjadi rantai tunggal. Primer akan membentuk jembatan hydrogen dengan cetakan pada daerah sekuen yang komplementer dengan dengan sekuen primer. Suhu yang digunakan untuk penempelan primer pada dasarnya merupakan kompromi. Amplifikasi akan lebih efisien jika dilakukan pada suhu yang lebih rendah. 2. Oligonukleotida primer Oligonukleotida primer, yaitu suatu sekuen oligonukleotida pendek (15 – 25 basa nukleotida) yang digunakan untuk mengawali sintesis rantai DNA. Primer yang digunakan dalam PCR ada dua yaitu oligonukleotida yang mempunyai sekuen yang identik dengan salah satu rantai DNA cetakan pada ujung 5’-fosfat, dan oligonukleotida yang kedua identik dengan sekuen pada ujung 3’OH rantai DNA cetakan yang lain. Proses annealing biasanya dilakukan selama 1 – 2 menit. Setelah dilakukan annealing oligonukleotida primer dengan DNA cetakan, suhu inkubasi dinaikkan menjadi selama 1,5 menit. Pada suhu ini DNA polymerase akan melakukan proses polimerasi rantai DNA yang baru berdasarkan informasi yang ada pada DNA cetakan. Setelah terjadi polimerasi, rantai DNA yang baru akan membentuk jembatan hydrogen dengan DNA cetakan. DNA rantai ganda yang terbentuk dengan adanya ikatan hydrogen antara rantai DNA cetakan dengan rantai DNA yang baru hasil polimerasi selanjutnya akan didenaturasi lagi dengan menaikkan suhu ingkubasi menjadi . Rantai DNA yang baru tersebut selanjutnya akan berfungsi sebagai cetakan bagi reaksi polimerasi berikutnya. Reaksi-reaksi seperti yang sudah dijelaskan tersebut diulangi lagi sapai 25 – 30 klai (siklus) sehingga pada akhir siklus akan didapatkan molekul-molekul DNA rantai ganda yang baru hasil polimerasi dalam jumlah yang lebih banyak dibandingkan dengan jumlah DNA cetakan yang digunakan. Banyaknya siklus amplifikasi tergantung pada kosentrasi DNA target di dalam campuran reaksi. Paling tidak, diperlukan 25 siklus untuk melipatgandakan satu kopin sekuen DNA target di dalam genom mamalia agar hasilnya dapat dilihat secara langsung, misalnya dengan elektroforosis gel agarose.

Akan tetapi, pada umumnya kosentrasi DNA polimerasi Taq menjadi terbatas setelah 25 – 30 siklus amplikasi. 3.

Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP)

Shanghai ShineGene Molecular Biotech,Inc. (2009) menyatakan bahwa campuran dNTP adalah larutan air pada pH 7,0 yang mengandung dATP, dCTP, dGTP dan dTTP, masing-masing pada konsentrasi akhir baik 10mm atau 25mm. dNTP yang siap digunakan merupakan solusi yang dirancang untuk menghemat waktu dan untuk menyediakan reproduktifitas yang lebih tinggi dalam aplikasi PCR dan lainnya. 4.

DNA Polimerase

Pada awal perkembangannya, DNA polymerase yang digunakan dalam PCR adalah fragmen Klenow DNA polymerase I yang berasal dari Escherichia coli (Mullis dan Fallona, 1989). Fragmen Klenow adalah DNA polymerase yang telah dihilangkan aktivitas eksonuklease (5’ → 3’)-nya. Beberapa kelemahan fragmen Klenow antara lain adalah bahwa enzim ini tidak tahan panas, laju polemerase untuk menggabungkan nukleotida dengan suatu primer secara terus-menerus tanpa terdisosiasi dari komplek primer-DNA cetakan. Hampir semua DNA polymerase mempunyai prosesivitas yang rendah sehingga akan terdisosiasi dari komplek primer-DNA cetakan setelah menggabungkan kurang dari 10 nukleotida. Salah satu perkecualian adalah T7 DNA polymerase yang mampu menggabungkan ribuan nukleotida tanpa terdisosiasi dari komplek primer-DNA cetakan. a. Taq DNA Polimerase Taq DNA polymerase yang beraasal dari bakteri Thermus aquaticus BM, yaitu suatu strain yang tidak mempunyai endonuklease retriksi TaqI. Taq DNA polymerase tersusun atas satu rantai polipeptida dengan berat molekul kurang lebih 95 kD. Enzim ini mempunyai kemampuan polimerasi DNA yang sangat tinggi, tetapi tidak mempunyai aktivitas eksonuklease 3’ → 5’. Enzim ini paling aktif pada pH9 (pada suhu 200 C) dan suhu aktivitas optimumnya sekitar 750C – 800C. Kelebihan enzim Taq DNA polimerase adalah bahwa enzim ini tahan terhadap suhu tinggi yang diperlukan untuk memisahkan rantai DNA cetakan. Dengan kelebihan semacam ini maka tidak diperlukan penambahan enzim pada tiap-tiap siklus PCR seperti yang harus dilakukan kalau enzim yang dig unakan adalah fragmen Klenow DNA polymerase I (Gelfand dan White, 1990). Kelebihan lain enzim Taq DNA polymerase adalah laju polimerasinya yang sangat tinggi serta prosesivitasnya yang juga lebih tinggi disbanding dengan fragmen Klenow. Taq DNA polymerase mempunyai suhu optimum yang tinggi untuk sintesis DNA yaitu 5 – 0 C. aktivitas spesifik enzim ini dalam menggabungkan nukleotida mencapai 50 nukleotida per detik per molekul enzim. aktu paruh (half-time) Taq DNA polymerase pada suhu 95 C adalah 40 menit ( elfand dan hite 990).

Deterjen non-ionik Tween 20 (0,5 -1 %) dapat digunakan untuk meningkatkan efisiensi Taq DNA polymerase. Senyawa tambahan lain yang juga dapat meningkatkan efisiensi polimerasi Taq DNA polymerase adalah DMSO, gelatin, gliserol, dan ammonium sulfat. Salah satu kelemahan enzim Taq DNA polymerase adalah bahwa enzim tersebut mempunyai potensi untuk melakukan kesalahan dalam menggabungkan nukleotida sehingga ada kemungkinan terjadi mutasi pada fragmen gen hasil amplifikasi. Meskipun demikian dengan kondisi yang tepat, kesalahan penggabungan nukleotida semacam itu tidak terjadi seperti misalnya hasil amplifikasi fragmen gen HIV-1 (5400 nukleotida) dengan siklus amplifikasi 30 kali. Demikian juga halnya dengan hasil amplifikasi gen ßglobin (14990 nukleotida). Dengan demikian , rata-rata frekuensi kesalahan penggabungan nukleotida sekitar 5 X kesalahan per nukleotida yang digabungkan per siklus, dengan menggunakan 25 siklus. Taq DNA polymerase mempunyai keunikan yaitu bahwa enzim ini mampu menambahkan satu nukleotida,terutama dATP, pada ujung -3’ fragmen DNA hasil polimerasi meskipun tanpa ada cetakanya. Dengan demikian, ujung fragmen DNA hasil polimerasi dengan metode PCR pada umumnya tidak pepat (blunt-ended), melainkan ada tambahan satu nukleotida pada kedua ujungnya. Kenyataan semacam ini mempunyai implikasi penting karena fragmen DNA hasil polimerasi dengan metode PCR dapet diligase dengan suatu plasmid vector tertentu tanpa menggunakan enzim DNA ligase. Hal ini juga perlu diperhatikan jika frag men DNA hasil PCR akan diligasikan dengan suatu plasmid dengan metode ligasi pepat (blunt-ended ligation). Sebelum dilakukan ligasi , fragmen DNA tersebut harus dibuat pepat/tumpul dengan menggunakan aktivitas polymerase 5’ → 3’ fragmen Klenow. Aktivitas Taq DNA polymerase dipengaruhi oleh kosentrasi ion magnesium. Aktivitas Taq DNA polymerase mencapai maksimal pada kosentrasi sebesar 2,0 mM jika kosentrasi dNTP yang digunakan adalah 0,7 – 0,8 mM. kosentrasi lebih tinggi dari 2,0 mM akan menghambat aktivitas Taq DNA polymerase. Di samping itu, aktivitas enzim polymerase ini juga akan menurun 20-30% jika kosenrasi total dNTP yang digunakan mencapai 4-6 mM. b. Tth DNA polimerse Enzim DNA polimerse lain yang juga dapat digunakan untuk melakukan PCR adalah Tth DNA polimerse. Enzim ini diisolasi dari eubakteri thermofilik Thermus thermophilus HB8. Tth DNA polimerse mempunyai prosesivitas yang tinggi dan tidak mempunyai aktivitas eksonuklease 3’ → 5’. Enzim ini menunjukkan aktivitas tertinggi pada pH 9 (pada suhu 25 ) dan suhu sekitar . Selain aktivitas polymerase, enzim ini juga mempunyai aktiviatas transcriptase balik (reverse transcriptase) intrinsik yang sangat efisien dengan adanya ion mangan. Aktivitas trankriptase balik tersebut jauh lebih tinggi disbanding dengan aktivitas serupa yang dimiliki oleh DNA polymerase I yang ada pada Escherichia coli maupun pada Taq DNA polymerase. Tth DNA polimerse juga dapat menggunakan substrad yang dimodifikasi sehingga juga dapat digunakan untuk melabel fragmen DNA dengan radionukleotida, digoxigenin maupun biotin. Oleh karena enzim Tth DNA polimerse mempunyai aktivitas transkiptase balik yang tinggi pada suhu tinggi maka enzim ini dapat digunakan untuk mengatasi masalah yang

timbul akibat adanya struktur skunder pada molekul RNA. Dengan demikian, enzim ini dapat digunakan untuk melakukan RT-PCR (reverse Transkriptase PCR). Molekul cDNA yang diperoleh dari hasil reaksi transkripsi balik dapat sekaligus diamplifikasi dengan menggunakan Tth DNA polimerse dengan adanya ion . Enzim ini dapat dilakukan untuk melakukan RT-PCR molekul RNA sampai ukuran 1000 pasangan basa. c. Pwo DNA polymerase Enzim Pwo DNA polymerase diisolasi dari archaebacterihiperthermofilik Pyrococcus woesei. Enzim Pwo DNA polymerase mempunyai berat molekul sekitar 90 kD. Enzim ini mempunyai prosesivitas polimerasi 5’ 3’ yang tinggi mempunyai aktivitas eksonuklease , dan tidak menunjukkan aktivitas eksonuklease . Pwo DNA polymerase mempunyai stabilitas thermal yang lebih tinggi dibandingkan dengan Taq DNA polymerase. Waktu paruh enzim ini lebih dari 2 jam pada suhu , sedangkan Taq DNA polymerase hanya mempunyai waktu paruh 5 menit pada suhu ini. Aktivitas eksonuklease 3’ 5’ (aktivitas proof-reading dalam proses sintesis DNA) yang dimiliki oleh Pwo DNA polymerase meningkatkan ketepatan (fidelity) proses sintesis DNA sepuluh kali lebih tinggi dibandingkan dengan ketepatan yang dimiliki oleh Taq DNA polymerase. Jika Taq DNA polimerse digunakan untuk mengamplikasi sekuen DNA sepanjang 200 bp sebanyak satu juta kali maka kurang lebih 56% produk amplifikasinya akan mangandung satu atau lebih kesalahan. Sebalikya, jika enzim Pwo DNA polymerase yang digunakan untuk amplifikasi maka hanya 10% produk amplifikasinya yang mengandung kesalahan. Ketepatan proses polimerasi DNA secara in vitro merupakan salah satu parameter paling penting dalam PCR. Hal ini terutama sangat penting jika DNA atau RNA cetakan yang digunakan hanya berjumlah sangat sedikit. Hasil amplifikasi menggunakan Pwo DNA polymerase adalah molekul DNA dengan ujung pepat/tumpul (blunt-ended) sehingga dapat digunakan dalam proses ligasi ujung tumpul secara langsung tanpa harus dilakukan modifikasi terhadap ujung-ujung molekul DNA. Oleh karena sifat ketepatanya yang tinggi maka enzim ini sangat berguna untuk aplikasi: 1) Cloning produk PCR 2) Studi polimorfisme alel dalam transkrip RNA individual 3) Karakterisasi mutasi yang jarang di dalam suatu jaringan 4) Karakterisasi status alel suatu sel tunggal atau DNA molekul tunggal 5) Karakterisasi populasi sel dalam suatu kultur d. Pfu dan Tli DNA polymerase DNA polymerase lain yang dapat digunakan untuk PCR adalah Pfu DNA polymerase dan Tli DNA polymerase. Pfu DNA polymerase diisolasi dari Pyrococcus furiosis, mempunyai berat molekul 92 kD, aktif pada suhu dan mempunyai aktivitas eksonuklease . Enzim ini diketahui mempunyai laju kesalahan yang paling kecil disbanding dengan enzim DNA polymerase yang lain. Produk amplifikasi dengan menggunakan enzim ini adalah molekul DNA dengan ujung tumpul.

Tli DNA polymerase diisolasi dari jasad Thermococcus litoralis, sangat stabil terhadap panas, aktivitas optimum pada suhu dan dapat berfungsi meskipun diinkubasi pada suhu . Berat molekul enzim ini dalah 90 kD. Enzim juga mempunyai aktivitas eksonuklease . 5. PCR buffer dan konsentrasi Mg2+ Buffer standar untuk PCR tersusun atas 50mM KCl, 10mM Tris-Cl (pH8.3) dan 1.5mM MgCl2. Buffer standard ini akan bekerja dengan baik untuk DNA template dan primer dengan kondisi tertentu, tetapi mungkin tidak optimum dengan kombinasi yang lain. Produk PCR buffer ini terkadang dijual dalam bentuk tanpa atau dengan MgCl 2. Konsentrasi ion magnesium dalam PCR buffer merupakan faktor yang sangat kritikal, karena kemungkinan dapat mempengaruhi proses annealing primer, temperatur dissosiasi untai DNA template, dan produk PCR. Hal ini disebabkan konsentrasi optimal ion Mg2+ itu sangat rendah. Hal ini penting untuk preparasi DNA template yang tidak mengandung konsentrasi chelating agent yang tinggi, seperti EDTA atau phosphat. Ion Mg2+ yang bebas bila terlalu rendah atau tidak ada, maka biasanya tidak menghasilkan produk akhir PCR, sedang bila terlalu banyak ion Mg2+yang bebas akan menghasilkan produk PCR yang tidak diinginkan. C. Peralatan Khusus yang Digunakan dalam PCR PCR memerlukan alat khusus dalam prosesnya, alat-alat tersebut antara lain: 1. 2. 3.

4.

Mighty-small II SE-250 vertical gel electrophoresis unit (Hoefer) Perkin-Elmer/Cetus Thermal Cycler Perkin-Elmer/Cetus Thermal Cycler adalah peralatan laboratorium yang digunakan untuk analisis PCR, atau replikasi cepat dari urutan DNA tertentu. Sterile Thin-wall 0.5 ml Thermocycler microfuge tubes: (TC-5, Midwest Scientific). Alat ini memiliki sebuah thermal block dengan lubang-lubang untuk memasukkan tabung campuran PCR.

D. Tahapan Proses PCR Polymerase Chain Reaction (PCR) terdiri dari tiga proses, yaitu: 1. Denaturasi Denaturasi merupakan proses memisahkan DNA menjadi utas tunggal. Tahap denaturasi DNA biasanya dilakukan pada kisaran suhu 92 – 95 oC. Denaturasi awal dilakukan selama 1 – 3 menit diperlukan untuk meyakinkan bahwa DNA telah terdenaturasi menjadi untai tunggal. Denaturasi yang tidak berlangsung secara sempurna dapat menyebabkan utas DNA terputus. Tahap denaturasi yang terlalu lama dapat mengakibatkan hilangnya aktivitas enzim polimerase.

2. Annealing Annealing merupakan proses penempelan primer. Tahap annealing primer merupakan tahap terpenting dalam PCR, karena jika ada sedikit saja kesalahan pada tahap ini maka akan mempengaruhi kemurnian dan hasil akhir produk DNA yang diinginkan. Faktor yang mempengaruhi tahap ini antara lain suhu annealing dan primer. Suhu annealing yang terlalu rendah dapat mengakibatkan timbulnya pita elektroforesis yang tidak spesifik, sedangkan suhu yang tinggi dapat meningkatkan kespesifikan amplifikasi. Kenaikan suhu setelah tahap annealing hingga mencapai 70–740C bertujuan untuk mengaktifkan enzim TaqDNA polimerase. Proses pemanjangan primer (tahap extension) biasanya dilakukan pada suhu 72 oC, yaitu suhu optimal untuk TaqDNA polimerase. Selain itu, pada masa peralihan suhu dari suhu annealing ke suhu extension sampai 70 oC juga menyebabkan terputusnya ikatan-ikatan tidak spesifik antara DNA cetakan dengan primer karena ikatan ini bersifat lemah. Selain suhu, semakin lama waktu extension maka jumlah DNA yang tidak spesifik semakin banyak. 3. Extension Extension merupakan proses pemanjangan DNA. Dalam tahap extension atau sintesis DNA, enzim polimerase bergabung bersama dengan nukleotida dan pemanjangan primer lengkap untuk sintesis sebuah DNA utas ganda. Reaksi ini akan berubah dari satu siklus ke siklus selanjutnya mengikuti perubahan konsentrasi DNA. Hasil sintesa DNA dalam satu siklus dapat berperan sebagai cetakan (template) pada siklus berikutnya sehingga jumlah DNA target menjadi berlipat dua pada setiap akhir siklus. Dengan kata lain DNA target meningkat secara eksponensial, sehingga setelah 30 siklus akan menjadi milyaran amplifikasi DNA target.

E. Aplikasi PCR PCR dirancang pada tahun 1985 dab telah memberikan dampak besar pada penelitian biologis dan bioteknologi. PCR telah digunakan untuk memperkuat DNA dari berbagai macam sumber misalnya fragmen DNA kuno dari gajah purba (mammoth) berbulu yang telah membeku selama 40.000 tahun; DNA dari sedikit darah;, jaringan, atau air mani yang ditemukan di tempat kejadian perkara kriminal; DNA dari sel embrionik tunggal untuk diagnosis kelainan genetik sebelum kelahiran dan DNA gen virus dari sel yang diinfeksi oleh virus yang sulit terdeteksi seperti HIV (Campbell dkk., 2004:395). Menurut Darmo dan Ari (2000), teknik PCR dapat didayagunakan (kadang dengan modifikasi) guna fasilitasi analisis gen. Selain itu telah dikembangkan banyak sekali aplikasi praktis. Sebagai contoh teknik dan aplikasi PCR dapat disebutkan sebagai berikut: kloning hasil PCR; sekuensing hasil PCR; kajian evolusi molekular; deteksi mutasi ( penyakit genetik; determinasi seks pada sel prenatal; kajian forensik (tersangka kriminal, tersangka ayah pada kasus paternal); dan masih banyak lainnya.

Pendapat lain mengenai manfaat dan aplikasi PCR juga dikemukakan oleh Sunarto (1996) yang menyebutkan bahwa PCR dapat digunakan sebagai alat diagnosis penyakit thalesemia. Menurut Sunarto sebelum cara PCR ditemukan analisis DNA dilakukan dengan prosedur yang panjang dan rumit, yaitu pertama-tama membentuk perpustakaan (library construction) melalui digesti dengan endonuklease restriktif dan kloning, kemudian skrining, mapping, subkloning dan terakhir sekuensing. Tetapi dengan adanya PCR dalam waktu 24 jam sejak pencuplikan vili korialis (chorionic villous sampling) diagnosis prenatal sudah dapat ditegakkan dan berdasarkan prinsip PCR telah dikembangkan cara diagnostik molekular yang terbukti sangat akurat. Berdasarkan uraian diatas penemuan dan manfaat teknik PCR ini berdampak sangat luas terhadap kemajuan sains dan teknologi secara umum yaitu antara lain sebagai berikut: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Memperkuat gen spesifik sebelum diklon. Membuat fragmen gen DNA secara berlimpah Dapat mendeteksi DNA gen virus yang sulit untuk dideteksi Dapat mendeteksi/ mendiagnosis DNA sel embrionik yang mengalami kelainan sebelum dilahirkan. Bidang kedokteran forensik. Contohnya mendeteksi penyakit yang dapat menginfeksi, variasi dan mutasi dari gen. Mengetahui hubungan kekerabatan antar spesies atau untuk mengetahui dari mana spesies tersebut berasal. Melacak asal usul seseorang dengan membandingkan “finger print"

F. Kelebihan dan Kelemahan PCR 1. Kelebihan 

1. Memiliki spesifisitas tinggi  2. Sangat cepat, dapat memberikan hasil yang sama pada hari yang sama  3. Dapat membedakan varian mikroorganisme  4. Mikroorganisme yang dideteksi tidak harus hidup  5. Mudah di set up 2. Kelemahan    

Sangat mudah terkontaminasi Biaya peralatan dan reagen mahal Interpretasi hasil PCR yang positif belum tervalidasi untuk semua penyakit infeksi (misalnya infeksi pasif atau laten) Teknik prosedur yang kompleks dan bertahap membutuhkan keahlian khusus untuk melakukannya.

G . Amplifikasi DNA fase padat Kaca slide yang oligonukleotida yang terikat secara kovalen menjadi sasaran memblokir langkah 1 jam menggunakan 5 × SSC buffer yang mengandung 0,1% Tween 20, 0,1% BSA (New England Biolabs), dicuci di 5 × SSC penyangga dan akhirnya dicuci dalam air untuk menghilangkan garam. Amplifikasi DNA dimulai pada slide kaca dengan campuran PCR mengandung 1 × PCR buffer, empat dNTP pada 0,1 mM masingmasing, 0,1% BSA, 0,1% Tween dilengkapi dengan 1 nM DNA dan ampliTaq Emas polimerase (0,05 U / ml, PE Biosystems, Foster City, CA). Sampul slide Slip kaca (4 mm diameter) direndam ke dalam 100 ml dari campuran PCR ditempatkan ke tabung PCR (200 ml, microamp TM, PE Biosystems). Untuk slide kaca mikroskop, campuran PCR ditempatkan dalam ruang bingkai segel (MJ Research, Waterton, MA). Tabung dan slide kaca mikroskop yang dimasukkan ke dalam 16 × 16 blok menara kembar thermocycler (PTC 200, MJ Research). Thermocycling dilakukan sebagai berikut: 94 ° C selama 9 menit dan 50 siklus (94 ° C selama 45 s, 65 ° C selama 3 menit dan 72 ° C selama 4 menit). Slide kaca dicuci di 5 × SSC, 0.1% Tween 20 (2 × 10 menit) dan dibilas dan disimpan dalam 5 × SSC sampai digunakan. H . Amplifikasi fase padat dari DNA template Jumlah diperkuat molekul DNA target berikut fase padat PCR dengan meningkatnya konsentrasi DNA template yang ditambahkan dalam larutan diukur dengan menggunakan tes hibridisasi dengan probe radioaktif dan neon. Amplifikasi ini khusus untuk template yang berisi ekor melengkapi primer terikat pada permukaan. Jumlah produk amplifikasi fase padat bervariasi dengan konsentrasi DNA dalam larutan dan bangkit dengan peningkatan jumlah siklus PCR. Hal ini menunjukkan bahwa amplifikasi fase padat memang tergantung pada konsentrasi DNA target awal dan pada jumlah siklus amplifikasi. Tingkat amplifikasi diamati dengan nM DNA terkonsentrasi solusi 1 dan 10 yang kompatibel dengan perilaku amplifikasi linear, seperti yang diperkirakan oleh model amplifikasi antarmuka. Peningkatan jumlah siklus PCR memungkinkan deteksi DNA target template pada rentang konsentrasi picomolar. Sebuah dataran tinggi di produk amplifikasi diamati dengan konsentrasi DNA di atas 10 nM. Dalam kondisi ini kepadatan pemuatan fase padat diperkuat DNA ~0.05 fmol / mm 2. Karena kepadatan primer loading 15 fmol / mm 2 (pada 50 pM primer), kita menyimpulkan bahwa 1 dari 300 primer diubah menjadi DNA target. Tidak adanya kejenuhan primer

dapat dijelaskan oleh efek penyaringan dari molekul DNA terpasang sebelumnya yang bisa mencegah molekul DNA tambahan mencapai primer di permukaan. I . Kontribusi antarmuka dan permukaan amplifikasi selama fase padat PCR Fase amplifikasi padat dapat terjadi oleh dua proses, antarmuka dan permukaan amplifikasi, tergantung pada ada atau tidak adanya template dalam larutan. Kontribusi amplifikasi permukaan selama amplifikasi fase padat ditandai sebagai berikut. Dua siklus PCR dilakukan dengan DNA template dalam larutan kovalen melekat template ke slide kaca dengan amplifikasi antarmuka. Solusi awal PCR diganti dengan campuran PCR segar kurang template DNA dan amplifikasi dilanjutkan lagi selama 28 siklus. Jumlah produk amplifikasi permukaan kemudian ditentukan oleh hibridisasi radioaktif. Kepadatan pemuatan awal DNA kovalen melekat setelah dua siklus pertama adalah 0.0011 fmol / mm 2. Setelah 28 siklus lebih tanpa DNA dalam larutan, cakupan DNA mencapai ~ 0,0029 fmol / mm 2, yang menunjukkan bahwa DNA awalnya terpasang diamplifikasi 3 kali lipat, rata-rata, berdasarkan amplifikasi permukaan. Kami telah menunjukkan sebelumnya bahwa, selama PCR, setengah dari molekul asam nukleat terlampir dibebaskan dari permukaan ke dalam campuran PCR. Oleh karena itu, amplifikasi dapat terjadi dalam larutan dan produk amplifikasi solusi mungkin terlibat dalam amplifikasi antarmuka. Namun menggantikan solusi PCR setelah setiap siklus selama 28 siklus tidak mengubah cakupan permukaan akhir, mengesampingkan mekanisme yang terakhir. Ketika template DNA dipertahankan dalam larutan PCR selama PCR (30 siklus), hasil amplifikasi fasa padat adalah 10 kali lipat lebih tinggi (0.019 fmol / mm 2). Oleh karena itu kami menyimpulkan bahwa amplifikasi antarmuka dominan atas amplifikasi permukaan selama fase padat PCR ketika kedua proses terjadi bersamaan.

BAB 3 PENUTUP

3.1 Kesimpulan Dapat disimpulkan bahwa kimia fasa padat yang paling cocok untuk lampiran primer amino-diderivatisasi slide kaca untuk fase padat PCR adalah melalui s-MBS heterobifunctional cross-linker dan 5'-tiol oligonukleotida dimodifikasi. S-MBS cross-linker menyediakan kimia yang kuat dan dapat dengan mudah ditingkatkan. Dengan metode ini, kami menemukan bahwa oligonukleotida menjadi padat menempel pada permukaan kaca. Keterkaitan s-MBS tahan terhadap kondisi PCR dan kopling untuk dukungan yang solid sangat spesifik untuk 5'-tiol oligonukleotida dimodifikasi. Kekhasan lampiran terhadap 5'-end tergantung-kimia dan, seperti sebelumnya ditunjukkan dengan di-sulfida terkait oligonukleotida (13), sudah jauh membaik ketika kelompok 5'-fungsional yang terlibat dalam obligasi, seperti kelompok tiol , berbeda dengan kelompok fungsional hadir pada DNA. Menggunakan hubungan s-MBS, permukaan kaca functionalised tidak menghambat PCR dan amplifikasi berikutnya untai DNA terjadi pada permukaan kaca obyek.

3.2 Saran dan Kritik Makalah ini dibuat agar materi yang disampaikan dapat bermanfaat bagi semua mahasiswa yang membaca dan dapat dijadikan bahan pembelajaran tambahan pada mata kuliah tersebut .

DAFTAR PUSTAKA Molecular Diagnostic PCR Handbook _ viljonn_pdf Appl.Environ.Microdion-1994-Alvarez-374-6 J.Clim.Microbiol-1993-Mallet-1444-9 Nucl.Acids Res.-2000-Adssi-e87 Shchepinov,MS, Case-Green,SC and Southern,EM ( 1997 ) Nucleic Acids Res. , 25 , 1155 –1161. Kwiatkowski,M., Fredriksson,S., Isaksson,A., Nilsson,M. and Landegren,U. ( 1999 ) Nucleic Acids Res. , 27 , 4710 –4714. Biotektanaman. (2009). Mendeteksi produk PCR melalui DNA elekterphoresis. Diakses pada tanggal 28 Februari 2012 dari http://biotektanaman.wordpress.com/2009/06/25/mendeteksi-produk-pcr-melaluidna-elektrophoresis/. Campbell, N.A., J.B. Reece, L.G. Mitchell. (2002). Biologi jilid 1. Jakarta: Erlangga. Dadan, S dan Imran. (2010). Optimalisasi templat DNA genom udang galah Macrobrachium rosenbergii dalam proses PCR-RAPD. Diakses pada tanggal 24 Februari 2012 dari www.sidik.litbang.kkp.go.id/index.php/searchkatalog/.../561565.pdf