Cromatografía Líquida de Alta Eficacia

CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION

Cromatografía líquida de alta resolucion La Cromatografía líquida de alta eficacia o High o High performance liquid chromatography chromatography (HPLC) es un tipo de cromatografía en columna utilizada frecuentemente en bioquímica en bioquímica y química analítica. analítica. También se la denomina a eces Cromatografía líquida de alta presión o High pressure liquid chromatography chromatography (HPLC)! (HPLC)! aunque esta terminología se considera antigua y est" en desuso. #l HPLC es una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla bas"ndose en diferentes tipos de interacciones químicas entre las substancias analizadas y la columna cromatogr"fica. #n la HPLC la HPLC isocrática el isocrática el compuesto pasa por la columna cromatogr"fica a traés de la fase estacio estacionaria naria (normalmente! (normalmente! un cilindro con peque$as partículas redondeadas con ciertas características químicas en su superficie) mediante el bombeo de líquido ( fase m%il)) a alta presi%n a m%il presi%n a traés de la columna. La muestra a analizar es introducida en peque$as cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones químicas o físicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la colum columna. na. #l grado grado de retenc retenci%n i%n de los compone componente ntess de la muestr muestraa depend dependee de la naturaleza naturaleza del compuesto! compuesto! de la composici%n composici%n de la fase estacionaria estacionaria y de la fase m%il. #l tiempo que tarda un compuesto a ser eluido de la columna se denomina tiempo de retenci%n y retenci%n y se considera una propiedad identificatia característica de un compuesto en una determinada fase m%il y estacionaria. La utilizaci%n de presi%n en este tipo de cromatografías incrementa la elocidad lineal de los compuestos dentro la columna y red reduce uce así su difu ifusi% si%n dentr entro o de la colu colum mna me&o e&oran rando la reso resolu luci ci%n %n de la cromatografí cromatografía. a. Los disolentes disolentes m"s utilizados utilizados son el agua agua!! el metanol y el acetonitrilo acetonitrilo.. #l agua puede contener tampones! sales! o compuestos como el "cido trifluoroacético! trifluoroacético! que ayudan a la separaci%n de los compuestos. 'na me&ora introducida a la técnica de HPLC descrita es la ariaci%n en la composici%n de la fase m%il durante el an"lisis! conocida como elución en gradiente. gradiente . 'n gradiente normal en una cromatografía de fase reersa puede empezar a un  de acetonitrilo y progresar de forma lineal *asta un + en , minutos. #l gradiente utilizado aría en funci%n de la *idrofobicidad del compuesto. #l gradiente separa los componentes de la muestra como una funci%n de la afinidad del compuesto por la fase m%il utilizada respecto a la afinidad por la fase estacionaria. #n el e&emplo! utilizando un gradiente agua-acetonitrilo los compuestos m"s *idrofílicos eluir"n a mayor concentraci%n de agua! mientras que los compuestos m"s *idrof%bicos eluir"n a concentraciones eleadas de acetonitrilo.  menudo! *ace falta realizar una serie de pruebas preias por tal de optimizar el gradiente de forma que permita una buena separaci%n de los compuestos.

Tipos de HPLC Cromatografía de fase normal La cromatografía de fase normal o /0ormal p*ase HPLC/ (0P1HPLC) fue el primer tipo de sistema HPLC utilizado en el campo de la química! química! y se caracteriza por separar los compuestos en base a su polaridad. #sta técnica utiliza una fase estacionaria polar y una fase m%il apolar! y se utiliza cuando el compuesto de interés es bastante polar. #l compuesto polar se asocia y es retenido por la fase estacionaria. La fuerza de adsorci%n aumenta a medida que aumenta la polaridad del compuesto y la interacci%n entre el QUIMICA ANALITICA II

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compuesto polar y la fase estacionaria polar (en comparaci%n a la fase m%il) aumenta el tiempo de retenci%n. La fuerza de interacci%n no s%lo depende de los grupos funcionales del compuesto de interés! sino también en factores estericos de forma que los is%meros estructurales a menudo se pueden diferenciar el uno del otro. La utilizaci%n de disolentes m"s polares en la fase m%il disminuye el tiempo de retenci%n de los compuestos mientras que los disolentes m"s *idrof%bicos tienden a aumentar el tiempo de retenci%n. La 0P1HPLC cay% en desuso a los a$os setenta con el desarrollo del HPLC de fase reersa o Reversed-phase HPLC debido a la falta de reproductibilidad de los tiempos de retenci%n puesto que los disolentes pr%ticos cambiaban el estado de *idrataci%n de la silica o al2mina de la cromatografía.

Cromatografía de fase reversa La HPLC de fase reersa (3P1HPLC) consiste en una fase inm%il apolar y una fase m%il de polaridad moderada. 'na de las fases estacionarias m"s comunes de este tipo de cromatografía es la silica tratada con 34e,5iCl! d%nde la 3 es una cadena alquil tal como C67H89 % C7H69. #l tiempo de retenci%n es mayor para las moléculas de naturaleza apolar! mientras que las moléculas de car"cter polar eluyen m"s r"pidamente. #l tiempo de retenci%n aumenta con la adici%n de disolente polar a la fase m%il y disminuye con la introducci%n de disolentes m"s *idrof%bicos. La cromatografía de fase reersa es tan utilizada que a menudo se lo denomina HPLC sin ninguna especificaci%n adicional. La cromatografía de fase reersa se basa en el principio de las interacciones *idrof%bicas que resultan de las fuerzas de repulsi%n entre un disolente relatiamente polar! un compuesto relatiamente apolar! y una fase estacionaria apolar. La fuerza conductora en la uni%n del compuesto a la fase estacionaria es la disminuci%n del "rea del segmento apolar del analito e:puesto al disolente.#ste efecto *idrof%bico est" dominado por la disminuci%n de la energía libre de la entropía asociada con la minimizaci%n de la interfase compuesto1disolente polar. #l efecto *idrof%bico disminuye con la adici%n de disolente apolar a la fase m%il. #sto modifica el coeficiente de partici%n de forma que el compuesto se muee por la columna y eluye. Las características del compuesto de interés &uegan un papel muy importante en la retenci%n. #n general! un compuesto con una cadena alquil larga se asocia con un tiempo de retenci%n mayor porque aumenta la *idrofobicidad de la molécula. un así! las moléculas muy grandes pueden er reducida la interacci%n entre la superficie del compuesto y la fase estacionaria. #l tiempo de retenci%n aumenta con el "rea de superficie *idrof%bica que suele ser inersamente proporcional al tama$o del compuesto. Los compuestos ramificados suelen eluir m"s r"pidamente que sus is%meros lineales puesto que la superficie total se e reducida. parte de la *idrofobicidad de la fase m%il! otras modificaciones de la fase m%il pueden afectar la retenci%n del compuesto; por e&emplo! la adici%n de sales inorg"nicas prooca un aumento lineal en la tensi%n superficial! y como que la entropía de la interfase compuesto1disolente est" controlada precisamente por la tensi%n superficial! la adici%n de sales tiende a aumentar el tiempo de retenci%n.

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Cromatografía de exclusión molecular La cromatografía de e:clusi%n molecular ! también conocida como cromatografía por filtraci%n en gel! separa las partículas de la muestra en funci%n de su tama$o. =eneralmente se trata de una cromatografía de ba&a resoluci%n de forma que se suele utilizar en los pasos finales del proceso de purificaci%n. También es muy 2til para la determinaci%n de la estructura terciaria y la estructura cuaternaria de las proteínas purificadas. La cromatografía de filtraci%n molecular es un método de cromatografía en columna por el cual las moléculas se separan en soluci%n seg2n su peso molecular! o m"s precisamente! seg2n su radio de 5to>es. #n esta cromatografía! la fase estacionaria consiste en largos polímeros entrecruzados que forman una red tridimensional porosa.  los fines pr"cticos! la columnas se empaquetan con peque$as partículas esferoidales formadas por esos polímeros entrecruzados. #n consecuencia! estas partículas son porosas! y el tama$o de los poros es tal que algunas moléculas (las demasiado grandes) no podr"n ingresar a esos poros! en tanto que otras (las suficientemente peque$as) podr"n pasar libremente. Los poros quedan conectados formando una malla o red! lo cual determina una serie de caminos a ser recorridos por las moléculas que acceden al interior de esta.

Cromatografía de intercambio iónico #n la cromatografía de intercambio i%nico! la retenci%n se basa en la atracci%n electrost"tica entre los iones en soluci%n y las cargas inmoilizadas a la fase estacionaria. Los iones de la misma carga son e:cluidos mientras que los de carga opuesta son retenidos por la columna. lgunos tipos de intercambiadores i%nicos son? i) 3esinas de poliestireno! ii) intercambiadores i%nicos de celulosa y de:tranos (geles) y iii) 5ilica porosa o idrio de tama$o de poro controlado. #n general los intercambiadores i%nicos faorecen la uni%n de iones eleada carga y radio peque$o. 'n incremento en la concentraci%n del contrai%n (respeto a los grupos funcionales de la resina) reduce el tiempo de retenci%n. 'n incremento en el pH reduce el tiempo de retenci%n en las cromatografías de intercambio cati@nico mientras que una disminuci%n del pH reduce el tiempo de retenci%n en las cromatografías de intercambio ani@nic. #ste QUIMICA ANALITICA II

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tipo de cromatografía es ampliament utilizado en las siguientes aplicaciones? purificaci%n de agua! concentraci%n de componentes traza! Ligand-exchange chromatography! Ion-exchange chromatography of proteins! High-pH anion-exchange chromatography of carohydrates and oligosaccharides! etc.

Cromatografía basada en bioafinidad #ste tipo de cromatografía se basa en la capacidad de las sustancias biol%gicamente actias de formar comple&os estables! específicos y reersibles. La formaci%n de estos comple&os implica la participaci%n de fuerzas moleculares como las interacciones de Aan der Baals! interacciones electrost"ticas! interacciones dipolo1dipolo! interacciones *idrof%bicas y puentes de *idr%geno entre las partículas de la muestra y la fase estacionaria.

Parámetros Diámetro interno #l di"metro interno de una columna de HPLC es un aspecto crítico que determina la cantidad de muestra que se puede cargar a la columna y también influye en su sensibilidad. Las columnas de di"metro interno m"s grande (6+ mm) se utilizan normalmente en la purificaci%n de compuestos para su utilizaci%n posterior. #n cambio! las columnas de di"metro interno menor (D1 mm) se utilizan en el an"lisis cuantitatio de las muestras! y se caracterizan por el aumento la sensibilidad y la minimizaci%n del consumo de disolentes que conllean. #stas columnas se suelen denominar columnas de rango analítico y normalmente est"n asociadas a un detector 'A1AE5. parte! e:isten otros tipos de columnas! como las de tipo capilar! con un di"metro inferior a +.8 mm! utilizadas principalmente en espectrometría de masas.

Medida de las partículas La mayoría de HPLC tradicionales se realizan con una fase estacionaria unida al e:terior de partículas esféricas de silica. #stas partículas pueden tener diferentes medidas! siendo las de Fmum de di"metro las m"s utilizadas. Partículas m"s peque$as ofrecen una mayor superficie y una me&or separaci%n! pero la presi%n que se requiere por obtener una elocidad lineal %ptima aumenta de forma inersamente proporcional al cubo del di"metro de la partícula. #sto significa que disminuir la medida de las partículas a la mitad! aumentaría la resoluci%n de la columna! pero a la ez! aumentaría la presi%n necesaria en un factor de oc*o.

Tamao de poro 4uc*as fases estacionarias son porosas para proporcionar una mayor superficie. Los poros peque$os proporcionan una mayor superficie mientras que los poros de mayor medida proporcionan una cinética me&or! especialmente para los compuestos de tama$o m"s grande; por e&emplo! una proteína que sea ligeramente m"s peque$a que el tama$o de los poros puede entrar! pero difícilmente saldr" con facilidad.

Presión de la bomba QUIMICA ANALITICA II

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La presi%n de las bombas es ariable seg2n el modelo y fabricante! pero su rendimiento se mide en su *abilidad para generar un flu&o constante y reproducible. La presi%n puede lograr alores de *asta D+ 4Pa (o unas D++ atm%sferas). Los aparatos m"s modernos de HPLC incorporan me&oras para poder traba&ar a presiones m"s altas y! por lo tanto! poder utilizar partículas de tama$o m"s peque$o en las columnas (G , micrometros). #stos nueos aparatos! denominados !ltra Performance Liquid Chromatography ('PLC) pueden traba&ar con alores de *asta 6++ 4Pa de presi%n (unas 6+++ atm%sferas). (Hay que tener en cuenta que las siglas 'PLC son una marca registrada de Baters Corporation aunque a eces se utilizan de forma general para designar este tipo de aparatos.)

!abricantes de aparatos de HPLC •

gilent Tec*nologies (antiguamente Helett1Pac>ard) Iec>man Coulter! Enc.

•

Jione: Corporation

•

#>sigent Tec*nologies

•

=ilson! Enc.

•

4icro1Tec* 5cientific

•

Per>in#lmer! Enc.

•

Pro:eon Iiosystems  5-

•

5*imadzu 5cientific Enstrumentos

•

T*ermo #lectron Corporation

•

Aarian! Enc.

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Baters Corporation

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Knauer

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5C<

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Cromatografía Líquida de Alta Eficacia

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