Centro Panamericano de Ingeniería Sanitaria y Ciencias del Ambiente
Enviromental Protection Agency
Curso sobre métodos bacteriológicos para el análisis de Agua Potable 23- 27 de octubre del 2000 Lima - Perú
Coliformes totales, termotolerantes y Escherichia coli por el método de filtración de membrana ( FM ) Bióloga: Carmen Vargas G. OPS / CEPIS
RELACIÓN ENTRE COLIFORMES TOTALES, TERMOTOLERANTES Y E. c o l i
coli coli
Escherichia
Coliformes termotolerantes
Coliformes totales
ORGANISMOS COLIFORMES 3
Bacterias Gram-negativas, forma de bastoncillos
3Se
desarrollan en presencia de sales biliares u otros
agentes tensoactivos 3Tienen
propiedades de inhibición.
3Fermentan
la lactosa a 35-37°C, produciendo gas,
ácido y aldehído en 24-48 horas. 3Son
oxidasa negativa y no forman esporas.
3Presentan
actividad a la β-galactosidasa
DEFINICIÓN GRUPO COLIFORME ( FM ) Bacterias aerobias y anaerobias facultativas, gram negativas, no esporuladas y de forma alargada que desarrollan una colonia roja con brillo metálico en un medio tipo Endo que contiene lactosa a inoculación de 35 ± 0,5°C - 24 hrs.
GRUPO COLIFORME GÉNEROS
FUENTE
Escherichia
HECES (humanos y animales)
Klebsiella
HECES, AMBIENTE
Enterobacter
HECES, AMBIENTE
Citrobacter Serratia
AMBIENTE AMBIENTE AMBIENTE AMBIENTE ORGANISMOS PATÓGENOS EN EL AGUA
MÉTODOS PARA COLIFORMES TOTALES Método de filtración por membrana (FM) Un total de 100 ml de muestra en uno o más filtros; por ejemplo,1 filtro con 100 ml ó 4 filtros con 25 ml cada uno.
Preparación de diluciones decimales Muestra de agua
Dilución
Dilución
Dilución
10-1
10-2
10-3
10 ml
cruda
10 ml
Agua de dilución
10 ml
amortiguada 90 ± 2 ml
Volumen filtrado
100 ml
50 ml
25 ml
10 ml
90 ± 2 ml
10 ml
90 ± 2 ml
10 ml
Placas con AGAR mFC ó ALMOHADILLA EMBEBIDA EN CALDO m-FC VOLUMEN DE MUESTRA
ORIGINAL FILTRADA
100 ml
50 ml
10 ml
1 ml
0,1 ml
0.01 ml
COLIFORMES TOTALES - VERIFICACIÓN DEL FM Muestra
Agar mEndo 35° ± 0.5°C, 24 h a) Seleccionar ≤ 5 colonias con brillo metálico, o b) Trasladar las colonias con un hisopo del filtro a
Caldo lauril triptosa 35° ± 0.5°C, 24 - 48 h Crecimiento+, Gas +
Caldo lactosado verde brillante bilis 35 ± 0.5° C, 24 - 48 h Crecimiento+, Gas +
Coliformes totales verificados
DEFINICIÓN COLIFORMES TERMOTOLERANTES (fecales)
Bacterias que forman parte del grupo Coliforme, bacilos gram – negativos, no esporulados que fermentan la lactosa con producción de ácido y gas a 44.5 ± 0,2 °C dentro de las 24 ± 2 hrs. La mayor especie en el grupo de coliformes termotolerantes es la E. Coli.
MÉTODO PARA COLIFORMES TERMOTOLERANTES Se realiza a partir de colonias positivas de coliformes totales en placas con medio m – Endo, las cuales son transferidas en tubos conteniendo medio EC, durante 24 hrs.
CONFIRMACIÓN DE COLIFORMES TERMOTOLERANTES MUESTRA AGAR m-ENDO ó m-ENDO LES 35°C ± 0,5 °C / 24 HRS SELECCINAR 5 COLONIAS VERDE DORADO Y CON BRILLO METÁLICO
CALDO EC 44,5 °C ± 0,2 °C / GAS (+) 24 HRS COLIFORMES TERMOTOLERANTES ( fecales)
PRUEBA PARA COLIFORMES TERMOTOLERANTES POR MF SOLO CON AGUA DE LA FUENTE MUESTRA Medio m - FC 44,5 °C ± 0,2 °C / 24 hrs. COLONIAS AZULES COLIFORMES TERMOTOLERANTES ( fecales )
DEFINICIÓN Escherichia coli
Bacteria Coliforme que posee la enzima β- d Glucoronidasa y es capaz de romper el sustrato 4-metil umbeliferil glucorónido ( MUG) con la producción de fluorescencia cuando crece en los medios EC – MUG a 44.5 ± 0,2 °C en 24 ± 0,2 horas en Agar nutritivo con MUG a 35°C ± 0,5 en 4 horas
E. coli MÉTODO DE FILTRACIÓN DE MEMBRANA MUESTRA AGAR m-ENDO ó m-ENDO LES 35°C ± 0,5 °C / 24HRS SELECCINAR 5 COLONIAS VERDE DORADO Y CON BRILLO METÁLICO
CALDO EC + MUG 44,5 °C ± 0,2 °C/ gas (+) 24 hrs FLUORESCENCIA LUZ UV 366 nm
E. coli
E. coli
FILTRACIÓN DE MEMBRANA – MEMBRANA FILTRANTE
( MÉTODO DE MATES SHAFFER) MUESTRA
AGAR m-ENDO ó m-ENDO LES 35°C, 24 Hrs a) Seleccionar ≤ 5 colonias con brillo metálico. b) Trasladar el filtro al
AGAR NUTRITIVO + MUG 35,5 °C ± 0,2 °C / 4 hrs FLUORESCENCIA LUZ UV 366 nm
E. coli
VENTAJAS DEL MÉTODO DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA •
Proporciona recuentos directos.
•
Es más preciso ( se obtienen resultados más reproducibles) que la prueba de FTM o NMP.
•
Rápido y fácil de realizar.
•
Analiza mayores volúmenes de muestras con bajas concentraciones de organismo.
Calculo de la densidad de coliformes por el método de filtración de membrana
Colonias de coliformes/100 ml = Colonias de coliformes contados x 100 ml de muestra filtrada
Se expresa en UFC / 100 µl
DESVENTAJAS DEL MÉTODO DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA •
Intervienen los altos niveles de turbiedad.
•
Los coliformes debilitados pueden sobrevivir mejor en la prueba de FTM o NMP.
•
Las altas concentraciones de no coliformes interfieren en el recuento.
•
Efecto del tipo de filtro de membrana.
VERIFICACIÓN •
VERIFICAR TODAS LAS COLONIAS DE COLIFORMES TOTALES SI HAY IGUALDAD O MENOR A 5 COLONIAS EN EL FILTRO.
•
VERIFICAR 5 COLONIAS ELEGIDAS ALEATORIAMENTE DEL FILTRO CON MÁS DE 5 COLONIAS EN EL FILTRO.
TASA DE VERIFICACIÓN método de filtración por membrana 1.
Porcentaje de verificación = (Número total de tubos positivos)
X 100
(Número total de tubos inoculados) 2.
Recuento de coliformes totales verificados = Fracción % de verificación x (Coliformes/100 ml)* * Recuento en membrana
RECOMENDACIONES
*
Analizar 100 ml de muestra, independiente del método elegido.
*
La muestra debe analizarse dentro de las 30 horas de recolección.
*
Usar etanol al 95% en medio m-Endo (alcohol no desnaturalizado)
RECOMENDACIONES (CONTINUACIÓN)
*
Realizar el control apropiado de esterilidad: agar, caldo, amortiguador de fosfato y filtros.
*
Probar los nuevos lotes de filtros para la recuperación y efectos en la morfología de las colonias.
*
No guardar el agar por más de 2 semanas; desechar las almohadillas humedecidas con el medio de cultivo después de 96 horas.
