PRACTICA N° 2 CARIOTIPO HUMANO I INTRODUCCIÓN Los cromosomas son las estructuras formadas por la condensación de la cromatina durante los procesos de división celular. Se tiñen intensamente con colorantes básicos que interaccionan con el DNA. Los cromosomas mitóticos humanos cuando están duplicados tienen una forma similar a una X. Las cromátidas hermanas se mantienen unidas por una región de constricción primaria llamada centrómero. Su posición es variable; si se encuentra en la parte media, los cromosomas son metacéntricos; si se encuentra desplazado hacia un extremo (dando brazos de diferente tamaño, p y q), produce cromosomas submetacéntricos; si está cerca del extremo final serán acrocéntricos y si es terminal telocéntricos. En el humano existen normalmente cromosomas cromosomas de los l os tres primeros tipos, no existiendo e xistiendo telocéntricos, los cuales se observan en otros organismos, como por ejemplo el ratón. El cariotipo es el arreglo ordenado de los cromosomas que generalmente se muestra organizado de acuerdo a su tamaño y patrón de bandeo de los mismos en la metafase mitótica. Representa el complemento cromosómico cromosómico de un individuo de una especie. El análisis de las características características de los cromosomas cromosomas y sus anomalías anomalías es el objeto de estudio de la citogenética humana. Cada cromosoma normal tiene una morfología y un tamaño constantes. En la actualidad, el análisis cromosómico, con una mejora espectacular en su resolución a nivel citológico y genómico, es un procedimiento de importancia importancia creciente en numerosas áreas de la medicina clínica. Para el análisis cromosómico sistemático que se lleva a cabo por motivos clínicos, las células tienen que ser capaces de crecer y dividirse rápidamente. Es posible realizarlo con una variedad de tejidos, pero el de elección es el cultivo de linfocitos de sangre periférica. Además de linfocitos, es posible realizar cultivos (más laboriosos) de fibroblastos dérmicos, de células exfoliadas de mucosas, de células fetales presentes en el líquido amniótico y otras. Se pueden efectuar preparaciones directas (sin cultivo) de células de médula ósea obtenidas por punción; aunque la calidad de estas preparaciones es menor que las de los cultivos, tienen la ventaja de ser analizables el mismo día de la toma de la muestra. La clasificación básica de los cromosomas humanos en metafase fue derivada de conferencias en Denver (1960), Londres (1963) y Chicago (1966). Se acordó numerar los autosomas en pares del 1 al 22 de acuerdo al tamaño decreciente y posición del centrómero principalmente. Los 22 pares de autosomas se dividen en 7 grupos (A-G) los cuales son fácilmente distinguibles con tinciones comunes. Los cromosomas sexuales fueron designados X e Y.
El bandeo cromosómico contribuye a identificar los cromosomas individuales y las anomalías estructurales de los cromosomas. Las técnicas de bandeo incluyen el bandeo de quinacrina, Giemsa, invertido, C y NOR. El bandeo de alta resolución, utilizando cromosomas en profase o en prometafase, aumenta el número de bandas observables.
OBJETIVOS
1. Explicar los fundamentos en los que se basa la técnica de cultivo de linfocitos y el bandeo Giemsa (bandeo G). 2. Reconocer los cromosomas humanos y elaborar un cariotipo a partir de una fotografía.
FUNDAMENTO TEORICO:
Cariotipado clásico Existen varios métodos para la visualización mediante microscopía óptica de los cromosomas humanos. Los procedimientos más clásicos consisten en la tinción con sustancias como la mostaza de quinacrina, que permite la observación de las bandas Q, giemsa, que permite la observación de las bandas G, R o C (dependiendo del tratamiento que se realice con el ADN). Este bandeo característico de cada uno de los cromosomas está relacionado con regiones de eucromatina (bandas R), heterocromatina facultativa (bandas G), heterocromatina constitutiva (bandas C). El cariotipo de alta resolución, basado en la tinción de los cromosomas en profase o prometafase, permite distinguir más de ochocientas bandas. No obstante existen distintas visiones del motivo por el cual se pueden hacer estas correlaciones.El uso de técnicas de bandeo junto al estudio del cariotipo ha sido utilizado para la detección de aberraciones cromosómicas a gran escala. Es decir, aberraciones que afectan a regiones de un cromosomas o al propio cromosoma. Estas aberraciones cromosómicas o anomalías cromosómicas se pueden dividir en numéricas y estructurales.Un idiograma es la representación esquemática del tamaño, forma y patrón de bandas de todo el complemento cromosómico, los cromosomas se sitúan alineados por el centrómero, y con el brazo largo siempre hacia abajo.
Los grupos que comprende el cariotipo humano son los siguientes: - Cromosomas grandes Grupo A, (cromosomas 1, 2 y 3), metacéntricos Grupo B, (cromosomas 4 y 5), submetacéntricos
- Cromosomas medianos Grupo C, (cromosomas 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y además los cromosomas X), submetacéntricos Grupo D, (cromosomas 13, 14 y 15) acrocéntricos
- Cromosomas pequeños Grupo E, (cromosomas 16, 17 y 18) submetacéntricos Grupo F, (cromosomas 19 y 20) metacéntricos Grupo G, (cromosomas 21 y 22) acrocéntricos
Cariotipo El cariotipo es el patrón cromosómico de una especie expresado a través de un código, establecido por convenio, que describe las características de sus cromosomas. (véase el apartado Nomenclatura de este artículo). Debido a que en el ámbito de la clínica suelen ir ligados, el concepto de cariotipo se usa con frecuencia para referirse a un cariograma, el cual es un esquema, foto o dibujo de los cromosomas de una célula metafásica ordenados de acuerdo a su morfología (metacéntricos, submetacéntricos, telocéntricos, subtelocéntricos y acrocéntricos) y tamaño, que están caracterizados y representan a todos los individuos de una especie. El cariotipo es característico de cada especie, al igual que el número de cromosomas; el ser humano tiene 46 cromosomas (23 pares porque somos diploides o 2n) en el núcleo de 1
cada célula, organizados en 22 pares autosómicos y 1 par sexual (hombre XY y mujer XX).Cada brazo ha sido dividido en zonas y cada zona, a su vez, en bandas e incluso las bandas en sub-bandas, gracias a las técnicas de marcado. No obstante puede darse el caso, en humanos, de que existan otros patrones en los cariotipos, a lo cual se le conoce como aberración cromosómica.
Los cromosomas se clasifican en 7 grupos, de la A a l a G, atendiendo a su longitud relativa y a la posición del centrómero, que define su morfología. De esta manera, el cariotipo humano queda formado así:
Grupo A: Se encuentran los pares cromosómicos 1, 2 y 3. Se caracterizan por ser cromosomas muy grandes, casi metacéntricos. En concreto, 1 y 3 metacéntricos; 2 submetacéntrico.
Grupo B: Se encuentran los pares cromosómicos 4 y 5. Se trata de cromosomas grandes y submetacéntricos (con dos brazos muy diferentes en tamaño).
Grupo C: Se encuentran los pares cromosómicos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, X. Son cromosomas medianos submetacéntricos.
Grupo D: Se encuentran los pares cromosómicos 13, 14 y 15. Se caracterizan por ser cromosomas medianos acrocéntricos con satélites.
Grupo E: Se encuentran los pares cromosómicos 16, 17 y 18. Son cromosomas pequeños, metacéntrico el 16 y submetacéntricos 17 y 18.
Grupo F: Se encuentran los pares cromosómicos 19 y 20. Se trata de cromosomas pequeños y metacéntricos.
Grupo G: Se encuentran los pares cromosómicos 21, 22, Y. Se caracterizan por ser cromosomas pequeños y acrocéntricos (21 y 22 con satélites).
Mediante el cariotipado se pueden analizar anomalías numéricas y estructurales, cosa que sería muy difícil de observar mediante genética mendeliana.
Requisitos para el estudio del cariotipo Ante todo, deben guardarse las máximas condiciones de esterilidad. Además, debe cumplirse lo siguiente:
Las células deben encontrarse en división. Para ello, se hará la incubación de la muestra en presencia de productos inductores de la mitosis (mitógenos), como es e l caso de fitohemoaglutinina. Las células deben pararse en prometafase, em pleando colchicina, la cual interfiere en la polimerización de los microtúbulos del huso mitótico. Con el objetivo de conseguir una buena separación c romosómica, las células deben someterse a choque osmótico. Para ello, se emplea un medio hipotónico (0,075M KCl), que ocasiona el aumento de volumen de las células.
Las células tienen que ser fijadas.
Hay que proceder a la tinción de los cromosomas para que sean identificables.
Tinción El estudio de los cariotipos es posible debido a la tinción. Usualmente un colorante adecuado es aplicado después de que las [células] hayan sido detenidas durante la división celular mediante una solución de colchicina. Para humanos los glóbulos blancos son los usados más frecuentemente porque son fácilmente inducidos a crecer y dividirse en cultivo de tejidos. Algunas veces las observaciones pueden ser realizadas cuando las células no se están dividiendo (interfase). El sexo de un neonato feto puede ser determinado por observación de células en la interfase (ver punción amniótica y corpúsculo de Barr). La mayoría (pero no todas) las especies tienen un cariotipo estándar. El ser humano normalmente tiene 22 pares de cromosomas autosómicos y un par de cromosomas sexuales. El cariotipo normal para la mujer contiene dos cromosoma X denominado 46,XX, y el varón un cromosoma X y uno Y, denominado 46 XY. Cualquier variación de este cariotipo estándar puede llevar a anormalidades en el desarrollo. En los laboratorios de Citogenética se utilizan varias técnicas de bandeo cromosómico. En este sentido, destaca el método de tinción de las bandas de quinacrina (bandas Q) . Fue el primero en emplearse, requiere un microscopio de fluorescencia, aunque su uso ya no está tan extendido como el de las bandas de giemsa (bandas G). Para producir estas
bandas G se aplica una tinción de Giemsa tras digerir parcialmente las proteínas cromosómicas con tripsina. Las bandas reversas (bandas R) requieren tratamiento por calor y en ellas se invierte el patrón normal blanco y negro que se observa en l as bandas Q y G. Este método destaca por su gran utilidad en la tinción de los extremos distales de los cromosomas. Existen otras técnicas de tinción como las bandas C y las NOR (región de organizadores nucleolares), tiñendo estos últimos específicamente ciertas regiones del cromosoma. Así, las bandas C tiñen la heterocromatina constitutiva , que se localiza normalmente cerca de los centrómeros, y la tinción NOR marca los satélites y tallos de los cromosomas acrocéntricos. Las bandas de alta resolución suponen la tinción de los cromosomas en profase o metafase precoz (prometafase) antes de alcanzar la condensación máxima. Los cromosomas en profase y prometafase están más elongados que los cromosomas en metafase; por este motivo, el número de bandas observadas, para el conjunto de
cromosomas, aumenta desde 300-450 hasta casi 800. Ello permite detectar anomalías menos claras, que con las bandas convencionales no suelen apreciarse. Para obtener este tipo de bandas se necesita añadir otro requisito para la realización del cariotipo. Se trata de un componente utilizado en quimioterapia, el metotrexato que junto con l a colchicina se añade antes de realizar la tinción.
MATERIAL Y METODO Materiales
Ampliaciones de fotografías de cromosomas humanos en metafase, teñidos con Giemsa (bandeo G)
Goma
Tijeras
Regla graduada en milímetros
Luna de aumento
Hilo pabilo 0.5 m
Calculadora
Láminas y videos acerca de técnica de cultivo de linfocitos y cariotipo.
Método 1. Contar los cromosomas de la ampliación fotográfica y recortar el contorno de cada uno de ellos. 2. Medir las longitudes de brazos largos y cortos y la longitud total de los cromosomas y registrar los datos. 3. Ordenar los cromosomas en una tabla por tamaños caracterizando los cromosomas humanos en M metacéntrico, SM submetacéntrico y A acrocéntrico; considerar como referencia los valores medios de las dimensiones de los brazos del cuadro adjunto 4. Realizar la identificación de los pares cromosómicos por su patrón de bandas G mostrado por modelo adjunto. 5. Representar el cariotipo colocando los cromosomas manteniendo los centrómeros en una misma línea, los autosomas en orden decreciente de tamaño y los cromosomas sexuales en el extremo inferior derecho.
TAREA A REALIZAR 1. Construir el cariotipo del individuo a quien pertenece la fotografía propuesta. Anote la fórmula cromosómica correspondiente.
FOTOGRAFÍA DE CROMOSOMAS EN METAFASE
CARIOTIPO HUMANO
A 1
2
B
3
4
5
11
12
C 6
7
8
D 13
F
14
15
G
9
10
E
16
17
18
19
20
21
22
X
Y
FÓRMULA CROMOSÓMICA : 46 XY
2.
Realizar un dibujo de su observación microscópica de láminas con cromosomas.
3. En el siguiente texto que se refiere a la técnica de cultivo de linfocitos para cariotipo, llenar los espacios vacíos con los términos que crea conveniente. Para la realización del…CARIOTIPO…. Se necesitan 1-3 ml de sangre heparinizada. Tras ello, se realiza la siembra de la sangre periférica (lo antes posible tras su extracción, pero puede obtenerse un crecimiento aceptable hasta 2-3 días después de la extracción). El medio de cultivo donde se siembra la sangre es un medio que lleva suero fetal de ternera enriquecido y protegido con …ANTIBIOTICOS ... y …ANTIFUNGICOS .., al que se le añade …FITOHEMAGLUTININA …. Para estimular su crecimiento y transformación de los linfocitos T. Después de 72 horas de cultivo, se detiene la división celular en metafase añadiendo…COLCHICINA …. (inhibe la formación del…HUSO y la división ACROMATICO … del…CENTROMERO….). Posteriormente se añade una…SOLUCION HIPOTONICA …..para que las células se hinchen y se lisen, con lo que los…CROMOSOMAS …. se liberan y permanecen intactos los centrómeros, tras ello
se fijan los cromosomas para que no s separen y luego se extienden en portaobjetos. Después se tiñen con diversas técnicas y entonces están disponibles para el estudio.
CONCLUSIONES
El cariotipo humano es el conjunto de cromosomas en la fase M (fase de máximo empaquetamiento de la cromatina).
El advenimiento de las técnicas de bandeo cromosómico, dotan hoy a la citogenética de una nueva herramienta otorgándole una mayor precisión en la individualización de los cromosomas, facilitando su agrupamiento y clasificación morfológica: la determinación de aberraciones cromosómicas de importante incidencia en animales con problemas de reducción de la fertilidad: la localización de genes que confluyen al mapeo genético
ya no me kede mas :( al menos valio la pena...aunke fue muy dificil tener ke verlo, era irreconocible...se nota ke la paso mal...y ....no se....oye...este viuaje me ayudo a pensar mas cosas, tmr, no s eke hacer contigo, trate de borrarte de mi mente too ese tiempo...dime....despues de haber salido konmigo...ke opinas de mi ahora....ke opinas de lo ke spoy despues de ke konversamos, confias mas en mi, me tienes mas desconfianza, no lo se :( ...jaja aunke dijimos ke se trataria sera tranka ya no sera komo antes cuando nos timbrabamos pa entrar o nos leiamos a cada ratiko...mmmmm...te confese muchas cosas de mi dime ke piensas? eres la unika ke le kuento eso...espero no ekivocarme kontio pes
