Metode yang direkomendasikan untuk Identifikasi dan Analisis Barbiturat dan Benzodiazepin di bawah Kontrol internasional
Pengantar
Latar belakang
Barbiturat dan benzodiazepin yang digunakan dalam pengobatan sebagai antikonvulsan, anxiolytics, hipnotik, sedatif, relaksan otot rangka dan obat penenang. Saat ini, dua belas barbiturat dan tiga puluh lima benzodiazepin berada di bawah pengawasan internasional. Mereka yang telah menemukan bahwa barang terlarang tersebut telah mulai disalah gunakan di pasar halal.
Kasus kejang yang diakibatkan oleh benzodiazepin dan barbiturat meningkat lebih dari 50 persen antara tahun 2005 dan 2009 sesuai dengan World Drug Report 2011. Benzodiazepin umum digunakan di antara pengguna narkoba. Penggunaan non-medis barbiturat, benzodiazepin dan obat penenang lain bersama-sama dengan opioid telah menjadi fenomena yang biasa terlihat di banyak daerah.
Pengamatan terhadap keberadaan pasar paralel, di mana obat resep yang dijual di luar kontrol otoritas kesehatan serta melalui apotek yang beroperasi secara illegal.
Benzodiazepin, khususnya aprazolam dan diazepam, adalah salah satu
psikotropika paling sering digelapkan dan disalahgunakan. Namun, mengingat
tidak adanya informasi mengenai pola penggunaan narkoba secara keseluruhan, sulit untuk memperkirakan tingkat penggunaan obat resep non-medis di seluruh dunia.
Klasifikasi dan definisi
Barbiturat adalah obat yang bertindak sebagai depresan sistem saraf pusat, dan, berdasarkan ini, mereka menghasilkan spektrum efek yang luas, dari sedasi ringan sampai anestesi total. Terapi Barbiturat digunakan sebagai anestesi, antikonvulsan, anxiolytics, hipnotik sedatif dan biasanya diklasifikasikan menurut durasi efek klinis yaitu panjang, menengah, pendek dan sangat pendek.
Barbiturat adalah obat sintetis yang berasal dari asam barbiturat yang merupakan produk kondensasi sintetis asam malonat dan urea. Dari sertiap jenis semua berbeda terutama dalam pola substitusi pada posisi-5 dengan beberapa juga termasuk N-metil pada N-1. Turunan paling terkenal, fenobarbital telah digunakan medicinally sejak tahun 1912, terutama dalam pengobatan epilepsi.
Lebih dari 2.500 barbiturat dilaporkan telah disintesis dengan lebih dari 50 dari ini saat ini dipasarkan untuk penggunaan klinis di seluruh dunia. Dua belas di antaranya adalah subjek kontrol internasional di bawah Konvensi Psikotropika 1971 sebagai berikut:
Daftar II : sekobarbital
Daftar III : amobarbital, butalbital, cyclobarbital dan pentobarbital
Daftar IV : Allobarbital, barbital, butobarbital, methylphenobarbital,
fenobarbital, secbutabarbital dan vinylbital
Dalam beberapa tahun terakhir, telah terjadi penurunan yang signifikan dalam resep dan oleh karena itu ketersediaan umum barbiturat dikurangi karena efek samping mereka dan terkait masalah ketergantungan.
Pengecualian adalah fenobarbital yang masih digunakan sebagai
antikonvulsan/anti-epilepsi. Selama bertahun-tahun, alternatif untuk barbiturat memiliki dikembangkan termasuk methaqualone dan mecloqualone (metode yang Direkomendasikan untuk identifikasi dan analisis methaqualone/Mecloqualone, ST/NAR/15/Rev.1), benzodiazepin dan senyawa terkait.
Senyawa murni
Informasi yang berkaitan dengan masing-masing dari dua belas barbiturat (allobarbital, amobarbital, barbital, butalbital, butobarbital, cyclobarbital, methylphenobarbital, fenobarbital, pentobarbital, secbutabarbital, secobarbital dan vinylbital) saat ini sedang dikontrol oleh internasional. Selain itu, Kamus multibahasa dari Narkotika dan Psikotropika di bawah kontrol International
(MLD, ST/NAR/1/Rev.2) memberikan informasi tentang nomenklatur barbiturat yang derivatif di bawah pengawasan internasional. Ini juga termasuk sinonim dan berbeda nama dagang untuk zat yang relevan dan menyediakan informasi mengenai kendali mereka status.
Analisis kualitatif dan kuantitatif bahan mengandung barbiturat
Umumnya, dalam upaya untuk menentukan identitas suatu zat yang dicurigai mengandung barbiturate, pendekatan analitisnya harus memerlukan penentuan setidaknya dua parameter berkorelasi salah satunya harus memberikan informasi tentang bahan kimia struktur analit (misalnya, IR, MS, atau tandem, metodenya seperti GC-MS). Hal ini diakui bahwa pemilihan parameter dalam setiap kasus tertentu harus mempertimbangkan obat yang terlibat dan sumber daya laboratorium yang tersedia.
Bila mungkin, tiga teknik analisis yang sama sekali berbeda harus digunakan, untuk contoh: tes warna, kromatografi (misalnya TLC, GC atau HPLC) dan spektroskopi (Mis. IR atau UV). Teknik ditulis dgn tanda penghubung, seperti kromatografi gas - spektrometri massa (GC-MS), dihitung sebagai dua parameter, memberikan informasi dari kedua
teknik yang digunakan (yaitu waktu retensi dan karakteristik spektral massa).
Sampling
Kasus kejang yang disebabkan barbiturat dan zat terkait mungkin terutama terdiri dari obat diformulasikan sebagai tablet, kapsul, cairan mulut atau suntikan. Sampling tergantung pada jumlah dan jenis unit dosis yang diterima.
Alasan utama untuk prosedur pengambilan sampel adalah keakurat dan bermakna analisis kimia. Karena sebagian besar metode, kualitatif dan kuantitatif, yang digunakan di laboratorium forensik analisis obat memerlukan sampel bahan yang mewakili, itu adalah penting bahwa sampel bahan kecil mewakili sebagian besar dari yang mereka miliki telah diambil.
Setelah memilih bahan yang akan diperiksa, analis harus mengidentifikasi spesifik obat tersebut dan mengukur jumlah obat ini jika hal ini diperlukan. Deskripsi spesifik obat tersebut juga berperan, jika dari halal
sumber, harus diidentifikasi dengan mengacu pada database yang sesuai dan identitas dikonfirmasi.
Pada saat menganalisis harus diingat bahwa jika bentuk sediaan tampak
dari sumber terlarang, yaitu tidak dikenali sebagai produk farmasi, maka penuh analisis kimia dari material termasuk ekstraksi obat, tes dugaan,
skrining dan tes konfirmasi akan diperlukan.
Ekstraksi dan persiapan sampel
Teknik ekstraksi untuk zat dalam tablet, kapsul, larutan air (untuk
injection), sirup, residu dari jarum suntik harus disebutkan dan referensi yang dibuat untuk farmakope yang relevan. Aspek-aspek umum, misalnya kelarutan, asam atau konsentrasi garam dari obat dalam penyusunan legal, harus dipertimbangkan.
Hampir semua barbiturat yang dihadapi dalam peredaran gelap muncul dalam bentuk tablet, kapsul dan bubuk curah dialihkan dari sumber yang sah.
Untuk analisis kualitatif
Metode
Menggiling menjadi serbuk halus (tablet atau kapsul isi atau obat bubuk) dan tambahkan sejumlah kecil metanol yang cukup untuk mendapatkan larutan yang mengandung sekitar 1 sampai 20 mg / ml barbiturat. Ekstrak dapat digunakan secara langsung atau disaring dan diuapkan sampai kering di bawah aliran nitrogen.
Untuk analisis kuantitatif
Kapsul dan tablet yang mengandung barbiturat dalam bentuk asam bebas
Metode
Menggabungkan isi dari sejumlah perwakilan dari kapsul atau tablet yang ditentukan pada saat sampling. Kemudian dari sampel yang diperoleh ditimbang sejumlah berat awal dari tablet atau kapsul, dan masukkan ke dalam labu ukur. Tambahkan etil asetat. Ekstrak dapat digunakan secara langsung atau disaring dan diuapkan sampai kering di bawah aliran nitrogen.
Kapsul dan tablet yang mengandung barbiturat dalam bentuk garam
Metode
Larutkan sejumlah bahan dari sampel yang representatif dari barbiturat, masukkan kedalam labu ukur dan tambahkan etyl asetat kemudian ektrak dapat digunakan secara langsung atau disaring dan diuapkan sampai kering dibawah aliran nitrogen.
Pemeriksaan Bahan Yang Mengandung Barbiturat
Tes Dugaan
Tablet dan kapsul
Tes Warna
Ini harus ditekankan bahwa hasil positif dari tes warna hanya dugaan yang indikasi kemungkinan adanya turunan barbiturat.
Uji Dille-Koppanyi
Larutan 1: Larutkan 0.1g Cobaltous asetat tetrahidrat dalam 100 ml
metanol absolut, kemudian tambahkan 0,2 ml Asam asetat
glasial.
Larutan 2: Campurkan 5 ml isopropylamine dengan 95 ml Metanol
absolut.
Prosedur
Tiga tetes larutan 1, diikuti oleh tiga tetes larutan 2 ditambahkan ke sejumlah kecil diduga sampel pada pelat uji.
Disarankan untuk secara terpisah melakukan kontrol negatif dan menggunakan bahan referensi dari tersangka barbiturat untuk hasil yang positif.
Hasil
Sebuah warna ungu menunjukkan adanya barbiturat tetapi tidak menunjukkan barbiturat tertentu.
Uji Koppanyi-Zwikker
Ini merupakan modifikasi dari tes Dille-Koppanyi.
Larutan 1: Siapkan 1 persen solusi b / v kobal nitrat dalam etanol,
kemudian tambahkan 10μl dari pyrrolidine
Prosedur
Sampel yang akan diuji dilarutkan dalam 1 ml etanol pada pelat uji kemudian tambahkan satu tetes larutan 1
Hasil
Barbiturat memberikan warna biru-violet. Namun, sejumlah imida lain dan jenis obat sulphonamide juga bereaksi.
Catatan:
Warna-warna dijelaskan untuk hasil positif dari tes dugaan diatas adalah penilaian subjektif karena persepsi individual warna. Oleh karena itu, aspek subjektif dari evaluasi warna, perlu untuk setiap analis untuk menguji standar acuan yang tepat untuk memastikan bahwa warna setiap tes hasilnya dapat dikenali. Demikian pula, disarankan untuk melakukan tes kosong tanpa substansi sasaran untuk memastikan keakraban dengan warna reagen. Jika dilakukan dengan benar, tes warna negatif umumnya cukup dapat diandalkan dalam membangun tidak adanya senyawa target. Namun, hasil positif hanya dugaan indikasi kemungkinan adanya suatu senyawa. Banyak senyawa lainnya, sering tidak berbahaya dan tidak terkendali oleh undang-undang nasional atau perjanjian internasional, dapat memberikan warna yang sama dengan tes reagen warna yang diberikan. Oleh karena itu, wajib untuk analis untuk mengkonfirmasi tes positif untuk setiap warna dikontrol secara hukum senyawa dengan menggunakan analisis laboratorium tambahan.
Penentuan dalam bentuk garam
Untuk tujuan kuantitatif, maka perlu untuk mengetahui apakah barbiturat hadir sebagai asam bebas atau dalam bentuk garam.
Uji Kelarutan
Tempatkan sejumlah kecil bahan tersangka dalam masing-masing dua tabung reaksi.
Tambahkan beberapa tetes air ke dalam tabung reaksi pertama dan beberapa tetes etil asetat yang kedua.
Perhatikan di mana pelarut melarutkan bahan. Asam bebas larut dalam organik pelarut seperti etil asetat, tetapi tidak larut dalam air.
Bentuk garam barbiturat mudah larut dalam air, tetapi tidak larut dalam etil asetat. Lainnya pelarut organik seperti eter dan kloroform dapat menggantikan etil asetat.
Penentuan pH
Tempatkan sejumlah kecil (10-20 mg) yang dicurigai barbiturat dalam tabung reaksi dan tambahkan 1 ml air.
Tentukan pH.
Sebuah pH lebih dari 8,0 menunjukkan bahwa barbiturat hadir sebagai natrium atau garam kalsium.
Kromatografi lapis tipis (TLC)
TLC adalah teknik yang umum digunakan untuk pemisahan dan identifikasi obat yang diproduksi. Metode ini murah, cepat, sensitif (sub-miligram kuantitas analit diperlukan), fleksibel dalam pemilihan kedua fase stasioner dan mobile dan setuju untuk berbagai macam zat, di dasar dan garam bentuk, mulai dari paling polar bahan non-polar.
Berbagai teknik visualisasi dapat digunakan. Namun, di banyak negara itu tidak diterima sebagai suatu teknik untuk obat identifikasi.
Pelat TLC (fase stasioner)
Pembungkusan: gel G Silica dengan ketebalan lapisan 0,25 mm dan mengandung lembam indikator, yang berfluoresensi di bawah sinar UV panjang gelombang 254 nm (gel GF254 Silica).
Ukuran plat yang khas: 20 x 20 cm; 20 x 10 cm; 10 x 5 cm (yang terakhir harus digunakan dengan sisi 10 cm vertikal dengan tangki TLC).
Pelat disiapkan oleh analis harus diaktifkan sebelum digunakan dengan menempatkan mereka ke dalam oven pada suhu 120 ° C selama paling sedikit 10 sampai 30 menit. Pelat kemudian disimpan dalam sebuah greasefre desikator biru silika gel. Aktivasi
Sistem pelarut (fase mobile, berdasarkan volume)
Sistem A: Etil asetat, metanol, 25 persen larutan amonia (85:10:5 v/v/v)
Sistem B: Chloroform, aseton (80: 20 v / v)
Catatan: Karena potensi karsinogenik kloroform sistem ini hanya boleh digunakan dengan tepat. Tindakan pengamanan dan ventilasi.
Persiapan larutan untuk diterapkan pada pelat TLC
Siapkan larutan sampel dalam metanol pada konsentrasi sekitar 5 mg / ml. Semua standar larutan harus disiapkan pada konsentrasi 5 mg / ml dalam metanol. Totolkan sekitar 12 ml sampel dan larutan standar ke plat TLC.
Uji Visualisasi
Pelat harus dikeringkan sebelum visualisasi. Hal ini dapat dilakukan pada
120 ° C selama 5 menit dalam oven atau dengan menggunakan blower udara
Panas.
Metode visualisasi
Sinar UV pada 254 nm
Pertama mengamati piring di bawah sinar UV panjang gelombang pendek (254nm). Paparan piring uap amonia terkonsentrasi dan mengamati lagi di bawah sinar UV pada saat yang sama pada panjang gelombang 245 nm.
Merkuri klorida-diphenylcarbazone semprot reagen
Larutkan 0.1g dari diphenylcarbazone dalam 50 ml etanol untuk menghasilkan larutan A. Larutkan 1 gram merkuri klorida dalam 50 ml etanol untuk menghasilkan larutan B. Dua larutan (A dan B) harus baru disiapkan dan dicampur sebelum digunakan. Barbiturat memberikan bintik-bintik biru-violet pada latar belakang merah muda pada plat TLC. Batas deteksi sekitar 1-5μg.
Catatan: merkuri klorida-diphenylcarbazone adalah reagen semprot yang paling sensitif di antara banyak diuji untuk mendeteksi barbiturat. Namun, penggunaan garam merkuri tidak dapat direkomendasikan karena masalah lingkungan. Deteksi dengan visualisasi metode 1 sudah cukup, tetapi harus penggunaan reagen ini masih diperlukan, prosedur penyemprotan harus dilakukan dengan perawatan khusus untuk menjaga terhadap uap merkuri berbahaya.
Interpretasi
Setelah visualisasi, menandai tempat (misalnya dengan pensil) dan menghitung faktor keterbelakangan (Rf) nilai.
Rf = (jarak Migrasi: dari asal ke pusat spot)/(Pengembangan jarak:
dari asal pelarut depan).
Hasil (dinyatakan sebagai Rf x 100)
SENYAWA
Mengembangkan sistem
A
B
Allobarbital
31
50
Amobarbital
40
52
Barbital
33
4
Butalbital
44
54
Butobarbital
39
50
Cyclobarbital
35
50
Methylphenobarbital
41
70
Pentobarbital
44
55
Fenobarbital
29
47
Secbutabarbital
44
50
Secobarbital
42
55
Vinybital
40
38
Catatan analitis
Nilai Rf tidak selalu direproduksi karena perubahan kecil dalam komposisi piring dan aktivasi, dalam sistem pelarut, saturasi tangki atau jarak pembangunan. Oleh karena itu, nilai Rf yang diberikan adalah indikasi dari perilaku kromatografi zat yang terdaftar.
Kromatografi gas (GC) dengan detektor ionisasi nyala (FID)
Instrumen GC pilihan untuk pekerjaan analitis rutin adalah lubang kapiler sempit kromatografi gas, menggunakan kolom dengan diameter antara 0,2 dan 0,32 mm. Hal ini diakui bahwa ada laboratorium yang, karena berbagai alasan, mungkin ingin mempertahankan sistem dikemas kolom. Bagi laboratorium, metode menggunakan kolom dikemas digambarkan dalam edisi awal dari manual (ST/NAR/18) dan tidak termasuk dalam versi revisi ini.
Teknik kolom kapiler tanpa derivatisasi
Kondisi pengoperasian
Kolom : 25m x 0.35mm: Film ketebalan 0.52μm atau sempit
Tahap : Fused silika, kimia terikat dan cross-linked methylsilicon atau
methylphenylsilicone, seperti OV-1, SE-30, SE-5 atau setara
Pembawa : Nitrogen pada 1ml/min (atau helium)
Injector : Split / pisah, 275 Rasio Split: 20:01
Oven : isotermal pada 200 ° C atau diprogram 200-260 ° C pada 4° C
Menit
Detector : FID 275 ° C, hidrogen 35 ml / menit, air 350 ml / menit
Standar internal : n-alkana
Injeksi : 1μl
Preparasi sampel
Siapkan internal standar, standar obat dan larutan sampel pada konsentrasi
1 mg / ml. Gunakan ekstrak sampel yang diperoleh seperti yang dijelaskan sebelumnya. Menyuntikkan berturut-turut 1μl sampel dan larutan standar ke dalam kromatografi gas.
Hasil
SENYAWA
Indeks Retensi
SE-30
SE-45
Allobarbital
1575
1629
Amobarbital
1695
1751
Barbital
1465
1519
Butalbital
1642
1698
butobarbital
1642
1695
Cyclobarbital
1946
2026
Methylphenolbarbital
1875
1950
Pentobarbital
1719
1779
Fenobarbital
1934
2012
Secbutabarbital
1635
1692
Secobarbital
1770
1827
Vinybital
1712
1774
Catatan:
Semua metode ini harus mencakup penggunaan standar yang sesuai.
Banyak analis lebih memilih untuk derivatize barbiturat menggunakan beberapa bentuk methylating agen, tapi banyak yang menganggap itu tidak dapat diandalkan untuk analisis kuantitatif.
Kromatografi Gas - Spektrometri Massa (GC-MS)
GC-MS adalah salah satu teknik yang paling umum digunakan untuk identifikasi dan kuantisasi sampel obat forensik. Sebagai "ditulis dgn tanda penghubung" teknik, menggabungkan daya pemisahan GC dengan kekhususan analit dari teknik spektroskopi, menyediakan data spektral yang sangat spesifik pada senyawa individu dalam kompleks campuran seringkali tanpa
pemisahan sebelumnya.
Pembuatan larutan sampel
Metode yang sama persiapan sampel dijelaskan pada bagian 3.5 dapat diadopsi.
Kondisi operasi GC-MS
Kolom : 30m x 0.25mm; Film ketebalan 0.25μm
Tahap : Fused silika, kimia terikat dan cross-linked methylsilicone atau
methylphenylsilicone, seperti DB-1, OV-1, SE-30, SE-54 atau
setara
Pembawa : Helium di 1ml/min; aliran konstan (atau tekanan konstan)
Injector : Split / pisah, 250-300 ° C (yang sesuai)
Oven : isotermal pada 200 ° C atau diprogram 200-260 ° C pada 4 ° C menit (sama seperti untuk analisis kapiler GC dijelaskan di atas atau equivanlent)
Detector : Modus Ionisasi: modus EI, 70 eV
Transfer line temp : 280 ° C (atau sesuai)
Ion sumber temp : 230 ° C (atau sesuai)
Parameter Scan : TIC (SIM jika diperlukan),
Rentang pemindaian : untuk 500amu
Hasil
Identifikasi dilakukan dengan membandingkan waktu retensi dan spektrum massa analit dengan standar referensi. Semua senyawa diidentifikasi oleh GC-MS dan dilaporkan oleh analis harus dibandingkan dengan spektrum massa saat ini standar acuan yang tepat, sebaiknya diperoleh pada instrumen yang sama, dioperasikan bawah kondisi yang sama.
Catatan:
Sebagian besar spektrometer massa memiliki referensi perpustakaan mereka sendiri spektral yang mungkin komersial atau dikembangkan oleh operator. Namun, ini harus digunakan untuk tujuan referensi saja. Perbandingan langsung dari karakteristik GC-MS dari contoh pada uji harus dibandingkan dengan orang-orang dari sampel otentik diturunkan dalam kondisi yang sama.
Kromatografi Gas - Spektrometri Massa (GC-MS) Untuk Barbiturat tertentu
Sebuah metode GC-MS untuk barbiturat yang dipilih termasuk allobarbital, amobarbital, barbital, pentobarbital, fenobarbital dan secobarbital disajikan di bawah ini. Metode dapat disesuaikan untuk analisis kuantitatif barbiturat ini.
Persiapan barbiturat standar dan solusi sampel
Larutan standar barbiturat
Timbang jumlah yang tepat barbiturat standar ke dalam labu volumetrik untuk mendapatkan konsentrasi akhir sekitar 0.1mg/ml dari masing-masing senyawa. Mencairkan volume dengan metanol. Larutan stok ini stabil setidaknya selama tiga bulan bila disimpan pada suhu -20 ° C.
Larutan sampel barbiturat
Timbang jumlah yang tepat dari sampel ke dalam labu volumetrik sehingga konsentrasi barbiturat adalah sekitar konsentrasi dari larutan standar. Encerkan dengan metanol. Tergantung pada asal sampel, setiap larut partikulat padat dapat dihilangkan dengan filtrasi.
Kondisi pengoperasian
Kolom : HP-5ms, Film 0.25μm, leburan silika kapiler, 30m x 0.25mm. i.d.
Suhu kolom: 100 ° C selama 1 menit, kemudian 100-280 ° pada 15 ° C min-1,
tahan pada suhu 280oC untuk 3 min.
Injeksi temp: 250 ° C
Ion sumber temp: 280 ° C
Modus Injection: Splitless
Fase gerak : Helium di 50kPa
Detector : modus EI 70eV; scanning rentang m / z 50-500
Hasil
SENYAWA
Waktu retensi yang mendekati barbital (min)
Barbital
8.00
Allobarbital
8.98
Amobarbital
9.90
Pentobarbital
10.15
Sekobarbital
10.55
Fenobarbital
11.90
High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
HPLC adalah salah satu teknik pemisahan utama yang biasa digunakan dalam obat forensik analisis. Kromatografi fase terbalik direkomendasikan untuk analisis barbiturat. Ada berbagai macam fase stasioner dan mobile tersedia untuk analis. Metode berikut disediakan sebagai panduan. Yang paling umum ditemui dan kolom serbaguna adalah terikat oktadesil silika kolom (C18). Panjang kolom, diameter, ukuran partikel, ukuran pori dan beban karbon harus dipertimbangkan sebelum seleksi akhir kolom.
Persiapan barbiturat standar dan larutan sampel
Larutan standar barbiturat
Timbang jumlah yang tepat barbiturat standar ke dalam labu volumetrik untuk mendapatkan konsentrasi akhir sekitar 1 mg / ml masing-masing senyawa. Encerkan dengan metanol. Larutan stok ini stabil setidaknya selama tiga bulan saat disimpan pada suhu -20 ° C.
Larutan sampel barbiturat
Timbang jumlah yang tepat dari sampel yang diperoleh oleh salah satu prosedur ekstraksi diuraikan diatas ke dalam labu volumetrik, larut dalam dan membuat volume dengan metanol untuk menghasilkan konsentrasi barbiturat akhir dari 1 mg / ml. Tergantung pada asal sampel, setiap partikulat padat larut dapat dihapus dengan penyaringan.
Metode 1
Kolom : 250 mm x 4,6 mm ID
Bahan kemasan: oktadesil-silika HPLC grade, 5μm (Spherisorb 5 ODS-2
atau setara)
Fase gerak : asetonitril: air (30:70 by volume)
Laju alir : 0,9 ml / menit.
Deteksi : UV pada 220 nm atau deteksi diode array (DAD).
Volume Injeksi : 1-5μl
Penghitungan : Dengan luas puncak, metode standar eksternal
Metode 2
Kolom : 150 mm x 4,6 mm ID
Bahan kemasan: oktadesil-silika HPLC grade, 5μm (ODS-Hypersil, atau
setara)
Fase gerak A : 0,1 M sodium penyangga dihidrogen fosfat: metanol (60:40 oleh volume; menyesuaikan pH menjadi 3,5 unit dengan fosfat acid)
Fase gerak B : 0,1 M sodium penyangga dihidrogen fosfat: metanol (60:40 oleh volume; menyesuaikan pH 8,5 unit dengan
natrium hydroxide solution)
Laju alir : 2,0 ml / menit (nilai aliran rendah harus dipertimbangkan
dengan kolom yang lebih pendek dan ukuran partikel yang
lebih kecil).
Deteksi : UV pada 216 nm
Volume Injeksi: 1-5μl oleh jarum suntik atau injeksi lingkaran.
Penghitungan : Dengan luas puncak, metode standar eksternal.
Hasil
SENYAWA
Rasio kapasitas (nilai k')
Metode 1
Metode 2
Fase gerak A
Fase gerak B
Allobarbital
1,35
2,46
1,33
Amobarbital
4,86
10,91
7,05
Barbital
0,60
1,11
0,63
Butalbital
2,90
6,17
3,48
Butobarbital
2,56
5,43
3,42
Cyclobarbital
2,56
5,25
2,61
Methylphenobarbital
5,72
7,27
3,84
Pentobarbital
4,63
10,96
8,07
Phenobarbital
1,94
3,08
1,23
Secbutabarbital
2,24
4,89
3,32
Secobarbital
6,81
16,28
11,47
Vinylbital
4,86
10,40
7,05
Mengikuti metode HPLC [17, 19], yang melibatkan penggunaan standar internal, dapat diadopsi untuk kuantifikasi barbiturat allobarbital dipilih, amobarbital, barbital, cyclobarbital, metharbital, pentobarbital, fenobarbital dan secobarbital.
Metode
Kolom 1 : 2μm TSK gel Super-ODS phase C18-balik, 100 x 4.6 mm.
Kolom 2 : 5μm Hypersil-ODS phase C18-balik, 100 x 4,6 mm.
Suhu kolom : 23 ° C
Injeksi : 2μl
Fase gerak : 30 persen asetonitril, 70 persen (8 mM KH2O3)
Laju alir : 0,4 ml / menit
Panjang gelombang UV: 215 nm
Standar internal: 5 - (4-methylphenyl)-5-phenylhydantoin (MPPH)
Penghitungan : Dengan rasio luas puncak, metode standar internal yang
Hasil
SENYAWA
Waktu retensi barbiturate (min)
Kolom 1
Kolom 2
Barbital
3.8
4.5
Allobarbital
5.1
5.7
Metharbital
5.9
7.2
Fenobarbital
6.1
8.8
Cyclobarbital
7.1
9.6
Pentobarbital
10.6
14.8
Amobarbital
10.9
15.8
Sekobarbital
14.2
19.8
Spektroskopi Inframerah
Secara teoritis, setiap bahan memiliki spektrum inframerah yang unik dan metode ini akan memungkinkan identifikasi tegas dari barbiturat apapun tetapi tidak akan membedakan antara enantiomer.
Untuk bubuk, dilihat dari analisis kromatografi sebelum menjadi cukup murni, spektrum inframerah dapat dijalankan langsung di disk KBr untuk perbandingan dengan spektrum asam barbiturat bebas atau garam.
Namun, dengan farmasi legal tablet dan kapsul sampel pemisahan barbiturat individu dari eksipien dan isolasi mereka dalam bentuk murni sangat penting. Untuk tablet, kapsul dan bubuk yang dicurigai
menjadi campuran, prosedur ekstraksi yang diuraikan di atas dapat digunakan untuk mengisolasi barbiturat sebagai asam bebas.
