ANALISIS PENGAWET BENZOAT DIHITUNG SEBAGAI ASAM BENZOAT DALAM MINUMAN ISOTONIK SECARA KROMATOGRAFI CAIR KINERJA K INERJA TINGGI ANALYSIS OF BENZOAT PRESERVATIVE PRESERVATIVE ASSUMED AS BENZOAT ACID IN ISOTONIC BEVERAGES WITH HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY CHROMATOGRAPHY Mardiyono Fakultas Farmasi Farmasi Universitas Setia Budi Budi Jl. Let. Jen. Sutoyo, Mojosongo, Surakarta 57127
ABSTRAK Benzoat merupakan pengawet organik yang berfungsi sebagai bahan pengawet untuk mencegah pertumbuhan mikrobia (anti mikrobia). Asam benzoat lebih efektif sebagai pengawet dibandingkan natrium benzoat. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui berapakah kadar pengawet benzoat. Percobaan dilakukan dengan metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi fase terbalik, kolom C18, λmaks 227 nm, eluen buffer natrium asetat : metil sianida (85:15), kecepatan alir 1,0 ml/menit. Pertama, mencari panjang gelombang maksimum (λmaks) dari 220 nm-260 nm interval 2 nm, pemilihan komposisi komposisi fase gerak, uji kualitatif, membuat kurva kalibrasi asam benzoat konsentrasi yang digunakan 25ppm ; 50 ppm ; 100 ppm dan 160 ppm. Konsentrasi uji perolehan kembali (upk) 17,30 ppm; 56,60 ppm; dan 105,20 ppm, masing-masing konsentrasi upk dilakukan pengulangan pengulangan 3 kali. Terakhir menetapkan kadar benzoat ditetapkan sebagai asam benzoat dalam 5 jenis minuman isotonik sebagai sampel. Sampel yang mengandung pengawet benzoat adalah sampel A : 113,9375±0,30 113,9375±0,30 ppm dan sampel B : 99,8228±0,07 ppm, sedangkan sampel C, sampel D, dan sampel E tidak mengandung pengawet benzoat. Hasil tersebut sesuai PerMenKes RI No. 722/MEN.KES/PER/IX/88.
Kata kunci : Benzoat, minuman isotonik, KCKT ABSTRACT Benzoat exists as organic preservative used as food preservative agent whose function is to prevent microbial growth (anti microbe). Benzoat acid performs more effectively as a preservative. This observation is aimed to find out whether a certain isotonic beverage contains benzoat preservative and how high is the proportion of benzoat preservative preservative assumed as benzoat acid. Observation is run using reversed phase of “High Performance Liquid Chromatography” (HPLC), column C18, lmax 227 nm, eluen buffer acetat natrium : CH3CN (85 : 15), flow speed 1,0 ml/minute. First, searching for maximum wave-length (l max) from 220 to 260 nm with 2 nm interval, qualitative test, deciding the condition of motion phase, make benzoat acid calibrating calibrating with concentration concentration 25 ppm; 50 ppm; 100 ppm; and 160 ppm. The concentration concentration of re-gaining test for 17,28 ppm; 56,62 ppm; and 105,22 ppm, done in 3 times repetitions to determine benzoat preservative proportion as benzoat acid in 5 samples of isotonic beverages. beverages. Reversed phased of HPLC method can be likely used to analyze benzoat preservative. Samples that contains benzoat preservative preservative is sample A :113,9375±0,30 :113,9375 ±0,30 ppm and sample B : 99,8228±0,07 ppm while sample C, sample sample D and sample E contain no benzoat preserv p reservative. ative. The result gained is acceptable
as the amount of preservative does not exceed maximum limit to PerMenKes RI No. 722/MEN.KES/PER/X/88.
Keywords : Benzoat, isotonic beverages, HPLC PENDAHULUAN Pertumbuhan perusahaan makanan dan minuman kemasan di Indonesia telah mendorong terjadinya perubahan perilaku makan masyarakat. Banyak makanan dan minuman kemasan yang diproduksi terutama memperhatikan aspek selera, sehingga makanan dan minuman tersebut disukai oleh kaum tua maupun muda. Minuman soft drink yang rasanya menyengat pun ternyata bisa dinikmati oleh anak balita (Wahjuningsih, 2003). Masyarakat tertarik bukan hanya pada aspek apakah bahan makanan memberikan citarasa enak? Apakah anak-anak mau menikmati makanan yang disajikan? lebih dari itu masyarakat telah tertarik pada hal-hal apakah bahan makanan yang dikonsumsi itu baik untuknya dan komponen apa saja yang terdapat didalamnya. Minuman isotonik merupakan salah satu contoh bahan makanan atau minuman yang diproduksi oleh pabrik pada umumnya menggunakan bahan tambahan makanan (food additives) termasuk didalamnya adalah bahan pengawet yang secara sengaja ditambahkan kedalam suatu produk makanan atau minuman. Maksud dari penambahan tersebut adalah untuk menjaga kualitas dan karena melalui jalur pemasaran yang cukup panjang untuk sampai kekonsumen sehingga diperlukan umur penyimpanan yang lebih lama, seandainya dalam proses pembuatan kurang bersih, maka akan memacu timbulnya pertumbuhan bakteri dan jamur-jamur yang dapat mengganggu kesehatan Akhir-akhir ini masyarakat tengah diramaikan dengan berita penarikan sejumlah produk minuman isotonik. Kasus ini menjadi aktual setelah Komite Masyarakat Anti Bahan Pengawet (Kombet) pada pertengahan november 2006 mengumumkan temuan fakta tentang penggunaan bahan pengawet pada minuman kemasan. Berbagai opini yang berkembang dimasyarakat simpang siur mengenai kasus ini (http://www.republika.co.id/). Minuman isotonik harus memiliki sifat-sifat yang secara cepat mengosongkan perut dan tinggi penyerapannya di dalam usus. Kedua sifat ini dipengaruhi oleh kadar dan jenis karbohidrat/gula yang digunakan di dalam minuman tersebut. Karena karbohidrat pada kadar < 5 % tidak cukup memberikan kalori untuk meningkatkan efisiensi olahraga, demikian halnya jika > 10 % akan mencegah pengosongan perut, oleh karena itu menurut Dedi Fardiaz, Ketua PATPI Pusat, menyarankan minuman isotonik sebaiknya mengandung 6-8 % karbohidrat. Penggunaan bahan pengawet yang paling banyak digunakan di Indonesia adalah sulfit, nitrit, BHA atau BHT dan benzoat. Pemakaian bahan pengawet dari satu sisi menguntungkan karena dengan bahan pengawet bahan makanan dapat dibebaskan dari kehidupan mikrobia baik yang bersifat pathogen yang dapat menyebabkan keracunan atau gangguan kesehatan lainnya maupun mikrobia non pathogen yang dapat menyebabkan kerusakan bahan makanan misalnya pembusukan. Sisi lain bahwa pada dasarnya bahan pengawet adalah senyawa kimia yang merupakan bahan asing yang masuk bersama makanan yang dikonsumsi, bila pemakaian dan dosisnya tidak diatur dan diawasi kemungkinan besar akan menimbulkan efek yang bersifat langsung misalnya keracunan
ataupun efek yang tidak langsung atau kumulatif misalnya bahan pengawet yang digunakan bersifat karsinogenik (Tranggano dkk., 1991). Benzoat mempunyai toksisitas yang sangat rendah terhadap hewan maupun manusia, karena mempunyai mekanisme detoksifikasi yang efisien. Benzoat sejauh ini tidak mempunyai efek teratogenik (cacat bawaan) dan efek karsinogenik jika dikonsumsi melalui mulut (Wahjuningsih, 2003). Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis bahan pengawet asam benzoat, asam benzoat dipilih di samping sebagai pengawet yang diizinkan karena sering digunakan dalam makanan. Penelitian ini menggunakan metode analisis Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT). METODE PENELITIAN Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah minuman isotonik bernutrisi yang beredar di daerah Surakarta yang diantaranya : Zporto (sampel A), Optima Sweat Grape (sampel B), Powerade Isotonik (sampel C), Pocari Sweet (sampel D), dan Vitazone (sampel E). aquabidestilata, asam benzoat p.a, buffer natrium asetat, CH3CN, glukosa, natrium klorida, larutan natrium hidroksida, kloroform, gas N2, H2SO4. Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah HPG PDA-Knauer HPLC, spektrofotometer UV Shimadzu Model 1210, labu ukur 10ml, labu ukur 2 5 ml dan 100 ml, pipet volum ; 10,0 ml, batang pengaduk, karet penghisap/syringe, kertas saring, neraca analitik elektrik, Erlenmeyer, corong dan beaker glass. Pemilihan kondisi fase gerak Menyuntikkan larutan standar asam benzoat 20 μl dengan konsentrasi 10 ppm kealat KCKT dengan menggunakan panjang gelombang maksimum (227 nm) dengan fase gerak buffer natrium asetat dan metil sianida (85 : 15) dan ( 90 : 10 ) dengan laju aliran 1 ml/menit, dengan menggunakan metode gradient. Uji kualitatif Pada penelitian ini menggunakan metode waktu retensi sebagai uji kualitatifnya. Metode waktu retensi dapat dilakukan dengan menyuntikan larutan baku ke alat KCKT. Larutan standar asam benzoat dengan konsentrasi 10 ppm 30 disuntikkan ke alat KCKT dengan volume injek 20 μl, fase gerak buffer natrium asetat : metil sianida ( 85 : 15 ), kecepatan alir 1 ml/menit dan menggunakan panjang gelombang 227 nm. Pembuatan kurva kalibrasi Menimbang 15 mg baku pembanding asam benzoat dengan seksama dimasukkan kedalam labu ukur 10,0 ml, melarutkan dalam sedikit etanol kocok sampai larut ditambahkan aquabidestilata sampai tanda batas dikocok sampai homogen. Membuat pengenceran baku dengan konsentrasi 25 ppm; 50 ppm; 100 ppm; dan 160 ppm. Masing-masing konsentrasi disuntikkan ke alat KCKT sebanyak satu kali sebesar 20 μl, fase gerak buffer natrium asetat : metil sianida ( 85 : 15 ), kecepatan alir 1 ml/menit dan panjang gelombang maksimum 227 nm. Kurva kalibrasi merupakan hubungan antara luas puncak dengan konsentrasi asam benzoat standart. Berdasarkan data yang diperoleh, dilakukan perhitungan untuk mendapatkan batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ).
Penetapan kadar sampel Sampel minuman dipipet 50 ml, ditambah larutan NaOH 25 ml, dimasukkan kedalam corong pisah dan dieksraksi dengan kloroform sebanyak 50 ml selama 2 menit (fase kloroform dibuang). Diatur pH menjadi 2,42 dengan H 2SO4 pekat. Diekstraksi kembali dengan kloroform 25 ml 2 menit, ditampung fase kloroform ekstraksi diulangi dengan 10 ml kloroform selama 2 menit, tampung fase kloroform. Ditampung dalam cawan penguap dikeringkan dengan N 2 (supaya lebih cepat kering) diatas waterbath kemudian ditambahkan aquabidestilata 25 ml untuk sampel A dan sampel E, sedangkan untuk sampel B, sampel C, dan sampel D diperlakukan sama dengan cara diatas hanya volumenya dicukupkan sebanyak 10 ml. Kemudian menyuntikkan 20 μl sampel A, sampel B, sampel C, sampel D, dan sampel E tersebut kealat KCKT sebanyak 3 kali. Luas alas yang diperoleh dibandingkan dengan luas alas baku pembanding dan kadar dihitung dengan menggunakan kurva kalibrasi. HASIL DAN PEMBAHASAN Pemilihan komposisi fase gerak Hasil pemilihan fase gerak dari buffer natrium asetat : metal sianida ( 85:15 ) dan ( 90:10 ) dapat dilihat pada tabel 1. Tabel 1. Pemilihan komposisi fase gerak buffer natrium asetat : metil sianida (85:15 ) N HETP tR 526,43 0,028 2,868
buffer natrium asetat : metil sianida (90:10 ) N HETP tR 467,42 0,032 3,243
Uji kualitatif Pada uji kualitatif dilakukan untuk menegaskan keberadaan pengawet benzoat sebagai asam benzoat dalam sampel minuman isotonik dengan membandingkan waktu retensi standart dengan sampel. Hasil selengkapnya pada tabel 2 Tabel 2. Waktu retensi Bahan Uji Larutan Standar Asam Benzoat Sampel A Sampel B Sampel C Sampel D Sampel E
Waktu retensi (tR) 2,868 2,883 2,893 -
Berdasarkan waktu retensi yang dihasilkan dapat diketahui bahwa sampel A dan sampel B mengandung asam benzoat dibuktikan dengan hampir samanya waktu retensi dengan waktu retensi standart dan untuk sampel C, sampel D dan
sampel E tidak mengandung asam benzoat karena waktu retensi tersebut tidak muncul peak/puncak. Pembuatan kurva kalibrasi Pembuatan kurva kalibrasi berdasarkan luas area dari larutan standard dengan variasi konsentrasi larutan asam benzoat, hasilnya dapat dilihat pada tabel 3 dan gambar kurva kalibrasi ditunjukkan pada gambar 1, kurva kalibrasi menunjukkan hasil yang linier. Untuk penetapan kadar asam benzoat pada batas 25-160 ppm, dengan persamaan garis : Y = a + b X Keterangan : a : intersep = 3.698.092,924 Y : luas puncak b : slope X : kadar Tabel 3. Luas area larutan standar asam benzoate No. 1. 2. 3. 4.
Konsentrasi (ppm) 25 50 100 160
Luas area (mAU) 4.800.616 7.309.874 10.409.604 13.640.823
Gambar 1. Kurva Kalibrasi
Berdasarkan data diatas kemudian dilakukan perhitungan untuk mendapatkan batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ) pada persamaan garis linier Y = 3.698.092,924 + 63.786,7024 x, hasilnya dapat dilihat pada tabel 4. Tabel 4. Data Perhitungan LOD dan LOQ Konsentrasi (ppm) 25 50 100 160 Jumlah
Luas area (mAU) Y’
(Y – Y’)
4.800.616 7.309.874 10.409.604 13.640.823
2,4211 x 10 11 1,7846 x 10 11 1,1078 x 10 11 6,9244 x 10 11 6,0069 x 1011
5.292.760,484 6.887.428,044 10.076.763,16 13.903.965,31
Penetapan Kadar Benzoat yang dihitung sebagai Asam Benzoat Hasil analisis asam benzoat terhadap lima sampel minuman isotonik bahwa sampel A dan sampel B menunjukkan hasil yang positif adanya asam benzoat dan sampel C, sampel D, dan sampel E menunjukkan hasil yang negatif adanya asam benzoat. Kadar asam benzoat dari masing-masing sampel dapat dilihat pada tabel 5.
No.
Tabel 5. Kadar Benzoat sebagai Asam Benzoat dalam Sampel Nama Luas Area Konsentrasi Rata-rata ± SD Sampel (mAU) (ppm) (ppm)
1.
A
2.
B
3.
C
4.
D
5.
E
10.952.405 10.979.164 11.013.654 10.062.191 10.104.882 10.068.733 -
113,7277 114,1472 114,6879 99,7715 100,0288 99,8741 -
113,9375 0,30
±
99,8228 ± 0,07
-
Gambar berikut menunjukkan salah satu contoh hasil kromatogram dari larutan standard asam benzoat (standard ke -3) dan sampel minuman isotonik A (percobaan ke-3), B (percobaan ke-2), C (percobaan ke-1) berturut-turut ditunjukkan pada gambar 2 sampai dengan gambar 5.
Gambar 2. Kromatogram dari larutan standard asam benzoat (standard ke-3)
Gambar 3. Sampel minuman isotonik A (percobaan ke-3)
Gambar 4. Sampel minuman isotonik B (percobaan ke-2)
Gambar 5. Sampel minuman isotonik C (percobaan ke-2)
Fase gerak dengan menggunakan metode sistem elusi gradient yaitu elusi dilakukan dengan pelarut pengembang campur yang perbandingannya berubah dalam waktu tertentu. Pada penelitian ini menggunakan sistem elusi tekanan tinggi, dalam sistem ini pencampuran larutan pengembang dilakukan dengan memakai pompa-pompa bertekanan tinggi dari masing-masing botol, setelah itu langsung dielusikan ke dalam kolom, dimana fase gerak A = larutan buffer natrium asetat pada pompa A dan fase gerak B = metil sianida pada pompa B dan pemilihan fase gerak yang tepat dilihat berdasarkan hasil pemisahannya yang baik. Hasil percobaan diperoleh komposisi fase gerak buffer natrium asetat : metil sianida (85:15) dengan kecepatan alir 1 ml/menit. Dipilih kecepatan alir 1 ml/menit karena waktu optimasinya atau waktu analisisnya cepat yaitu kurang dari 3 menit, tepatnya peak muncul pada 2,8 menit. Koefisien korelasi (r) yang dihasilkan adalah 0,993152 dengan persamaan linier y = 3.698.092,924 + 63.786,7024 x . Angka koefisien korelasi dapat menunjukkan kadar luas puncak dalam setiap satuan kadar terletak dalam satu garis lurus, dan kadar sampel dibuat dalam satuan ppm. Uji kualitatif dengan menggunakan metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi salah satunya dilihat dari waktu retensi (tR). Pada penelitian ini waktu retensi asam benzoat adalah 2,868 menit. Waktu retensi tersebut didapat dengan menggunakan fase gerak buffer natrium asetat : metil sianida ( 85 : 15) dengan kecepatan alir 1 ml/menit, jika menggunakan fase gerak buffer natrium asetat : metil sianida ( 90 : 10) dengan kecepatan alir yang sama maka diperoleh waktu
retensi yang dihasilkan 3,243 menit, jadi menggunakan fase gerak buffer natrium asetat : metil sianida ( 90 : 10) dengan kecepatan alir 1 ml/menit. Analisa kuantitatif dengan metode baku luar, selain menggunakan regresi linier untuk menghitung kadar sampel, juga dihitung LOD (Limit of Detection) diperoleh hasil batas deteksi sebesar 25,7752 ppm yang menunjukkan kadar terendah dari suatu sampel yang masih dapat dideteksi dan LOQ (Limit of Quantitation) diperoleh hasil batas kuantitatif sebesar 85,9175 ppm yang menunjukkan kadar terendah dari suatu sampel yang masih dapat digunakan untuk penetapan kadar. Hasil pemeriksaan diperoleh kenyataan bahwa dari lima sampel minuman isotonik hanya sampel A dan sampel B yang menggunakan pengawet benzoat dianalisis sebagai asam benzoat dan pada sampel C, sampel D, dan sampel E tidak mengandung pengawet asam benzoat dan hasil penetapan kadar pengawet asam benzoat yaitu sampel A = 113,9375 ± 0,30 ppm dan sampel B = 99,8228 ± 0,07 ppm. KESIMPULAN Berdasarkan hasil penelitian disimpulkan : 1. Analisa kualitatif terhadap beberapa sampel minuman isotonik ternyata sampel A, sampel B mengandung pengawet benzoat yang dianalisis sebagai asam benzoat, sedangkan pada sampel C, sampel D dan sampel E tidak mengandung pengawet benzoat. 2. Kadar kandungan pengawet benzoat yang dihitung sebagai asam benzoat dalam sampel A = 113,9375 ± 0,30 ppm dan sampel B = 99,8228 ± 0,07 ppm. 3. Data hasil analisis dari lima sampel minuman isotonik yaitu sampel A dan B mengandung pengawet benzoat, sedangkan sampel C, sampel D dan sampel E tidak mengandung pengawet benzoat dan untuk kadar sampel A dan sampel B tidak melebihi batas maksimum pemakaian yang ditetapkan dalam PerMenKes RI No : 722/MEN.KES/PER/IX/88 yaitu 600 mg/kg (600 ppm). DAFTAR PUSTAKA Anonim, 1995, Farmakope Indonesia Edisi IV, Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Anonim, 1982, Petunjuk Teknis Manuskrip Standar SII, Departemen Perindustrian Indonesia. Anonim, 1988, Peraturan Menteri Kesehatan Republik Indonesia no. 722/MEN.KES/PER/VI/88, Jakarta. Kartasubrata, J., dan Suprapto, E. S. M., 1988, Kromatografi Cair Kinerja Tinggi , Kursus Metoda Analisa Kimia Instrumental dan Aplikasinya, Puslitbang Kimia Terapan Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia. Priyanto, G, 1987, Teknik Pengawetan Pangan, Proyek Peningkatan/Pengembangan, Universitas Gajah Mada, Yogyakarta. Tranggono, dkk, 1991, Buku dan Monograf Bahan Tambahan Makanan (food addictive), Universitas Gajah Mada, Yogyakarta. Wahjuningsih, S, B, 2003, Jurnal Ilmiah Sainteks Vol.X No.3, Unir, Semarang Winarti, S, 2006, Minuman Kesehatan, Trubus Agri sarana, Surabaya.
