e TIROSINASA I: Efecto del pH y la Temperatura sobre la Actividad Enzimática
La elevación de la temperatura incrementa la velocidad de una reacción catalizada por enzimas. Al principio la velocidad de reacción aumenta cuando la temperatura se eleva debido al incremento de la energía cinética de la energía de las moléculas reactantes. Sin embargo, al fnal, la energía cinética de la enzima excede a la barrera energética para romper los enlaces débiles de hidrogeno que conservan su estructura secundaria terciaria.A esta temperatura predomina la desnaturalización con pérdida precipitada de la actividad catalítica. !or !or tanto las enzimas muestran una temperatura óptima de acción. Los limites de actividad para la maor parte de las enzimas tiene lugar entre los "#$% $%' la temperatura óptima para las enzimas en el cuerpo se hall alrededor de ()$%. !odemos decir que el aumento de la actividad enzim*tica, observado a $% o por encima de esta temperatura, es de corta duración, a que la enzima a temperaturas mu altas como esta, tiende a perder sus propiedades desnaturalizarse, posteriormente se coagula la parte de la proteína enzim*tica. +odo +odo esto hace que desaparezca desaparezca la actividad actividad enzim*tica, enzim*tica, uiz* a temperatura de -$% no tiene actividad la enzima, a que a esta temperatura la enzima se inhibe, al igual que las proteasas, uiz* a temperatura de -$% n o tiene actividad la enzima, a que a esta temperatura la enzima se inhibe, al igual que las proteasas.
!/ La intensidad m*xima de la actividad de la enzima, ocurre en el p óptimo, con r*pida disminución de la actividad a cada lado de este valor de p. La actividad óptima generalmente se observa entre los valores de & 0.1l p óptimo de una enzima puede guardar relación con cierta carga eléctrica de la superfcie, o con condiciones óptimas para la f2ación de la enzima a su sustrato. %uando ha un exceso de iones hidrogeno, las enzimas los unen a sus moléculas ante un défcit los ceden.1ste cambio tiene una doble consecuencia sobre la molécula. %omo todas las proteínas, las enzimas desempe3an su 4unción por los residuos de amino*cidos' algunos conferen a su superfcie una distribución de cargas eléctricas.%uando la concentración de iones hidrogeno es mu ba2a en comparación con la concentración optima, la molécula los cede desapareciendo cargas positivas o apareciendo cargas negativas en su superfcie. Ante una u na concentración elevada de iones hidrogeno, algunos se f2an a la molécula desapareciendo cargas 567 o poniendo cargas 587 que no existían.Así mismo al cambiar las cargas eléctricas en los residuos de amino*cidos se alteran los lazos de unión dentro de la molécula variando su acomodo tridimensional con recuperación de la actividad de la enzima.
1l p es otro 4actor que in9ue en la manera de accionar de la enzima, pues, como se menciona en la teoría, cuando el p es demasiado *cido la enzima traba2aría menos, pero, a comparación de un p demasiado alcalino, la enzima muestra actividad maor que en la actividad mostrada a p alcalino.
Los datos mostrados no dicen que de un p & hacia aba2o la enzima empieza a perder actividad, de p "# hacia arriba hace lo mismo, empieza a de2ar de traba2ar. traba2ar. 1sto nos lleva a pensar que al haber variaciones de aunque sean décimas, se puede a4ectar la manera de traba2ar de la enzima. !or tanto, se piensa que la practica estuvo bien realizada, al haber comprobado los ob2etivos propuestos.
! "edida de la actividad enzimática
+iempo 5min7:+ubo
# .& " .# " .& ; .# ; .& ( .# ( .& - .# - .& &.#
"
;
(
-
#,#0; #,"(= #,;0& #,(<< #,() #,(,(;( #,;)= #,;"" #,";)
#,(&; #,(0= #,;(& #,;#,;-" #,;-; #,;-#,;-( #,;-( #,;-;
#,<&) #,)#( #,<;) #,&;#,-< #,-<0 #,-< #,-&0 #,-&< #,-&)
#,-<= #,&-0 #,&&( #,&&& #,&&) #,&&= #,&&0 #,&< #,&&) #,&&)
# "edida de la actividad enzimática con cambio de la temperatura
+iempo 5min7 5min7
# .# # .& " .# " .& ; .# ; .& ( .# ( .& - .# - .& & .#
Absorbancia - o%
Absorbancia () o%
Absorbancia 0& o%
#.#") #.#)# #."#& #.""; #.""& #.""& #.""#.""( #.""( #.""; #.""#
#.&<= #.&=" #.&=< #.&0& #.&00 #.<#) #.<"#.<") #.<;# #.<;; #.<;<
#,")" #.;-< #.;-#.;-#.;-& #.;-& #.;-< #.;-< #.;-< #.;-& #.;-&
1n () se a4ecta la actividad actividad enzim*tica enzim*tica , en 0& % se a4ecta m*s la actividad actividad enzim*tica , en - % ha mucha actividad enzim*tica no se altera la estructura de la proteína. Las reacciones catalizadas por enzimas siguen esta le general. Sin embargo, al ser proteínas, a partir de cierta temperatura, se empiezan a desnaturalizar por el calor. La temperatura a la cual la actividad catalítica es m*xima se llama temperatura óptima 5>igura 5>igura de la derecha7. !or encima de esta temperatura, el aumento de velocidad de la reacción debido a la temperatura es contrarrestado por la pérdida de actividad catalítica debida a la desnaturalización térmica, la actividad enzim*tica decrece r*pidamente hasta anularse. La teoría nos indica que a temperaturas ba2as la enzima pudiera llegar a perder la actividad, esto seria moment*neamente' entonces a temperaturas altas, la enzima se desnaturalizaría, pero, a una temperatura media 5entre unos (#$% -#$%7 la enzima 4unciona casi per4ecta.
". %uando se traba2a con con manzana el extracto extracto no es recomendable recomendable diluirlo ?!or ?!or qué@. Cuando se trabaja con manzana no es recomendable diluir el extracto, por qué se produce produce pardeación al ser expuesto expuesto al aire por el contacto contacto con el oxígeno. oxígeno. El pardeamiento enzimático es el que ocurre por acción de enzimas, como por ejemplo la polifenoloxidasa que actúa sobre sustratos como los polifenoles produciendo las quinonas que se polimerizan para dar finalmente el color marrón.
;. ?%u*l ?%u*l es la 4unción 4unción de la tiros tirosinas inasa a en los animal animales es superior superiores@ es@
•
• • • • • •
•
La tirosina es un amino*cido no esencial 4undamental e importante para el metabolismo para nuestro estado de *nimo, a que es precursor de la dopamina la adrenalina, .+ambién con la norepine4rina la epine4rina que regulan el estado de *nimo >orma parte del 4uncionamiento correcto del sistema nervioso central. >undamental para el metabolismo. inimiza la absorción almacenamiento almacenamiento de determinadas determinadas grasas. 14ecto positivo en la mucosa de la piel el pelo. 1stimula la mielina. Bn9ue en otras hormonas como la tiroides, siendo benefciosa benefciosa para personas con trastornos de tiroides. +ambién +ambién es benefcioso para para los estrógenos, estrógenos, siendo interesa interesante nte en caso caso de menopausia.
(. Ce acuerdo con los resultados obtenidos en la pr*ctica, ?%u*l es la interpretación explicación explicación que se le da a la 4ruta o 4rutas que tienen una maor concentración de tirosinasa@
-. ?ué se podr* recomendar 5 que no se podr* recomendar7, para evitar el pardeamiento de las 4rutas las papas cortadas@ #uando cortamos cortamos al$unas frutas y e%ponemos su carne a la acci&n del aire' vemos (ue en unos instantes se oscurece Esto ocurre con frutas como la manzana' la pera' el plátano) y con otros alimentos como las patatas o los c*ampi+ones Este proceso se llama o%idaci&n o pardea miento enzimático' pues es el resultado de la acci&n del o%,$eno contenido en el aire en combinaci&n con los compuestos (u,micos de la fruta' en concreto sobre los fenoles #uando se rompe la compartimentalizaci&n por un da+o mecánico' como el triturado' corte o con$elaci&n y descon$elaci&n' la reacci&n de pardeamiento se puede producir Tambi-n se produce la in*ibici&n del enzima por los productos de la reacci&n Además de manteniendo la compartimentalizaci&n' la reacci&n de pardeamiento se puede frenar actuando sobre diferentes factores: Evitando el contacto del o%,$eno con la superficie de corte' !a.ando a la temperatura' temperatura ' Reduciendo el pH y /esnaturalizando el enzima' el ácido como el ácido c,trico in*ibe de inmediato la enzima y la o%idaci&n es tan lenta (ue parece (ue no sucediera' /isminuci&n del 0*: a 0* ba.os la actividad catal,tica decrece y produce una inactivaci&n de las enzimas
TIROSINASA II: /eterminaci&n de la constante Michaelis-Menten y la velocidad má%ima
! "edida de la actividad enzimática
t 5min7: 5min7: tubo
"
;
(
-
&
<
# .# # .& " .# " .& ; .# ; .& ( .# ( .& - .# - .& & .#
#.#"0 #.#() #.#00 #."&( #.;##.; #.;0; #,(;< #.(&; #.()# #.()<
#.#)= #.#=" #.";< #."0) #.;&0 #.("& #.(<; #.-#( #.-;0 #.--) #.-&(
#.#(& #.#== #."&) #.;"& #.;&) #.;)= #.;=( #.;=( #.;=( #.;=#.;=<
#.<0 #.#)& #.#)) #.";< #.")#.;## #.;#< #.;#< #.;##.;##.;#;
#.#"#.#") #.#") #.#") #.#"= #.#;# #.#;( #.#;) #.#(" #.#(; #.#(;
#.#00 #.#0= #.#0< #.#0= #."#" #.#00 #."## #."#" #."#" #."#; #."#;
La velocidad de una reacción catalizada 5D7 nos indica la cantidad de sustrato %onsumido, o producto 4ormado, por unidad de tiempo. E7
GRAFICAS ABSORBANCIA VS TIEMPO
absorbancia vs tiempo tubo "
absorbancia -;# nm
#."< #."#."; #." #.#= #.#< #.##.#; 45x7 F #.#"x 6 # # GH F #.#< # " ; 6#.#; 6#.#-
(
-
&
<
tiempo en minutos 5m7
Grafca 2: absorbancia Ds tiempo tiempo del tubo " 5".# ml de L6metildopa7. L6metildopa7.
absorbancia abso rbancia vs t iemp iempo o t ubo ; #." #.#= #.#< #.##.#;
absorbancia -;# nm
45x7 F #.#"x 6 #.#( # GH F #.#0 " ; ( 6#.#; #
-
&
<
6#.#6#.#< 6#.#= 6#."
tiempo en minutos 5m7
Grafca 3: absorbancia Ds tiempo tiempo del tubo ; 5".& ml de L6metildopa7. L6metildopa7.
absorbancia abso rbancia vs t iemp iempo o t ubo ( #.; #."=
absorbancia -;# nm
#."< #."#."; #." #.#= 45x7 F 6 #.# #.#"x "x 8 #.#0 #.#< GH F #."& #.##.#; # # " ; (
-
&
<
tiempo en minutos 5m7
Grafca 4: absorbancia Ds tiempo tiempo del tubo ( 5;.# ml de L6metildopa7. L6metildopa7.
F#,###)
absorbancia abso rbancia vs t iemp iempo o t ubo #."; #." #.#=
absorbancia -;# nm #.#< #.#-
Linear Li near 57
45x7 F #x 8 #.#& GH F #
#.#; #
#
"
;
(
-
&
<
tiempo en minutos 5m7
Grafca 5: absorbancia Ds tiempo tiempo del tubo - 5;.& ml de L6metildopa7. L6metildopa7.
absorbancia abso rbancia vs t iemp iempo o t ubo & #."= #."< #."#."; #."
45x7 F 6 #.# #.#;x ;x 8 #."( GH F #.=-
absorbancia -;# nm #.#= #.#< #.##.#; #
#
"
;
(
-
&
<
tiempo en minutos 5m7
Grafca 6: absorbancia Ds tiempo tiempo del tubo & 5(.# ml de L6metildopa7. L6metildopa7.
absorbancia abso rbancia vs t iemp iempo o t ubo < #."#."; #." #.#=
absorbancia -;# nm
#.#<
45x7 F 6 #x 8 #.#= GH F #.#&
#.##.#; #
#
"
;
(
-
tiempo en minutos 5m7
c) ISJ F Copa #.#( inicial/
! "#$ % &.&'()&.*ml+*ml totales % &.&' ( ara el tubo -! "#$ % &.&'().&ml+*ml totales % &.&& ( ara el tubo '! "#$ % &.&'().*ml+*.& ml totales % &.&&/ ( ara el tubo ' 0! "#$ % &.&'()-.&ml+*ml totales %
0.012
( ara el tubo 0
&
<
*! "#$ % &.&'()-.*ml+*ml totales %
0.015 (
! "#$ % &.&'()'.&ml+*ml totales %
0.018
ara el tubo *
( ara el tubo
C7 +ubo +ubo
[ S ] f f
" ; ( & <
#.##( #.##< #.##0 #.#"; #.#"& #.#"=
V i i
":IS ":ISJ
":V ":V i i
#,##<& #,##0) 6#.#"#& #,##) 6#,##;( 6#,##;-
(((.(( "<<.<< """."" =(.( <<.<< &&.&&
"&(.="#(.#0 #.0=& "-;= #.0)) #.00)<
17
v" vs 5s7 #.#; #.#" #.#"
v"
#
#
#
# .# "
# .# "
# .# "
# .# "
6#.#" 6#.#" 6#.#;
5s7concentración
# .# "
# .# ;
# .#;
# .# ;
LineKeaver6Eure "<## "-## ";## "###
":v"
=## <## -## ;## #
#
"
;
(
-
&
<
)
":5s7concentración
103,09 −153.84
(% 166.66 −333.33
% 1*&.2*+12%&,'&0
'''.''1 33&,'&04x*'.504%+6max % 7max%+-5.' 6max%&.&&'0 8m+6max%m 8m%6max x m 8(%&.'&09&,&&'0
:m%&,&&&' m(
TIROSINASA III: Efecto de un in*ibidor sobre la constante Michaelis-Menten y la velocidad má%ima
"edida de la actividad enzimática
t 5min7: 5min7: tubo
"
;
(
-
&
<
# .# # .& " .#
#.###.##( #.#;-
#.#;) 6#.#== #.#"<
#.#=& #.#&= #.#&-
#."## #.#(= #.#-#
#."<# #.#0#."#)
#.#&) #.#<( #.#<0
" .& ; .# ; .& ( .# ( .& - .# - .& & .#
#.### #.#") 6#.#;6#.##" 6#.## 6#.##" #."(& 6#.#"#
6#.#== #.##) 6#.#(# #.#(( #.#)= #.#&& 6#.#-& #.##-
tubos
MichaelisMenten Vo (Ab/min)
' 0 *
&.&&.&/ &.&5 &.&0 &.&&.0 Abs/!"
#."0# #.#<) #.#() #.#-) #.#;= #.#;0 #.#<# #.#&;
#.#;& #.#-) #.#-& #.#;= #.#-= #.#=( #.#&< #.#<;
#.#)= #.#=& #.#=# #.#)0 #.#)( #.#(= #.#;# #.#"0
#.""< #.#0" #.#<= #.#<; #.#<# #.#<" #.#&< #.#<0
[S]M
&.&' ( &.&& ( 0.009
( 0.015 ( 0.018 ( 0.012
b1;raficas b1;raficas 6s absorbancia.
Grafca 1: absorbancia Ds tiempo tiempo del tubo " 5#.& ml de L6metildopa7. L6metildopa7.
absorbancia vs tiempo tubo " #."< #."#."; #."
absorbancia -;# nm
#.#= Linear Li near 57
#.#< #.#45x7 F #.#"x 8 # GH F #.#) # # " ; ( - & 6#.#; #.#;
<
tiempo en minutos 5m7
Grafca 2: absorbancia Ds tiempo tiempo del tubo " 5".# ml de L6metildopa7. L6metildopa7.
absorbancia vs tiempo tubo ;
absorbancia -;# nm
#." #.#= #.#< #.##.#; 45x7 F #.#"x 6 #.#( # # GH"F #.#0 ; ( - & < 6#.#; 6#.#6#.#< 6#.#= 6#."
Linear Li near 57
tiempo en minutos 5m7
Grafca 3: absorbancia Ds tiempo tiempo del tubo ; 5".& ml de L6metildopa7. L6metildopa7.
absorbancia vs tiempo tubo ( #.; #."&
absorbancia -;# nm
#." #.#& #
#
45x7 F 6 #.# #.#"x "x 8 #.#0 GH F #."&
"
;
(
-
&
<
tiempo en minutos 5m7
Grafca 4: absorbancia Ds tiempo tiempo del tubo ( 5;.# ml de L6metildopa7. L6metildopa7.
absorbancia vs tiempo tubo #."; #." #.#=
absorbancia -;# nm #.#< #.#-
45x7 F #x 8 #.#& GH F #
#.#; #
#
"
;
(
-
&
<
tiempo en minutos 5m7
Grafca 5: absorbancia Ds tiempo tiempo del tubo - 5;.& ml de L6metildopa7. L6metildopa7.
absorbancia vs tiempo tubo & #."= #."< #."#."; #."
45x7 F 6 #.# #.#;x ;x 8 #."( GH F #.=-
absorbancia -;# nm #.#= #.#< #.##.#; #
#
"
;
(
-
&
<
tiempo en minutos 5m7
Grafca 6: absorbancia Ds tiempo tiempo del tubo & 5(.# ml de L6metildopa7. L6metildopa7.
absorbancia vs tiempo tubo < #."#."; #." #.#=
absorbancia -;# nm #.#< 45x7 F 6 #x 8 #.#= GH F #.#&
#.##.#; #
#
"
;
(
-
tiempo en minutos 5m7
c7 ISJ F Copa #.#( inicial/ ! "#$ % &.&'()&.*ml+*ml totales % &.&' ( ara el tubo -! "#$ % &.&'().&ml+*ml totales % &.&& ( ara el tubo '! "#$ % &.&'().*ml+*.& ml totales % &.&&/ ( ara el tubo ' 0! "#$ % &.&'()-.&ml+*ml totales %
0.012
( ara el tubo 0
*! "#$ % &.&'()-.*ml+*ml totales %
0.015 (
ara el tubo *
&
<
! "#$ % &.&'()'.&ml+*ml totales %
0.018
( ara el tubo
C7 +ubo +ubo
" ; ( & <
[ S ] f f
#.##( #.##< #.##0 #.#"; #.#"& #.#"=
V i i
":IS ":ISJ
":V ":V i i
#,##<< #,##0) 6#,#"#& #,###) 6#,#;;( 6#,##;-
(((.(( "<<.<< """."" =(.( <<.<< &&.&&
"&"."& "#(.#0 #.0=0 "-;= #,0)) #.00)
ANA#ISIS ANA#ISI S $E RES%#T RES%#TA$OS
los resultados obtenidos no 4ueron los esperados, sin embargo algunas grafcas muestran una buena tendencia con respecto a la inhibición como es el caso de las grafcas del tubo ",; -. 1n cuanto a las otras grafcas no representan una reacción coherente a la inhibición puesto que en ellas se nota como se daba la reacción enzim*tica en momentos intermitentes al mismo tiempo se observa linealidad como si también estuviera actuando el inhibidor en 4racciones de tiempo peque3as. 1stos resultados tan di4erentes di4erentes pudieron ser ocasionados ocasionados por mal mane2o de los materiales utilizados en el laboratorio a la hora de realizar el experimento en especial a la hora de hacer h acer las disoluciones de los reactivos también cuando se tomaron las las respectivas lecturas de de absorbancia en los equipos.
E1 ;rafica 6 6s sa
v" vs 5s7 #.#; #.#" # #
v"
6#.#"
#
"
;
(
-
&
<
)
<
)
6#.#" 6#.#; 6#.#; 6#.#(
5s7concentración
;rafica +6 6s +3s4
LineKeaver6Eure "<## "-## ";## "###
":v"
=## <## -## ;## #
#
"
;
(
-
&
":5s7concentración
Al analizar la gr*fca obtenida después de la linealización de la ecuación de ichaelis6enten, 5grafca de LineKeaver6Eure7, LineKeaver6Eure7, no se evidencia lo esperado, en principio queríamos obtener una gr*fca que se aproximara a un modelo de ecuación de la línea recta 5para ello se linealiza7 con el fn de obtener la Dmax la M m' en nuestro caso no obtuvimos dicho modelo' esto podría deberse a errores errores sistem*ticos, donde se incluen errores
experimentales, de procedimiento o calidad de reactivos los cuales serían necesarios precisar. Ntro posible 4actor de error que ha nuestro criterio podría ser el m*s acertado radica que desde la realización de las curvas de progreso se garantizaba la no linealidad' esto se puede evidenciar al observar las gr*fcas, la cual es discontinua en el tubo ( en otros casos como las del tubo & < donde tienen pendientes pendientes negativas. Apenas se inicia inicia la reacción' reacción' puesto que los datos ni siquiera precisan un momento en el cual se alcanza un estado de equilibrio donde se alcance la m*xima concentración de producto' es decir un valor casi f2o de este. !ara asegurar esta apreciación se debería iniciar el proceso tomar lecturas hasta un tiempo superior a los & min hasta que los valores obtenidos a no su4ran cambios signifcativos de tal 4orma que se pueda obtener una curva de progreso total de esta manera poder determinar con una tangente a ella los par*metros de Do requeridos 5como sugerencia a la práctica; aumentar el intervalo de tiempo en las lecturas o revisar concentraciones de reactivos 7 C&'c('s 103,09 −151.15
(% 166.66 −333.33
%&.-55
'''.''1 33 &.-554x*.*4%+6max % 7max%+-5/.5 6max%&,&&'0 8m+6max%m 8m%6max x m :m%&,&&&&
< altas altas concentracion concentraciones es del sustrato, sustrato, la 6elocidad 6elocidad de de la reacción reacción era independie independiente nte de su concentración, siguiendo una cinética de orden &! 7i % 7(. Ello indica que en condiciones de altas concentración del sustrato, la enzima se =alla saturada por éste, > la reacción >a =a llegado a su máxima 6elocidad 37(4.
enzima enzima disponible disponible para para ello.
F) Se obtuvo con los resultado a simple vista , que el inhibidor era tipo
reversible , Al realizar los c*lculos del m vmax se obtuvieron resultados mu parecidos, vma%233345 en ambos casos en m m 6m23'33733 y 3'337348 valores bastante cercanos , lo que indica que se utilizó un Bnhibidor reversible competitivo .1ste tipo de inhibidores tienen la característica de ser químicamente mu parecidos al sustrato, de tal manera que pueden ocupar el sitio activo de la enzima, pero ésta no los trans4orma, mientras el inhibidor esté dentro del sitio activo el ve rdadero sustrato no puede entrar por lo tanto no es posible que se 4orme 1S no
ha 4ormación de producto. Si usamos el e2emplo de la cerradura la llave, podemos pensar en una llave que entra en la chapa pero no puede abrirla porque no es la correcta. Sin embargo, mientras la llave inadecuada esté dentro de la chapa, no es posible que entre la llave correcta.
O7 MB
&,&&&&%&,&&&' 3?&.- ml+:@4
&,&&&&%&,&&&' ?&.&&-&2 &.&&&'%&.&&-&2+:i 8i %&,2'
CONC#%SIONES El cianuro es un in=ibidor enzimático no específico 3tirosinasa, succinato des=idrogenasa, superóxido dismutasa, an=idrasa carbónica, citocromo oxidasa, etc.4 in=ibiendo su acción > de esta manera bloqueando la producción de la reacción puede continuar. se pudo notar que si =ubo una diferencia con las lecturas de tirosinasa @@ =ec=as en el laboratorio anterior por que la reacción enzimática ocurrio ocurrio =asta que se saturo el sitio acti6o > las graficas graficas fueron co=erentesD mientras que en tirosinasa @@@ las graficas no muestran una buena información.