Aislamiento y cuantificación de glucógeno. Introducción. Los seres vivos almacenan glúcidos en forma de polisacáridos, que sirven como materiales de reserva. En los vegetales superiores se acumulan principalmente como almidón, en los animales se presentan en forma de glucógeno. El glucógeno es una biomolécula que está conformada por unidades de glucosa unidas por enlaces glucosídicos α(1-4) con ramificaciones mediante enlaces α(1-6).
El glicógeno es la reserva principal de carbohidratos en los organismos animales. El depósito principal de glicógeno son el hígado (de 2 a 5%) y los músculos (de 0.5 a 2%), en los cuales esta acumulado hasta en un 60% de su contenido en el organismo. En situación de inanición, el glucógeno es la primera reserva que se moviliza para mantener la glucemia, al menos durante las primeras horas. El metabolismo del glucógeno está asociado al nivel de la glucosa sanguínea, durante una buena alimentación se presenta su síntesis o glucogenogénesis, en condiciones de ayuno ocurre su degradación o glucogenólisis El glucógeno del músculo esquelético tiene como finalidad suministrar glucosa para que sea degradada oxidativamente y se pueda obtener ATP para la actividad muscular. muscular. En contraste, el glucógeno hepático sirve como fuente de glucosa para los tejidos extrahepáticos, incluido el músculo esquelético, ante un descenso de la glucemia. Una vez agotado el suministro de glucosa vía glucogenólisis y para cubrir requerimientos tejidos del organismo la ruta
para síntesis de glucosa es a través de la gluconeogénesis, la cual procede a partir de sustancias distintas a los carbohidratos, tales como aminoácidos y lactato glicerol. La extracción del glucógeno de tejidos, como el hígado, se realiza mediante un proceso de homogenización y ruptura celular, así como la extracción y la eliminación de las proteínas para evitar interferencias en el análisis posterior del polisacárido.
Competencia. Determinar el contenido de glucógeno en tejidos de un animal acuático, para estimar su capacidad de almacenamiento y relacionar con su función metabólica, con organización y compromiso.
Materiales y reactivos.
Materiales.
Estuche de disección, espátula, homogeneizador manual, tubos de ensaye, pipetas volumétricas de 1 y 5 mL, pipeteros, tubos de centrifuga, celdas para espectrofotómetro. Instrumental.
Balanza analítica, baño de temperatura controlada, centrifuga, espectrofotómetro. Reactivos.
KOH acuoso al 30%, etanol, K2SO4 al 10%, fenol 5%, H2SO4 concentrado.
Metodología.
1)
A partir de peces recién sacrificados obtener muestras de hígado y musculo, enseguida pesar por duplicado 1.0 g de hígado y 2 g de músculo.
2)
Homogeneizar las muestras de tejidos con 5 mL de K OH al 30%.
3)
Calentar los homogenizados en un baño de agua a ebullición por 15 minutos, agitar ocasionalmente.
4)
Centrifugar los homogenados a 3000 rpm por 5 minutos, separar la capa de cada sobrenadante y colocarla en tubo de ensaye.
5)
Tomar 0.1 ml del sobrenadante y añadir 3 mL de etanol y 0.1 ml de K2SO4 al 10%, agitar.
6)
Reposar los tubos con la mezcla en baño de hielo por 5 minutos.
7)
Centrifugar los tubos 5 minutos a 3000 rpm, desechar el sobrenadante y separar el glucógeno precipitado.
8)
Solubilizar el precipitado en 3 mL de agua.
9)
Colocar en dos tubos de ensaye alícuotas de 0.5 mL de la solución de glucógeno, adicionar a cada tubo 0.5 mL de solución de fenol al 5%, mezclar perfectamente, enseguida adicionar cuidadosamente 2.5 mL de ácido sulfúrico concentrado y homogeneizar.
10) Calentar los tubos en baño de agua a 90 C por 15 minutos
11) Enfriar los tubos a temperatura ambiente y determinar la respectiva absorbencia 490 nm, ajustar el equipo con un blanco preparado de la misma manera reemplazando la muestra con agua destilada. 12) Calcular la cantidad de carbohidratos presentes en la muestra a partir de una curva patrón preparada con glucógeno en el intervalo de sensibilidad del método colorimétrico.
1.1.1. Resultados a reportar. • Gráfica, ecuación y coeficiente correlación de la curva de calibración de
glucógeno. • Contenido de glucógeno (mg/g) en los tejidos analizados.
