Biología Celular II – P.P de Ing. Biotecnológica
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PRACTICA 5 AISLAMIENTO DE CLOROPLASTOS
INTRODUCCIÓN La fotosíntesis es el proceso por el cual las plantas convierten la energía luminosa en energía química. La siguiente ecuación: 6 CO2 + 12 H2O C6 H12 O6 + 6 O2 + 6 H2O resume el proceso, pero da pocos detalles sobre su complejidad. Hay realmente 2 grupos de reacciones, las denominadas de la “fase luminosa” y las de la denominada “fase oscura”. Los productos de las reacciones de la "fase luminosa" son el oxígeno molecular, oxígeno molecular, los transportadores de electrones reducidos (NADPH) y el ATP. El ATP y los transportadores reducidos se usan en las reacciones de la “fase oscura” para convertir para convertir el dióxido de carbono en carbohidratos. La reacción de Hill es una fase importante de las reacciones de la "fase luminosa" en la que los electrones son transportados del agua a un aceptor de electrones en presencia de luz y cloroplastos. El objetivo de esta práctica es seguir la velocidad de la reacción de Hill usando cloroplastos aislados. Estudiaremos además el efecto de un inhibidor.
REACCIONES LUMINOSAS DE LA FOTOSINTESIS Todos los componentes que participan en las reacciones de la “fase luminosa” se localizan en las membranas de los tilacoides de los cloroplastos, mientras que los enzimas de la “fase oscura” se localizan en el estroma. Figura 1. Esquema de los cloroplastos.
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Figura 2. Esquema de la fase luminosa de la fotosíntes is. Fotofosforilación no cíclica.
La figura 2 representa el flujo de electrones en las reacciones luminosas, mientras la altura de los distintos compuestos indica los niveles energéticos relativos de los electrones en cada punto de la ruta. En el centro de las distintas series de reacciones hay dos fotosistemas denominados Fotosistema II (PS II) y Fotosistema I (PS I). Cada fotosistema es un conjunto formado por clorofilas a y b, carotenoides, citocromos y otros transportadores de electrones. Cada fotosistema también contiene una molécula de clorofila a especial que absorbe a un máximo de 680 nm en el PS II y a 700 nm en el PS I nm. Estas moléculas especiales de clorofila se denominan P680 y P700 respectivamente. Los electrones excitados en P680 del PS II son transferidos a la plastoquinona y los de la P700 se transfieren a la ferredoxina. Los dos fotosistemas están unidos por una cadena transportadora de electrones. A medida que los citocromos y otros transportadores de electrones de esta cadena se reducen y oxidan sucesivamente, parte de la energía se acopla a la síntesis de ATP. Los electrones liberados por P700 (en PS I) pasan a través de otra cadena transportadora de electrones hasta el NADP+. Existe además una tercera transferencia de electrones, concretamente del agua a la forma oxidada del P680 en el PS II. En un proceso denominado fotolisis, el agua se hidroliza: se descompone en protones, oxígeno y electrones. Estos electrones pasan mediante una corta cadena de transporte de electronesa la P680. El flujo de electrones del agua al NADP+ se denomina ruta no cíclica (o esquema Z) puesto que los electrones empiezan en un compuesto (agua) y terminan en otro
(NADP+). La síntesis de ATP a través de esta ruta se denomina fotofosforilación nocíclica. Los productos de la ruta no cíclica de las reacciones luminosas son el oxígeno molecular, transportadores de electrones reducidos (NADPH + H +) y ATP. El ATP también se produce cuando los electrones siguen una ruta cíclica, como se indica en la figura 3. Esta ruta implica el PS I y transportadores de electrones de la ruta principal de transporte de electrones. La síntesis de ATP a través de esta vía se denomina: fotofosforilación cíclica.
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Esquema de la fotofosforilación cíclica
Para estudiar estas reacciones se purifican los cloroplastos en un gradiente de densidad:
Al girar los tubos se produce una fuerza que se conoce como fuerza centrífuga relativa RCF que se mide en x g (veces la fuerza de la gravedad). Los rotores de las centrífugas giran y esa velocidad se mide en RPM (revoluciones por minuto). Influye también en la fuerza el radio de giro: r. Para medir los g que se producen se utiliza la siguiente fórmula:
De esta forma podemos conocer la fuerza que se produce durante el proceso, lógicamente la centrifugación depende también del tiempo.
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Objetivo: Aislar Cloroplastos Materiales y reactivos - Vaso de precipitados de 250 ml - Balanza - Gradilla - Tampón Tris-NaCl pH= 7,5: Tris (hydroximetil)aminometano 0,02 M, NaCl 0,35 M ajustar el pH a 7,5 con HCl 6 N. Almacenar a 4ºC. - Batidora - Embudo - Gasa - Centrífuga refrigerada - Gradilla - Tubos de centrífuga
PROCEDIMIENTO 1.- Homogeneización Se pesan 25 gramos de hojas de espinacas en el vaso de precipitados, se añaden 100ml del Tampón Tris-HCl Frio y se introduce la mezcla en la batidora. Se homogeneiza durante 3 min. Se coloca un enbudo en un matraz y Se filtra en una doble capa de gasa. Se aprieta bien para obtener la máxima cantidad. Llenar 6 tubos eppendorf con 1.5 ml de homogenizado filtrado, centrifugar a 5000 RPM por 5 minutos a 4°C, eliminar el sobrenadante por inversión de los tubos. Juntar los pellet con la ayuda de una micropipeta, en un solo tubo y rotular el tubo con “homogenizado cloroplastos” Colocar 10 ul de homogenizado de cloroplastos y observar al microscopio con 40X y 100X. Dibujar y describir las observaciones
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Purificación De Cloroplastos -Formación del gradiente: A un tubo de centrífuga de 2 ml se le añaden las siguientes cantidades de sacarosa (use una micropipeta de 200 ul: - 200 ul de sacarosa en agua al 60% (peso/volumen) - 200 ul de sacarosa en agua al 50% (peso/volumen) - 200 ul de sacarosa en agua al 40% (peso/volumen) - 200 ul de sacarosa en agua al 30% (peso/volumen) - 200 ul de sacarosa en agua al 20% (peso/volumen) Para que el gradiente salga bien hay que tomar las siguientes precauciones: - Las disoluciones deben de estar frías (nevera). - Cada capa debe depositarse muy lentamente sobre la anterior, para evitar que se mezclen las disoluciones. - Con cada disolución se utiliza un Tip diferente. - Sobre la última capa se deposita la muestra biológica que consiste en 200 microlitros de resuspencion de cloroplastos de un homogenado de células de espinaca, preparado previamente. • Los tubos se equilibran de dos en dos. • Se colocan los tubos equilibrados uno en frente del otro en el rotor. • El rotor debe de estar previamente enfriado y se coloca en la centrífuga. • • La temperatura se ajusta a 4Cº. • La velocidad se ajusta a 15,000 rpm. • El tiempo se ajusta a 20 minutos. • Cuando se para el rotor se sacan los tubos y se extraen la fracciones con una micropipeta de 100 o 200 ul. • En este caso nos interesa la fracción verde que son los cloroplastos. Resultados: tome 10 ul de cada Fraccion del tubo y observe al microscopio con 40X o 100X si es necesario. Compare los resultados de cada una de las fracciones (densidades) y discuta los resultados.
Cual es la concentración de cloroplastos
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CUESTIONARIO.
Densidad de los cloroplastos: Calculo de la densidad de los cloroplastos: Se pesan 10 veces 100μl de agua destilada, este peso será la densidad 1,000. Se pesan 10 veces fracciones de 100 μl de los cloroplastos y el peso obtenido deberá ser dividido por el peso del agua destilada, para obtener la densidad a la que sedimentan los cloroplastos.
Cálculos numéricos: Calcula la fuerza en g que se producen en la parte superior del tubo de centrífuga (r= 5´72cm). Calcula la fuerza en g que se producen en la parte media del tubo de centrífuga (r= 8´26cm). Calcula la fuerza en g que se producen en la parte inferior del tubo (r= 10,80cm).
Como evalua la función de un cloroplasto, usando un agente reductor, describa el experimento.
Bibliografia:
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