Extracción, aislamiento aislamient o de plásmidos, y su digestión con enzimas de restricción Guzmán Cruz Marta • Flores Cibrián Roberto Emmanuel • Solís Vázquez Vázquez Ana Laura
Abstract Plasmids are small DNA molecules circular common bacteria that replicate autonomously and independently of the chromosome of the cell . They are a fundamental tool in molecular biology and genetic engineering as it can be used as "vectors" to introduce any DNA fragment of interest and this amplify how they (that is what is called "clone" a fragment of DNA). btaining large !uantities of pure DNA of these "vectors" is crucial in later applications. n this practice the isolation and partial purification of plasmid DNA was performed by using the miniprep method of al#aline lysis . $ubse!uently by spectrophotometric reading the amount of DNA obtained and its purity was observed. %inally digesting plasmid was isolated by restriction en&yme and agarose electrophoresis was performed to observe evidence of the fragments obtained.
Resúmen 'os plsmidos son molculas pe!ue*as de ADN circ circu ular lar muy comun munes en bact bacter eria ias s !ue !ue se repl replic ican an de modo modo aut+nomo e independiente del cromosoma de la clula. ,onstituyen ,onstituyen una herra herramie mienta nta fund fundame amenta ntall en -iolog -iologa a /olecular e ngeniera 0entica ya !ue se pued pueden en usar usar como como 1vect 1vectore ores2 s2 para para introducir en ellos cual!uier fragmento de ADN de inters y de esta forma amplificarlo (es lo !ue se llama 1clonar2 un fragmento de DNA). 'a obtenci+n de gran grande des s cant cantid idad ades es de ADN puro puro de esto estos s 1vec 1vecto tore res2 s2 es fund fundam amen enta tall en aplicaciones posteriores. 3n esta prctica se reali&+ reali&+ el aislamie aislamiento nto y purificac purificaci+n i+n parcial de un ADN plasmdico mediante la utili&aci+n del mtodo de miniprep4 de lisis alcalina alcalina.. Posterio Posteriormen rmente te mediante mediante lectura espectrofotomtrica espectrofotomtrica se observ+ la cantidad de DNA obtenido y su grado de pure&a. Al final se hi&o la digesti+n del plasmido plasmido aislado aislado mediant mediante e en&imas en&imas de restricci+n y se reali&+ la electroforesis en agarosa para observar la evidencia de los fragmentos obtenidos.
Palabras clave aislamiento! lisis! "lásmi#o! vector! vector! $%A "lasmí#ico! "lasmí#ico! lisis alcalina! enzima #e restricci&n! electro'oresis(
Introducción 'os plsmidos son molculas pe!ue*as de ADN circular capaces de replicarse de forma forma aut+noma aut+noma44 indepen independien dienteme temente nte del cromosoma. cromosoma. $on muy comunes comunes en bacte bacteria rias s y algu algunos nos de ellos ellos44 los los ms pe!ue*os4 e5is e5iste ten n en las las clula lulas s
bacterianas en un n6mero elevado (hasta 788 copias por clula). 'os plsmidos son una herramienta fundamental en -iologa /olecular e ngeniera 0entica ya !ue se pueden usar como 1vectores2 para introducir en ellos cual!uier fragmento de ADN de inters y de esta forma amplificarlo de forma natural dentro de la bacteria en la !ue el plsmido se replica (es lo !ue se llama 1clonar2 un fragmento de DNA). 35isten muchos plsmidos disponibles para usar con este fin y la mayora contienen al menos los siguientes elementos9 :;n origen de replicaci+n aut+nomo para 3. coli (e<. ,ol37) !ue permite la replicaci+n aut+noma en esta bacteria. :;n gen !ue confiere a la bacteria portadora del plsmido resistencia a alg6n antibi+tico4 generalmente ampicilina. :;n sitio de clonaci+n m6ltiple en el !ue se encuentra dianas 6nicas para varias en&imas de restricci+n y !ue permite la introducci+n del ADN a clonar. ;n mtodo !ue permite visuali&ar ADN plasmdico o fragmentos del mismo es la electroforesis en gel de agarosa4 en la cual se separan en funci+n de su tama*o. 3sta tcnica consiste en someter la me&cla de molculas de ADN embebidas en un gel de agarosa a un campo elctrico. 'as molculas de ADN son atradas al polo positivo debido a la carga neta negativa de ambas cadenas consecuencia de sus grupos fosfato. 'as molculas ms pe!ue*as migran ms rpido !ue las grandes al verse menos 1frenadas2 por el gel de agarosa en su despla&amiento. ,uando los fragmentos se han separado4 el gel se sumerge en
una soluci+n !ue contiene bromuro de etidio y luego se ilumina con lu& ;=. 3l bromuro de etidio (3t-r) es una molcula plana con afinidad por el ADN !ue se intercala entre las pares de bases y !ue tiene la particularidad de !ue fluoresce cuando est unido a l. Al iluminar el gel con lu& ;= se ven bandas de fluorescencia !ue corresponden a molculas de ADN. 'a obtenci+n de altas cantidades de ADN plasmdico puro es fundamental a la hora de anali&arlo o utili&ar a ste como vector en aplicaciones posteriores. 3l avance de la ingeniera gentica y de las tcnicas de ADN recombinante ha supuesto un aumento del n6mero y variedad de tcnicas de purificaci+n de ADN. 3n comparaci+n con mtodos tradicionales (!ue utili&an fenol u otros reactivos t+5icos)4 los nuevos mtodos utili&an reactivos no peligrosos4 mientras !ue mantienen un alto rendimiento y pure&a del producto final. 'a mayora de los plsmidos usados en -iologia /olecular contienen el sitio de clonaci+n m6ltiple dentro el gen de la >: galactosidasa lo !ue permite la interrupci+n e inactivaci+n de este gen cuando un DNA inserto se clona en esta regi+n. 3n medios de cultivo !ue contengan el anlogo de la lactosa ?:gal4 esta estrategia permite distinguir las colonias bacterias !ue contienen el vector recombinante (con inserto) de a!uellas !ue han recibido un vector no recombinante (sin inserto). 'as bacterias !ue reciben el vector recombinante no pueden utili&ar lactosa ni su anlogo y formar colonias blancas. 'as bacterias !ue reciben un vector no recombinante s
pueden utili&ar la lactosa o su anlogo y formarn colonias a&ules. 'as en&imas de restricci+n o endonucleasas4 son en&imas !ue cortan los enlaces fosfodiester del material gentico a partir de una secuencia !ue reconocen. 'as mismas permiten cortar DNA de hebra doble4 donde reconocen secuencias palindr+micas (secuencias !ue se leen igual en ambas direcciones). $on e5tradas de organismos procari+ticos (bacterias)4 donde act6an como un mecanismo de defensa4 para degradar material gentico e5tra*o !ue entre en la clula. 'as bacterias tienen la capacidad de metilar su DNA4 lo cual sirve para distinguir entre el DNA e5tra*o y el DNA propio. 'as en&imas de restricci+n no pueden cortar DNA metilado4 de este modo solo afectan el DNA e5tran
Metodología 'a correspondiente al manual de 0entica molecular practica @ (Aislamiento y purificaci+n de plsmidos) y @B (Digesti+n de DNA con endonucleasas de restricci+n)C se hi&o
una modificaci+n al procedimiento ya !ue no se reali&+ digesti+n con ind ni con la me&cla de 3cor E ind.
Observaciones y Resultados Debido a !ue la muestra obtenida posteriormente a la desnaturali&aci+n no se le agreg+ FNAsa4 no se purifico correctamente por lo !ue en las lecturas del espectrofot+metro ;=$:GG (espectrofot+metro ;=H=is para micro vol6menes) se observa la presencia de gran cantidad de contaminantes del tipo FNA.
Tipo de /uestra dsDNA FNA
Abs IJ8 JG.KBL JB.B7L
Abs IB8 ML.I7L MK.L
Tabla 1.- Lecturas espectrofotométricas de una muestra de material genético extraída de una colonia bacteriana de Escherichia coli mediante la técnica de miniprep, donde se observa la cantidad obtenida de D! plasmídico " p30%P: N7), su grado de pure#a, $ la cantidad de %! contaminante.
Fela 7.G 7.GB
Discusión
Fi)ura *(+ Electro'oresis en )el #e a)arosa #e la muestra #e "lasmi#o sin #i)erir , #i)eri#o con la enzima EcoR-! #on#e se observa que el tama.o a"ro/ima#o #e los 'ra)mentos sin #i)erir 01 2 es ma,or a 3453"b mientras que el #e los 'ra)mentos #i)eri#os se acerca a a 1644 "b(
$e logr+ e5traer una muestra de DNA plasmdico !ue son molculas pe!ue*as de ADN circular capaces de replicarse de forma aut+noma e independientemente del cromosoma y no es necesario para la viabilidad general de la clula4 y en realidad sus genes contribuyen a la supervivencia de la bacteria en condiciones especiales. Por ello fue posible e5traerlo ya !ue la bacteria se desarroll+ en un cultivo en condiciones !ue contenan L88 mgHml de antibi+tico de ampicilina en medio 'uria -ertani ('-)4 !ue es el medio utili&ado por e5celencia para el mantenimiento de las cepas de 3.coli recombinante4 por su contenido de peptona proporciona nitr+geno y carbono4 las vitaminas (como las vitaminas -) y determinados oligoelementos son proporcionados por e5tracto de levadura y los iones de sodio para el transporte y el e!uilibrio osm+tico se proporcionan por el cloruro de sodio. Al ser tratadas4 solo las bacterias !ue contengan el plsmido con el gen para resistencia a ampicilina lograron sobrevivir4 con ello se asegur+ tener los solo plsmidos deseados eliminando el resto !ue no era de inters.
Fi)ura 3(+ Vector "EGFP+%* Sitios #e corte #e #istintas enzimas #e restricci&n entre estas la enzima EcoR- en la #iana no( 714(
Durante el segundo paso para la obtenci+n de DNA plasmdico se reali&+ la lisis celular 4 con el uso de la soluci+n de lisis (Tris:,l4 glucosa y 3DTA) !ue por su contenido de idro5imetilaminometano (Tris) sirvi+ para estabili&ar el p entre y B4 mientras !ue el 3DTA funcion+ como
!uelante de iones /g evitando as !ue las DNAsas degradaran al DNA plasmdico4 y con ayuda del ,l y la concentraci+n de glucosa pudiera desestabili&ar la membrana celular4 para !ue cuando se agregara el $D$ pudiera lisar la membrana liberando asi el DNA plasmdico y parte del cromos+mico. Debido a la aparente me&cla de DNA obtenida durante la lisis celular por diferencias de forma y tiempo de desnaturali&aci+n4 se coloc+ Na !ue desnaturali&o las molculas de DNA cromos+mico convirtindolo a DNA de cadena sencilla4 mientras en estas condiciones el DNA plasmdico permanece intacto debido principalmente a su pe!ue*o tama*o y su naturale&a circular y s6per enrollada separando as los dos tipos de DNA. 3n el siguiente paso se utili&+ una soluci+n de acetato de potasio ($oluci+n )4 !ue
pudo degradar mediante la acci+n de en&imas. 'a lectura espectrofotomtrica muestra tambin una buena relaci+n de densidad +ptica IJ8HIB8 del DNA plasmidico con un resultado de 7.G muy cercano a 7.B4 !ue indica !ue tiene muy ba
Referencias •
Conclusiones $e logr+ mediante la tcnica de miniprep la e5tracci+n de DNA plasmidico de una cepa bacteriana cultivada con genes de resistencia a ampicilina4 !ue permiten seleccionar las bacterias !ue portan estos plsmidos4 gracias a su capacidad para crecer en presencia de dicho antibi+tico (el gen de resistencia codifica una beta lactamasa4 en&ima !ue degrada la ampicilina)4 adems se reali&o una digesti+n en el gen especfico del plasmido con la en&ima de restricci+n 3coF4 y se identifico el tama*o apro5imado obtenido como resultado de dicha digesti+n y con ello se logro estudiar y entender el fundamento te+rico del mtodo mediante la observaci+n de los resultados obtenidos.
•
•
•
•
•
CONCEPCIÓN J., PE!"# $., C%#&I# P., !E'# P. ()**+. P!-C"IC# &E $IO%O/0# 1O%EC%#!. EP#'#2 PON"I3ICI# NI4E!I&#& J#4E!I#N# E/#%, C. ()**+. 1#N#% &E P!#C"IC# $IO%O/I# 1O%EC%#! &E %# CE%%# %. 156ICO2 N#1 7#4#%#, J. ()**+. 1#N#% &E "5CNIC# $-IC# &E $IO%O/0# 1O%EC%#!, 4O%1EN 8. 156ICO2 #&9 1E&IO &E C%"I4O &E:I&!#"#&O %$ (%!I# $E!"#NI. ()**8. !ECPE!#&O &E2 ;ttp2<<===.ru>ila>or.comiology< cursos<>iologiageneral
