I.
Tujuan
Melakukan deproteinase sampel darah menggunakan beberapa zat pengendap protein
Melakukan isolasi obat yang diuji dari matrik darah menggunakan ekstraksi cair-cair
II.
Prinsip
Prinsip proses deproteinasi adalah melepaskan ikatan ikatan antara protein dan plasma dengan penambahan zat pengendap protein pada serum sebelu melakukan pengukuran, yang berfungsi mengendapkan protein. Prinsip metode esktraksi cair-cair adalah proses pemisahan zat terlarut berdasarkan pada kelarutan zat terlarut pada dua pelarut yang tidak saling bercampur seperti eter, kloroform, karbontetra klorida, dan karbon disulfida.
III.
Teori Dasar
Penetapan kadar obat dalam plasma adalah salah satu bagian dari pemantauan kadar obat didalam darah. Teknik ini biasa digunakan klinisi untuk mengoptimalkan dosis obat dengan memberikan dosis yang ditetapkan berdasarkan konsentrasi target dengan cara mengukur kadar obat dalam darah dan bila perlu melakukan penyesuaian dosis. Pemantauan kadar obat dalam darah ini bertujuan untuk membantu meningkatkan penggunaan obat yang lebih rasional baik keamanan dan efektifitas dosis pada individu penderita. (Chamberlain,1995) Penelitian farmakokinetik melibatkan penentuan kadar obat dalam sampel biologis. Metode analisi yang digunakan untuk penentuan kuantitatif kadar obat dalam suatu sampel biologis merupakan hal yang sangat penting dalam evaluasi dan interpretasi data farmakokinetika. Berbagai sampel biologis dapat diambil untuk penentuan kadar dalam tubuh untuk penelitian farmakokinetik, sebagai contoh darah, urin,
feses, saliva, jaringan tubuh, cairan blister, cairan spinal dan cairan sinovial. (Chamberlain,1995)
Tabel XI. Daftar Sampel Biologis Bergantung pada Fluiditasnya dalam Kaitanya dengan Tingkat Kemudahan Analisisnya (Chamberlain,1995) Tingkat Fluiditas
Jenis Sampel Biologis
Cairan
- Cairan serebrospinal - Air mata. - Keringat - Ludah - Urin - Empedu
Campuran
- Plasma - Serum - Darah - Feses
Padatan
- Otak - Jantung, Ginjal dan Hepar - Paru, Otot - Tulang
1. Darah Pengukuran konsentrasi obat dalam darah, serum, atau plasma merupakan pendekatan paling baik untuk memperoleh profil farmakokinetik obat didalam tubuh (Shargel, Wu Pong & Yu, 2005). Plasma adalah suatu cairan kompleks yang berfungsi sebagai media transportasi untuk zat-zat yang diangkut dalam darah. Konstituen plasma antara lain air, elektrolit, nutrien, zat sisa, gas, hormon, dan protein plasma (Ganong, 2009). Plasma diperoleh
dari supernatan darah yang telah ditambah antikoagulan kemudian disentrifugasi (Shargel, Wu Pong & Yu, 2005). Prinsip kerja dari sentrifugasi yaitu objek diputar secara horizontal. Pada saat objek diputar, partikel-partikel yang ada akan berpisah sesuai berat jenis masing-masing partikel. Gaya yang berperan dalam sentrifugasi ini adalah gaya sentrifugal. Setelah dilakukan sentrifugasi, spesimen terpisah menjadi dua bagian yaitu pellet yang berada di bagian bawah berupa endapan yang memiliki bobot jenis yang lebih besar dan supernatan yang berada pada bagian atas dengan warna yang lebih jernih yang memiliki bobot jenis yang lebih kecil. Pellet berupa plasma sedangkan supernatan adalah serum. Serum adalah bagian cairan darah, tanpa faktor pembekuan atau sel darah. Sedangkan plasma adalah cairan darah sebelum darah membeku yang mengandung unsur pembekuan darah.(Bernasconi G. 1995) Penentuan kadar suatu obat dalam plasma merupakan hal yang kompleks disebabkan plasma merupakan suatu matriks yang kompleks. Perlakuan awal terhadap sampel meliputi isolasi obat yang akan ditentukan dari sampel matriks biologis harus dilakukan. Preparasi sampel plasma agar dapat memisahkan atau mengisolasi obat diupayakan menggunakan prosedur seminimal mungkin untuk menghindari kehilangan obat yang akan ditentukan didalam plasma. Semakin panjang tahapan prosedur untuk preparasi sampel plasma hingga proses memisahkan atau mengisolasi obat maka semakin besar kemungkinan hilangnya obat yang akan ditentukan.( Hendra Adijuwana. 1989) Beberapa cara preparasi sampel untuk penetapan kadar obat dalam plasma (Evans, 2004), yakni : a. Pengendapan Protein Plasma Contoh zat pengendap protein: asam tungsat, amonium sulfat, tricloro acetic acid (TCA), asam perklorat, ZnSO 4,
metanol, dan asetonitril. Protein dapat diendapkan karena memiliki berbagai sifat diantaranya bersifat sebagai amfoter yakni memiliki 2 muatan yang berlainan dalam 1 molekul, atau yang dikenal juga sebagai zwitter ion. Sifat ini membuat protein memiliki muatan yang berbeda pada pH yang berbeda pula. Akibatnya protein dapat larut pada rentang pH tertentu dimana protein bermuatan Suatu saat di pH tertentu protein akan mencapai titik isoelektriik, yakni pH dimana jumlah obat total muatan protein sama dengan nol (muatan positif sebanding dengan muatan negatif), hal ini akan mempengaruhi kelarutan protein. Pada titik isoelektrik, kelarutan protein sangat rendah, sehingga protein dapat mengendap. Selain itu, protein juga dapat membentuk ikatan dengan logam dimana beberapa asam amino dapat terikat pada satu logam sehingga molekulnya menjadi besar, beratnya juga menjadi besar sehingga protein mengendap. Selain itu, terdapat juga beberapa sifat lain yang berhubungan dengan presipitasi protein ini yang dijelaskan pada mekanisme pengendapan oleh masing-masing reagen. Larutan konsentrasi
(NH4)2SO4
tinggi.
merupakan
Mekanisme
garam
dengan
(NH4)2SO4 sebagai
anti
presipitasi protein dikenal sebagai salting out, yakni penurunan kelarutan protein dengan adanya peningkatan konsentrasi garam. Hal ini terjadi karena interaksi antara air dengan gugus polar dari protein menurun. Kelarutan protein akan berkurang bila terdapat garamgaram anorganik dalam konsentrasi tinggi mengakibatkan pengendapan
protein
tersebut.
Sifat
ini
terjadi
karena
kemampuan ion garam untuk terhidrasi dan terjadi kompetisi antara garam dengan molekul protein untuk mengikat air.
Mekanisme ZnSO4 – NaOH sebagai agen presipitasi adalah NaOH akan memberikan suasana basa pada larutan dan mengakibatkan protein berada dalam keadaan ion negatif atau anion. Anion protein ini akan berikatan dengan ion positif yang berasal dari logam berat yakni Zn2+ membentuk logam protein yang tidak larut. Logam berat juga akan merusak struktur sekunder dan tersier dari protein. Ikatan dari ion logam bermuatan positif akan menurunkan kelarutan protein. Ion logam akan berkompetisi dengan proton-proton pada larutan untuk berikatan dengan asam amino. Semakin kuat ikatan ionion logam untuk menggantikan ikatan oleh proton-proton akan menurunkan pH larutan. Kombinasi dari perubahan pI, penurunan pH (baik akibat ion logam maupun NaOH) akan menyebabkan protein mengendap. Penambahan larutan organik seperti metanol dan asetonitril pada larutan protein dalam air akan menurrunkan KD (Konestanta Dielektrik) pelarut/air yang meningkatkan tarikan antara molekul-molekul bermuatan dan memfasilitasi interaksi elektrostatik protein. Pelarut organik ini juga akan menggantikan beberapa molekul air disekitar daerah hidrofob dari permukaan protein yang berasosiasi dengan protein sehingga menurunkan konsentrasi air dalam larutan dengan demikian kelarutan protein akan menurun dan memungkinkan terjadinya pengendapan. a. Ekstaksi Padat-Cair (Solid-Phase Extraction) Ekstaksi padat-cair menggunakan catridge khusus untuk memisahkan obat dari sampel dengan volume relatif lebih kecil (0,5-1mL) yang tersedia secara komersial dengan harga yang cukup mahal.
b. Ekstraksi Cair-Cair Ekstraksi cair-cair merupaka suatu metode yang paling banyak digunakan karena relatif cepat, simpel, dan murah dibandingkan
dengan
ekstraksi
padat-cair.
Ekstraksi
ini
menggunakan pelarut pengekstraksi diikuti proses pemekatan obat yang akan dianalisis. Pemilihan pelarut pengekstraksi dalam ekstraksi cair-cair harus didasarkan pada sifat fitokimia obat maupun metabolit yang akan diisolasi. Berbagai faktor dapat menjadi pertimbangan dalam seleksi pelarut yang akan digunakan antara lain :
-
Tidak bercampur dengan air
-
Mempunyai kemampuan melarutkan obat yang diinginkan dalam jumlah yang besar sehingga memberikan nilai recovery yang besar
-
Mempunyai titik didih yang relatif rendah sehingga waktu evaporasi pelarut relatif lebih singkat
-
Sedapat mungkin volume yang digunakan untuk ekstraksi adalah minimal sehingga akan menekan biaya yang dikeluarkan
-
Jika memungkinkan gunakan pelarut dengan berat jenis yang lebih kecil dari berat jenis air sehingga proses pemisahan pelarut organik akan lebih mudah karena pelarut organik akan berada pada lapisan atas
2. Urin Urin, berbeda dengan plasma atau serum, biasanya bebas dari protein atau lemak sehingga bisa diekstraksi langsung dengan pelarut organic. Meskipun begitu, urin memiliki banyak variasi komposisi dan sangat tergantung pada jenis makanan yang dikonsumsi. Normalnya senyawa yang ditemukan dalam urin adalah larut air, sedangkan sebagian besar obat larut lipid sehingga dapat diekstraksi dengan pelarut yang cocok.
Kesulitan dalam pengumpulan sampel urin adalah volume urin yang benar yang diproduksi selama interval waktu s ampling, bukan pada penetapan kadarnya. Jumlah analit diperoleh dengan mengalikan volume dan konsentrasinya. Sampel urin juga sering memberikan hasil negative palsu misalnya pada pemeriksaan kreatinin. Urin juga memiliki variasi pH yang lebar, dipengaruhi oleh konsumsi makanan atau obat-obatan. Penggunaan antasida misalnya, kemungkinan bisa menyebabkan urin menjadi basa. Asam kuat tidak besar pengaruhnya, pH urin normal berkisar 5,57.( Katzung.2011)
3. Feses Penanganan sampel feses cukup rumit, mengingat bentuknya semi padat dan juga berupa campuran sisa-sisa proses pencernaan maupun senyawa-senyawa sisa proses metabolisme tubuh. Harus dipikirkan pengambilan cuplikan yang tepat dan juga jenis pelarut yang cocok karena banyaknya senyawa yang terkandung, apalagi jika kadar analit dalam sampel kecil. .( Katzung.2011)
4. Sampel biologis lain Sampel biologis yang lain bisa berupa air susu, cairan serebrospinal,
empedu,
ludah
dan
lain-lain,
masing-masing
memiliki kekhasan sifat dan kandungan senyawa yang berbeda. Kelarutan obat dalam tiap larutan juga berbeda sehingga pemilihan pelarut harus dilakukan secara cermat. ( Katzung.2011)
IV.
Alat dan Bahan
NO Alat 1 Vortex
Bahan zat pengendap protein 10% (b/v) TCA
2
Sentrifugasi
Larutan Jenuh (NH2SO4)
3
Rotari evaporator vakum Tabung Mikrosentrifugasi Mikropipet Roller mixer
10% (b/v) ZnSO 4 – NaOH 0,5N (1:1) acetonitrile
4 5 6 7 8 V.
Metanol Plasma blangko Kloroform N-heksan
Prosedur
Presipitasi Protein I Dipipet 250 µL plasma blanko ke dalam tabung Mikrosentrifugasi
Ditambahkan zat pengendap protein 10% (b/v) TCA dengan perbandingan 1 : 2, Larutan Jenuh (NH 2SO4), 10% (b/v) ZnSO 4 – NaOH 0,5N (1:1), acetonitrile dan Metanol dengan perbandingan plasma 1 : 2
Divortex selama 2 detik
Disentrifugasi dengan kecepatan 3500 – 6000 rpm selama 15 menit
Diamati supernatan dan endapan yang diperoleh dan bandingkan hasil yang diperoleh menggunakan berbagai zat pengendap protein yang digunakan.
Ekstraksi cair-cair Dipipet 1 ml plasma balanko ke dalam 2 tabung sentrifugas
Ditambahkan pelarut pengekstraksi : Kloroform sebanyak 5 ml ke dalam tabung 1 dan n-heksan sebanyak 5 ml ke dalam tabung 2
kemudian divortex 15 menit
Disentrifugasi dengan kecepatan 3500 -6000 rpm selama 15 menit.
Diamati perbedaan yang terjadi dari hasil ekstraksi menggunakan pelarut kloroform dan n-heksan
VI.
Hasil Pengamatan
a. Pengendapan protein plasma
Zat
pengendap
Endapan
Kejernihan
0,1
+
protein 10% (b/v) TCA
(sangat tidak jernih )
Gambar
Larutan
jenuh
0,4
++++
(NH4)2SO4
(jernih)
10% (b/v) ZnSO 4- 0,5
+++++
NaOH 0,5 N (1:1)
(paling jernih)
Acetonitril
0,2
+++ (kurang jernih)
Metanol
0,3
++ (tidak jernih)
Keterangan : Zat pengendap protein paling bagus dilihat dari hasil pengendapan dan kejernihannya yaitu pada ZnSO 4 + NaOH. Sedangkan zat pengendap protein paling buruk yaitu pada TCA.
b. Ekstraksi cair-cair Pelarut pengekstraksi 1. n-heksan
Pengamatan Bagian yang paling atas yang bening merupakan bagian pelarut n-heksan. Bagian tengah yang terlihat keruh merupakan emulsi. Dan bagian paling bawah yang berwarna
kuning
merupakan
plasma. Emulsi
yang
terbentuk
lebih
sedikit. 2. Kloroform
Bagian yang paling atas yang berwarna plasma.
kuning Bagian
merupakan tengah
yang
terlihat keruh merupakan emulsi. Dan bagian paling bawah yang terlihat bening merupakan pelarut kloroform. Emulsi
yang
terbentuk
lebih
banyak.
Keterangan : ekstraksi cair- cair yang paling bagus adalah ekstraksi yang menggunakan pelarut n-heksan karena emulsi yang terbentuk sedikit. Sedangkan ekstraksi cair-cair yang paling buruk yang menggunakan pelarut kloroform karena emulsi yang terbentuk lebih banyak.
VII.
Pembahasan
Pemeriksaan farmakokinetika melibatkan penentuan kadar obat dalam sampel biologis. Sampel biologis adalah sampel yang diambil dari sebagian tubuh untuk tujuan analisis, misalnya darah, urine, liver/hati, empedu, otak, ginjal, otot, rambut, atau bagian tubuh (Shargel et al., 2005). Penentuan kadar obat dalam sampel biologis mempunyai beberapa tujuan, diantaranya yaitu untuk mengetahui/menetapkan adanya atau jumlah senyawa endogenik tertentu dengan tujuan diagnosa, untuk menetapkan adanya atau jumlah senyawa eksogenik (berasal dari luar tubuh) seperti analisis metabolit, keracunan, dan ketersediaan hayati suatu obat, dan untuk memantau penggunaan obat baik dalam analisis farmakodinamik, pemantauan maupun kepatuhan pasien (Shargel et al., 2005). Berbagai kendala perlu diperhatikan dalam penentuan kadar obat dalam sampel biologis diantaranya yaitu kadar analit biasanya rendah sehingga perlu metode analisis yang sensitif, dalam sampel biologis biasanya mengandung berbagai senyawa baik endogen maupun eksogen yang dapat mempengaruhi hasil analisis sehingga perlu analisis yang selektif atau dilengkapi dengan teknik pemisahan sebelum dilakukan analisis (Shargel et al., 2005). Pada percobaan kali ini dilakukan percobaan perlakuan awal sampel biologis dan pemisahan zat aktif dengan tujuan untuk melakukan berbagai teknik presipitasi protein dari sampel plasma dan melakukan ekstraksi cair-cair terhadap plasma menggunakan berbagai pelarut organik. Preparasi sampel biologis bertujuan untuk menghilangkan pengotor atau bahan yang dapat menggangu proses analisis. Sampel yang digunakan pada percobaan kali ini yaitu plasma. Plasma merupakan komponen darah berbentuk cairan berwarna kuning, sebagian besar terdiri dari air (95%), protein (7%) dan nutrien (1%). Didalam plasma terdapat faktor-faktor pembeku darah, komplemen, haptoglobin, transferin, feritin, seruloplasmin, kinina, enzim, polipeptida, glukosa, asam amino dan lain-lain (Evelyn, 2009). Pengambilan plasma dari darah dapat dilakukan dengan metode sentrifugasi dimana darah langsung disentrifugasi menggunakan alat centrifuge, hasil dari sentrifugasi berupa supernatan yang berwarna kuning jernih disebut plasma (Evelyn, 2009). Penentuan kadar obat didalam plasma sangat dipengaruhi oleh adanya protein plasma, dimana dapat berikatan dengan obat sehingga diperlukan tahap perlakuan awal dan/atau penyiapan sampel sebelum
penentuan kadar obat dapat dilakukan. Tahap tersebut harus dapat memutuskan ikatan antara obat dengan protein, sehingga obat tidak lagi berikatan dengan protein yang dapat mengganggu proses analisis. Pemutusan ikatan antara obat dengan protein tersebut dapat dilakukan dengan beberapa cara diantaranya yaitu mengatur pH sampel pada pH ekstrim (pH<3 atau pH>9) dengan penambahan asam atau basa, presipitasi protein menggunakan pelarut polar dan penambahan asam atau garam anorganik. Parameter yang digunakan untuk melihat apakah proses pemisahan menggunakan berbagai cara tersebut sempurna atau tidak yaitu dengan melihat kejernihan supernatan dan volume endapan yang diperoleh. Pengendapan protein bertujuan untuk memutuskan ikatan antara obat – protein dengan cara mengendapkan protein. Pengendapan protein plasma dilakukan dengan cara menambahkan zat pengendap protein seperti TCA 10%, larutan jenuh (NH 4)2SO4, ZnSO4 10% – NaOH 0,5N (1:1), asetonitril dan metanol dengan perbandingan yang sesuai kedalam masing-masing tabung mikrosentrifuga yang telah berisi 250 µL plasma blanko. Kemudian semua tabung mikrosentrifuga divortex selama 2 menit, hal ini bertujuan agar protein plasma kontak dengan zat pengendap protein sehingga menghasilkan larutan yang homogen. Setelah itu disentrifugasi dengan kecepatan 3500 rpm selama 15 menit. Sentrifugasi adalah metode sedimentasi untuk memisahkan partikel partikel dari suatu fluida berdasarkan berat jenisnya dengan memberikan gaya sentripetal (Khopkar, 2010). Sentrifugasi dengan kecepatan tinggi bertujuan untuk memisahkan komponen-komponen yang ada didalam plasma. Prinsipnya yakni dengan meletakkan sampel pada suatu gaya dengan memutar sampel pada kecepatan tinggi, sehingga terjadi pengendapan partikel, atau organel-organel sel berdasarkan bobot jenisnya (Artika, 2010). Substansi yang bobot jenisnya lebih besar akan berada dibawah yang disebut dengan endapan, sedangkan substansi yang bobot jenisnya lebih kecil akan berada diatas yang disebut dengan supernatan (Miller, 2000). Kemudian diamati supernatan dan endapan yang diperoleh. Terbentuknya endapan menunjukkan bahwa zat pengendap protein yang digunakan berhasil mengendapkan protein tersebut. Setalah disentrifugasi dilakukan pengamatan terhadap supernatant dan endapan yang diperoleh. Pengamatan dilakukan terhadap 2 aspek, yaitu kejernihan supernatant dan banyaknya endapan. Dari kedua aspek pengamatan tersebut dapat disimpulakan zat pengendap protein yang mana yang
lebih baik. Jika suatu campuran memiliki supernatant yang lebih jernih dan mengandung endapan yang lebih banya maka zat pengendap protein yang digunakan lebih baik, karena semakin jernih dan semakin banyak endapan yang diperoleh makan zat tersebut bekerja dengan baik dalam memisahkan sampel dari padatan. Pada tabung mikrosentrifuga yang ditambahkan zat pengendap protein ZnSO4 10% – NaOH 0,5N (1:1) dengan perbandingan 1:2 (plasma: ZnSO4 10% – NaOH 0,5N (1:1) menghasilkan volume endapan sebanyak 0,5 mL dan supernatan yang diperoleh dengan tingkat kejernihan pada urutan ke-1 sebagai zat pengendap protein yang bekerja maksimal. ZnSO4 – NaOH sebagai zat pengendap protein memiliki mekanisme dalam mengendapkan protein yaitu NaOH akan memberikan suasana basa pada larutan dan mengakibatkan protein berada dalam keadaan ion negatif atau anion. Anion protein ini akan berikatan dengan ion positif yang berasal dari Zn2+ sehingga membentuk logam protein yang tidak larut. Ikatan dari ion logam bermuatan prositif akan menurunkan kelarutan protein. Logam berat juga akan merusak struktur sekunder dan tersier dari protein. Ion logam akan berkompetisi dengan proton pada larutan untuk berikatan dengan asam amino, semakin kuat ikatan ion-ion logam untuk menggantikan ikatan oleh proton maka akan menurunkan pH larutan. Kombinasi dari penurunan pH akan menyebabkan protein mengendap (Moshage et al ., 1995). Pada tabung mikrosentrifuga yang ditambahkan zat pengendap protein larutan jenuh (NH4)2SO4 dengan perbandingan 1:2 (plasma:larutan jenuh (NH4)2SO4 menghasilkan volume endapan sebanyak 0,4 mL dan supernatan yang diperoleh dengan kejerniha pada urutan ke-2. Larutan jenuh (NH4)2SO4 merupakan garam dengan konsentrasi tinggi, dimana (NH 4)2SO4 sering disebut sebagai anti presipitasi protein ( salting out ). (NH4)2SO4 sebagai zat pengendap protein memiliki mekanisme dalam mengendapkan protein yaitu salting out dimana terjadi penurunan kelarutan protein dengan adanya peningkatan konsentrasi garam. Protein kurang terlarut ketika berada pada daerah yang konsentrasi kadar garam anorganik tinggi sehingga kelarutan protein akan menurun dan protein akan mengendap. Protein larut didalam plasma yang sebagian besar komponen utamanya yaitu air kemudian ditambahkan garam yang memiliki sifat meretensi atau menarik air, sehingga terjadi kompetisi antara protein dengan garam dalam menarik atau mengikat air. Pada konsentrasi tinggi, kekuatan ionik garam semakin kuat sehingga garam lebih dapat mengikat
molekul air, maka jumlah air yang tersedia untuk molekul protein akan berkurang. Dengan demikian, tidak cukup banyak air yang terikat pada protein sehingga gaya tarik menarik antar molekul protein lebih menonjol dibandingkan dengan tarik menarik antara air dan protein. Dalam kondisi seperti itu protein akan mengendap (Mayes et al ., 1990). Pada tabung mikrosentrifuga yang ditambahkan zat pengendap protein asetonitril dengan perbandingan 1:2 (plasma:asetonitril) menghasilkan volume endapan sebanyak 0,2 mL dan supernatan yang diperoleh dengan kejernihan (+++) pada urutan ke-3. Pada tabung mikrosentrifuga yang ditambahkan zat pengendap protein metanol dengan perbandingan 1:2 (plasma:metanol) menghasilkan volume endapan sebanyak 0,3 mL dan supernatan yang diperoleh dengan kejernihan (++) pada urutan ke-4. Metanol dan asetonitril merupakan pelarut organik polar yang dapat mengendapkan protein. Konstanta dielektrik menggambarkan tingkat kepolaran suatu pelarut. Semakin tinggi nilai KD maka sifat pelarut semakin polar sebaliknya semakin rendah nilai KD maka sifat pelarut semakin non polar. Suatu zat akan terlarut sempurna dalam pelarut yang nilai KDnya sama. Protein larut didalam plasma yang sebagian besar komponen utamanya yaitu air, sehingga KD protein dianggap hampir sama dengan KD air atau plasma. Metanol dan asetonitril sebagai zat pengendap protein memiliki mekanisme dalam mengendapkan protein yaitu plasma sebagian besar komponen utamanya yaitu air ditambahkan dengan metanol dan asetonitril (pelarut organik polar) akan menurunkan nilai konstanta dielektrik plasma yang mengandung protein terlarut sehingga nilai KD plasma akan semakin jauh dengan protein sedangkan nilai KD protein tetap karena merupakan zat terlarut bukan pelarut, akibatnya nilai KD protein dengan plasma berbeda. Perbedaan nilai KD tersebut menyebabkan protein menjadi tidak larut sempurna dan protein akan mengendap. Pengendapan ini berkaitan dengan potensi Ion (pI) protein, dimana semakin jauh dari titik isoelektrik maka kelarutan akan semakin meningkat dan semakin dekat dengan titik isoelektrik maka kelarutan akan semakin menurun. Penambahan pelarut organik pada larutan protein dalam air akan menurunkan nilai KD. Pelarut atau air yang meningkatkan tarikan antara molekulmolekul bermuatan dan memfasilitasi interaksi elektrostatik protein. Selain itu pelarut organik ini juga akan menggantikan beberapa molekul air di sekitar daerah hidrofob dari permukaan protein yang berasosiasi dengan protein sehingga menurunkan konsentrasi air dalam
larutan dengan demikian kelarutan protein akan menurun dan memungkinkan terjadinya pengendapan (Guevara, 1998). Pada tabung mikrosentrifuga yang ditambahkan zat pengendap protein TCA 10% dengan perbandingan 1:0,2 (plasma:TCA 10%) menghasilkan volume endapan sebanyak 0,01 mL dan supernatan yang diperoleh dengan kejernihan (+) pada urutan ke-5. Protein dapat diendapkan karena memiliki 2 muatan yang berlainan didalam 1 molekul. Muatan tersebut membuat protein dapat larut dalam plasma pada rentang pH tertentu. Pada pH tertentu protein akan mencapai titik isoelektrik, dimana jumlah total muatan protein sama dengan nol (netral) sehingga akan mempengaruhi kelarutan protein. Ketika kelarutan protein sangat rendah protein akan dapat diendapkan. TCA 10% sebagai zat pengendap protein memiliki mekanisme dalam mengendapkan protein yaitu TCA memiliki muatan ion negatif sehingga akan bergabung dengan protein yang ada pada kondisi kation (pH larutan dalam kondisi asam hingga pH isoelektrik protein) sehingga akan membentuk garam protein, beberapa garam yang dihasilkan tersebut tidak larut (mengendap) sehingga plasma dan protein terpisah (Hurana et al , 2001). Pada percobaan ini dapat disimpulkan zat pengendap protein yang paling baik dalam mengendapkan protein yaitu ZnSO 4-NaOH karena menghasilkan volume endapan paling banyak yaitu 0,5 mL sehingga banyak protein yang terendapkan dimana semua protein yang terdenaturasi terendapkan pada proses sentrifugasi. Dan menghasilkan supernatan dengan kejernihan pada urutan ke-1. ZnSO 4-NaOH memiliki mekanisme dalam mengendapkan protein yaitu pembentukan kompleks yang tidak larut antara logam dengan protein dan logam dapat merusak struktur sekunder dan tersier dari protein. Selanjutnya pada percobaan ini dilakukan ekstraksi cair-cair dengan menggunakan pelarut organik (klorofom dan n-heksan) yang bertujuan untuk mengisolasi atau menarik obat dari plasma. Parameter yang digunakan untuk melihat apakah proses isolasi atau penarikan obat dari plasma tersebut terpisah sempurna atau tidak yaitu dengan melihat lapisan yang terbentuk. Keberhasilan suatu proses ekstraksi cair-cair ditandai dengan banyaknya obat yang dapat diisolasi atau ditarik dari plasma. Tetapi pada percobaan kali ini plasma yang digunakan tidak mengandung obat sehingga tidak dapat ditentukan jumlah obat yang dapat ditarik dari plasma. Ekstraksi cair-cair merupakan metode ekstraksi yang didasarkan pada sifat kelarutan komponen target dan distribusinya dalam dua
pelarut yang tidak saling bercampur (Khopkar, 2002). Pemilihan pelarut yang akan digunakan harus memilki sifat immiscible (tidak bercampur dengan air dan mampu melarutkan oabt yang diinginkan (Basset et al ., 1994). Syarat pelarut untuk ekstraksi cair-cair adalah memiliki kepolaran yang sesuai dengan bahan yang diekstraksi (Harvey, 2000). Keterbatasan ekstraksi cair-cair yaitu tidak bisa digunakan untuk senyawa obat yang polar atau larut didalam air, hal ini karena tidak adanya pelarut yang lebih polar dari air sehingga obat tidak dapat diisolasi. Prinsip ekstraksi cair-cair yaitu pemisahan berdasarkan partisi yang dinyatakan dengan nilai koefisien partisi. Ektraksi cair-cair ditentukan oleh distribusi Nerst atau hukum partisi yang menyatakan bahwa “pada konsentrasi dan tekanan yang konstan, analit akan terdistribusi dalam proporsi yang selalu sama diantara dua pelarut yang saling tidak campur” (Khopkar, 2002). Langkah awal yang dilakukan dalam percobaan ini adalah mencampurkan 1 ml plasma blanko dengan dua jenis pelarut, yaitu chloroform dan n-heksan yang diletakkan pada tabung yang berbeda. Setelah dicampurkan ke dalam tabung sentrifuga lalu divortex selama 15 menit dan disentrifuga selama 15 menit dengan kecepatan 4000 rpm. Tujuan disentrifuga dengan kecepatan tinggi adalah proses ekstraksi terjadi dengan sempurna, sedangnkan fungsi dari sentrifugasi adalah agar komponen-komponen yang telah terpisah setelah proses ekstraksi dengan bantuan vortex dapat terpisah sepurna antara fasa air dengan fasa pelarut. Parameter yang digunakan yaitu dengan melihat berat jenis dan lapisan yang terbentuk. Diperoleh hasil pada tabung pertama dengan menggunakan pelarut kloroform yaitu terbentuk 2 lapisan dimana pada bagian atas berwarna kuning bening berupa plasma dan bagian bawah berwarna putih susu berupa emulsi protein bercampur dengan pelarut kloroform. Kloroform memiliki berat jenis 1,476 g/mL (DepKes RI, 2014) sedangkan plasma memiliki berat jenis 1,024-1,028 g/mL, berat jenis kloroform lebih besar daripada berat jenis plasma sehingga posisi kloroform akan berada dibawah sedangkan posisi plasma berada diatas karena berat jenisnya lebih kecil daripada kloroform. Pada tabung kedua dengan menggunakan pelarut n-heksan yaitu terbentuk 3 lapisan dimana pada bagian atas berwarna bening berupa pelarut n-heksan, pada bagian tengah berwarna putih susu berupa emulsi protein, dan pada bagian bawah berwarna kuning bening berupa plasma. N-heksan memiliki berat jenis 0,6548 g/mL (DepKes RI, 2014) sedangkan plasma memiliki berat jenis 1,024-1,028 g/mL, berat
jenis n-heksan lebih kecil daripada berat jenis plasma sehingga posisi n-heksan akan berada diatas sedangkan posisi plasma berada dibawah karena berat jenisnya lebih besar daripada n-heksan. Lapisan emulsi dapat terbentuk karena protein dapat berfungsi sebagai emulgator sehingga ketika disentrifugasi akan terbentuk emulsi. Dilihat dari jumlah emulsi protein yang terbentuk dapat disimpulkan bahwa ekstraksi menggunakan pelarut n-heksan lebih baik dibandingkan pelarut kloroform karena emulsi protein yang terbentuk hanya sedikit sehingga akan lebih mudah dianalisis. Dari hasil pengamatan didapatkan hasil bahwa pelarut n-heksan dapat mengekstrak zat aktif lebih baik dari pada kloroform. Hal ini dapat dilihat dari lapisan cairan yang terentuk setelah proses sentrufugasi. Pada pelarut n-heksan plasma dan pelarut terpisah dengan baik dan hanya menyisakan sedikit lapisan emulsi pada lapisan antarmuka kedua pelarut, sedangkan pada pelarut kloroform lapisan kedua pelarut tidak terpisah dengan baik dan terdapat lapisan emulsi yang banyak. VIII. Kesimpulan •
Zat pengendap protein yang paling efektif adalah ZnSO4 + NaOH
(NaSO4), sedangkan yang kurang efektif adalah TCA. •
Pelarut yang lebih efektif dalam memisahkan zat aktif dengan
metode ekstraksi cair-cair adalah n-heksan
Daftar Pustaka
Adnan, M. 1997. Teknik Kromatografi Untuk Analisis Bahan Makanan. Yogyakarta : Penerbit Andi. Artika IM, Safithri M. 2010. Diktat Kuliah Struktur dan Fungsi Subseluler . Basset dkk. 1994. Buku Ajar Vogel Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik . Jakarta : EGC. Bernasconi G. 1995. Teknologi Kimia I. Jakarta: Pradya Paramita Chamberlain, J.,1995. The Analysis of Drugs in Biological Fluids 2 nd Ed. New York : CRC Press. Departemen
Kesehatan Republik Indonesia. 2014.
Farmakope
Indonesia Edisi V . Jakarta. Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan. Evelyn CP, 2009. Anatomi dan Fisiologi untuk Paramedis. Jakarta. Gramedia. Evans, G. 2004. A Handbook of Bioanaysis and Drug Metabolism. USA : CRC Press. Ganong, W. F. 2009. Buku Ajar Fisiologi Kedokteran. Edisi 22. Jakarta: EGC. Guevara et al. 1998. Determination of Nitrite/Nitrate in Human Biological Material by the Simple Griess Reaction. Clin. Chim. Acta. Hendra Adijuwana. 1989. Teknik pemisahan Dalam Analisis Biologis. Bogor: IPB Press Harvey David. 2000. Modern Analytical Chemistry. New York : McGraw-Hill Comp. Hurana et al . 2001. Biochemistry. Partially Folded Intermediates as Critical Precursor of Light Chain Amyloid Fibrils and Amorphous Aggregates.
Katzung.Bertram, G. 2011 farmakologi dasar dan klinik, edisi 10. Jakarta: pustaka buku kedokteran Khopkar, S.M.,
2002. Konsep Dasar Kimia Analitik . Jakarta : UI
Press. Khopkar.S.M. 2010. Konsep dasar Kimia Analitik . Jakarta : UI Press. Martin, Alfred. Ph.D. 1990. Farmasi Fisik: Dasar-dasar kimia fisik dalam ilmu farmasetik. Jakarta : Penerbit Universitas Indonesia. Mayes, P.A., Granner, D.K., Rodwell, V.W., dan Martin, D.W., 1990. Biokimia Harper Edisi 20. Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran. Miller J.N. 2000. Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry 4th ed. Harlow: Prentice. Hall. Moshage et al . 1995. Nitrite and Nitrate Determination in Plasma: a Critical Evaluation. Clin. Chem. Shargel, Leon., Susanna Wu-Pong, Andrew B. C. Yu. 2005. Biofarmasetika
dan
Farmakokinetika
Terapan,
Edisi
V,
terjemahan Fasich dan Budi Suprapti. Surabaya : Airlangga University Press.
