MAKALAH KELOMPOK TUGAS MATA KULIAH
KIMIA FARMASI ANALISIS “ANALISIS OBAT PADA SAMPEL BIOLOGIS”
OLEH KELOMPOK XI (SEBELAS) FARMASI B 1. QURRATUL AENI 2. HARDIYANTI EKA PUTRI 3. WIWIN KHAIRUNNISA
JURUSAN FARMASI FAKULTAS ILMU KESEHATAN UNIVERSITAS ISLAM NEGERI ALAUDDIN SAMATA-GOWA 2014 BAB I
PENDAHULUAN A. Latar Belakang Penelitian farmakokinetik melibatkan penentuan kadar obat dalam sampel biologis. Metode analisis yang digunakan untuk penentuan kuantitatif kadar obat dalam suatu sampel biologis merupakan hal yang sangat penting dalam evaluasi dan interpretasi data farmakokinetika. Berbagai sampel biologis dapat diambil untuk penentuan kadar dalam tubuh untuk penelitian farmakokinetik, sebagai contoh darah, urine, feses, saliva, jaringan tubuh, cairan blister, cairan spinal dan cairan sinovial. Penentuan kadar suatu obat dalam sampel biologis merupakan hal yang kompleks disebabkan sampel biologis pada umumnya merupakan suatu matriks yang kompleks. Jika suatu obat atau metabolitnya dalam sampel biologis dapat dianalisa langsung tanpa perlu dilakukan perlakuan awal terhadap sampel yang diperoleh maupun pemisahan obat atau metabolit yang ditentukan maka hal ini merupakan suatu hal yang menguntungkan. Akan tetapi perlakuan awal sampel maupun isolasi obat atau metabolit yang akan ditentukan dari matriks biologis yang diperoleh harus dilakukan. Hal yang perlu diperhatikan dalam pemilihan perlakuan awal sampel maupun metode untuk memisahkan atau mengisolasi obat dan/atau metabolitnya adalah tahapan dari prosedur yang dipilih harus seminimal mungkin untuk menghindari kehilangan obat dari obat atau metabolit yang akan ditentukan. Semakin panjang tahapan prosedur untuk perlakuan awal maupun untuk memisahkan atau mengisolasi obat atau metabolitnya makin besar kemungkinan hilangnya obat atau metabolit yang akan ditentukan sepanjang prosedur yang dilakukan. Berdasarkan uraian diatas, maka didalam makalah ini kami akan membahas tentang “ANALISIS OBAT DALAM SAMPEL BIOLOGIS”.
B. Rumusan Masalah 1. Bagamana prosedur penyiapan sampel? 2. Bagaimana proses/cara identifikasi obat pada sampel biologis? C. Tujuan Makalah 1. Mahasiswa mampu menjelaskan penyiapan awal sampel biologis 2. Mahasiswa 3. mampu menjelaskan cara analisis obat di dalam sampel biologis D. Manfaat Makalah Mahasiswa dapat mengetahui dan memahami penyiapan sampel serta identifikasi obat pada sampel biologis.
BAB II PEMBAHASAN A. Pengertian Sampel Biologis Sampel biologis adalah sampel yang diambil dari sebagian tubuh untuk tujuan analisis, misalnya darah, urine, feses, saliva atau bagian tubuh. Menurut Chamberlain, sampel biologis merupakan contoh uji yang diambil atau berasal dari tubuh manusia, hewan, atau tumbuhan berupa urin, darah, cairan lambung, daging, hati, atau jaringan lainnya. www.research.ucsf.edu/chr/guide/UCSFBiospecimenGuideMay05.pdf. B. Sampel Biologis dan pengambilan sampel 1. Blood/darah. Blood/darah.merupakan sampel biologis yang paling
baik untuk
identifikasi obat/ zat aktif dan untuk analisis kuantitatif. Dalam kegiatan pengumpulan sampel darah dikenal istilah phlebotomy yang berarti proses mengeluarkan darah. Dalam praktek laboratorium klinik, ada 3 macam cara memperoleh darah, yaitu : melalui tusukan vena (venipuncture), tusukan kulit (skinpuncture) dan tusukan arteri atau nadi. Venipuncture adalah cara yang paling umum dilakukan, oleh karena itu istilah phlebotomy sering dikaitkan dengan venipuncture. Pengambilan darah atau flebotomi merupakan prosedur pengambilan sampel yang paling umum di laboratorium. Agar dapat diperoleh spesimen darah yang memenuhi syarat uji laboratorium, maka prosedur pengambilan sampel darah harus dilakukan dengan benar, mulai dari persiapan peralatan, pemilihan jenis antikoagulan, pemilihan letak vena, teknik pengambilan sampai dengan pelabelan. Pada pengambilan darah vena (venipuncture), contoh darah umumnya diambil dari vena median cubital, pada anterior lengan (sisi dalam lipatan siku). Vena ini terletak dekat dengan permukaan kulit, cukup besar, dan tidak ada pasokan saraf besar. Apabila tidak memungkinkan, vena chepalica atau vena basilica bisa menjadi pilihan berikutnya. Venipuncture pada vena basilica harus dilakukan dengan hati-hati karena letaknya berdekatan dengan arteri brachialis dan syaraf median.
Jika vena cephalica dan basilica ternyata tidak bisa digunakan, maka pengambilan darah dapat dilakukan di vena di daerah pergelangan tangan. Lakukan pengambilan dengan dengan sangat hati-hati dan menggunakan jarum yang ukurannya lebih kecil Ada dua cara dalam pengambilan darah vena, yaitu cara manual dan cara vakum. Cara manual dilakukan dengan menggunakan alat suntik (syring), sedangkan cara vakum dengan menggunakan tabung vakum (vacutainer). Volume darah yang diambil yaitu 10-20 ml untuk dewasa, 1-5 ml untuk anakanak dan 1-3 ml untuk bayi. www.brmc-cares.com/Documents/Blood%20Collection%20Procedure.pdf 2. Urine Jenis-jenis specimen urine antara lain: a. Urine sewaktu/urine acak (random) adalah urine yang dikeluarkan setiap saat dan tidak ditentukan secara khusus. Mungkin sampel encer, isotonik, atau hipertonik dan mungkin mengandung sel darah putih, bakteri, dan epitel skuamosa sebagai kontaminan. Jenis sampel ini cukup baik untuk pemeriksaan rutin tanpa pendapat khusus. b. Urine pagi. Pengumpulan sampel pada pagi hari setelah bangun tidur, dilakukan sebelum makan atau menelan cairan apapun. Urine satu malam mencerminkan periode tanpa asupan cairan yang lama, sehingga unsurunsur yang terbentuk mengalami pemekatan. Urine pagi baik untuk pemeriksaan sedimen dan pemeriksaan rutin serta tes kehamilan berdasarkan adanya HCG (human chorionic gonadothropin) dalam urine. c. Urine tampung 24 jam adalah urine yang dikeluarkan selama 24 jam terusmenerus dan dikumpulkan dalam satu wadah. Urine jenis ini biasanya digunakan untuk analisa kuantitatif suatu zat dalam urine, misalnya ureum, kreatinin, natrium, dsb. Urine dikumpulkan dalam suatu botol besar bervolume 1.5 liter dan biasanya dibubuhi bahan pengawet, misalnya toluena. Wadah untuk menampung spesimen urine sebaiknya terbuat dari bahan plastik, tidak mudah pecah, bermulut lebar, dapat menampung 10-15 ml urine dan dapat ditutup dengan rapat. Selain itu juga harus bersih, kering,
tidak mengandung bahan yang dapat mengubah komposisi zat-zat yang terdapat dalam urine. 3. Feses Feses merupakan Sisa hasil pencernaan dan absorbsi dari makanan yang kita makan, dikeluarkan lewat anus dari saluran cerna. Dalam keadaan normal dua pertiga tinja terdiri dari air dan sisa makanan, zat hasil sekresi saluran pencernaan, epitel usus, bakteri apatogen, asam lemak, urobilin, debris, celulosa gas indol, skatol,sterkobilinogen dan bahan patologis. Normal : 100 – 200 gram / hari. Frekuensi defekasi : 3x / hari – 3x / minggu. Pada keadaan patologik seperti diare didapatkan peningkatan sisa makanan dalam tinja, karena makanan melewati saluran pencernaan dengan cepat dan tidak dapat diabsorpsi secara sempurna. Bahan pemeriksaan tinja sebaiknya berasal dari defekasi spontan, jika pemeriksaan sangat diperlukan contoh tinja dapat diambil dengan jari bersarung dari rektum. Hal – hal yang perlu diperhatikan Penyimpanan a) Feses tahan < 1 jam pada suhu ruang b) Bila 1 jam/lebih gunakan media transpot yaitu Stuart’s medium, ataupun Pepton water c) Penyimpanan < 24 jam pada suhu ruang, sedangkan > 24 jam pada suhu 4°C 4. saliva Syarat sebelum melakukan pemeriksaan saliva. a. Tidak diperbolehkan untuk makan, minum, sikat gigi, dan merokok, selama 1 jam sebelum pemeriksaan. b. Mengingat
sekresi
saliva
yang
terus
berubah
setiap
jamnya, waktu pemeriksaan saliva yang ideal menurut penelitian adalah pada pukul 09.00-11.00. Pada sore hari produksi saliva sangat banyak, sedangkan pada waktu tidur produksi saliva hampir mendekati nol.
Faktor yang mempengaruhi keadaan saliva: a. Kadar fosfat dan kalsium dalam saliva. b. Banyaknya jumlah bakteri streptococcus mutan dalam mulut. c. Merokok. Metode pengambilan saliva dengan cara: a. Metode draining, yaitu dengan cara membiarkan saliva terus mengalir ke dalam tabung gelas. b. Metode spitting, yaitu dengan cara saliva dikumpulkan terlebih dahulu dalam keadaan mulut tertutup, setelah itu diludahkan ke dalam tabung gelas. c. Metode suction, yaitu dengan cara saliva disedot dengan menggunakan pipa suction yang diletakkan di bawah lidah. d. Metode swab, yaitu dengan cara menggunakan 3 buah cotton roll. 1 buah cotton roll diletakkan di bawah lidah, 2 buah sisanya diletakkan pada vestibulum molar 2 atas. Setelah itu, dilakukan penimbangan berat saliva. C. Identifikasi Obat Dalam Sampel Biologis 1. Darah Darah merupakan sampel biologis yang paling umum digunakan dan mengandung berbagai komponen seluler seperti sel darah merah, sel darah putih, platelet,dan berbagai protein seperti albumin dan globulin. Pada umumnya bukan darah utuh (whole blood) tetapi plasma ataupun serum yang digunakan untuk penentuan kadar obat. Serum diperoleh dengan membiarkan darah untuk menggumpal dan supernatant yang dikumpulkan setelah sentrifugasi adalah serum. Sedangkan plasma diperoleh dengan penambahan antikoagulan pada darah yang diambil dan supernatant yang diperoleh setelah sentrifugasi merupakan plasma. Jadi, plasma dan serum dibedakan dari protein yang dikandungnya 2. urin
a) Pemeriksaan aseton, untuk mengetahui adanya benda-benda keton dalam urine. Prosedur kerja: Dipipet urine lebih 5 ml kedalam tabung reaksi. tambahkan 3 tetes larutan Natrium Nitroprusida 5%, 5 ml amonia 10%, dan 5 ml larutan ammonium sulfat jenuh. amati hasil perubahan setelah kuranglebih 10 menit. Hasil positif bila terjadi warna ungu. b) Metode Ehrlich, untuk menentukan adanya urobilinogen dalam urine Prosedur Kerja: dituangkan urin kurang lebih 5 ml kedalam tabung reaksi. tambahkan kurang lebih 1 ml reagen Ehrlich. kocok dan amati warnanya. hasil positif bila tampak warna kemerahan. c) Metode busa, untuk mengetahui adanya bilirubin dalam urine. Prosedur Kerja: Tuang kurang lebih 5 ml urin kedalam tabung reaksi. kocok kurang lebih 5 menit dengan kuat. amati busa yang terjadi. hasil positif terjadi bila busa berwarna kuning. d) Metode Fehling Urine yang di gunakan : pada pemeriksaan ini urine harus
jernih, segar, dan tidak mengandung kadar protein tinggi Alasan : jika urine lama bakteri akan berkembangbiak sehingga glukosa di rubah menjadi asam pirufat dan asam laktat, jika urine keruh akan mengacaukan hasil pemeriksaan, jika protein tinggi akan mereduksi. Hasil analisa urine Hijau Zat warna normal dalam jumlah besar: indikan (indoxilsulfat). Pengaruh obat-obat: methyleneblue, evan's blue. Indikasi penyakit: obstruksi (penyumbatan usus kecil). Kuning Zat
warna
normal
dalam
jumlah
besar:
urobilin,
urochrom.
Zat warna abnormal: bilirubin. Pengaruh obat-obat: santonin, riboflavin, atau pengaruh permen. Indikasi penyakit: tidak ada (normal).
Merah Zat warna normal dalam jumlah besar: uroerythrin. Zat warna abnormal: hemoglobin, porfirin, porfobilin. Pengaruh obat-obat: santonin, amidopyrin, congored, atau juga zat warna makanan. Indikasi penyakit: glomerulonevitis nefitit akut (penyakit ginjal), kanker kandung kencing. Cokelat Zat warna normal dalam jumlah besar: urobilin. Zat warna abnormal: bilirubin, hematin, porfobilin. Indikasi penyakit: hepatitis. Cokelat tua atau hitam Zat
warna
normal
dalam
jumlah
besar:
indikan.
Zat warna abnormal: darah tua, alkapton, melamin. Pengaruh obat-obat: derivat fenol, argyrol. Indikasi penyakit: sindroma nefrotika (penyakit ginjal). Serupa susu Zat warna normal dalam jumlah besar: fosfat, urat. Zat warna abnormal: pus, getah prostat, chylus, zat-zat lemak, bakteribakteri, protein yang membeku. Indikasi penyakit: infeksi saluran kencing, kebocoran kelenjar limfa. 3. feses a) Test benzidin adalah suatu test penyaring untuk darah samar (Yang tidak terlihat). Prinsip test ini adalah : Cara pemeriksaan reaksi Benzidin: Sepotong kertas saring digosokkan pada bercak yang dicurigai kemudian diteteskan 1 tetes H202 20% dan 1 tetes reagen Benzidin. Hasil: Hasil positif pada reaksi Benzidin adalah bila timbul warna biru gelap pada kertas saring . Dari refrensi, test ini dapat digunakan untuk mencari tahu apakah ada perdarahan di saluran pencernaan akibat mikroba, parasit cacing dll. Prosedur pemeriksaan, Penderita yang akan diperiksa, disarankan tidak mengkonsumsi protein hewani sehari sebelum pemeriksaan, karena bisa berikan hasil positif. Keesokan harinya, faeses penderita diperiksa dengan test benzidin. Bila
positif bisa diperkirakan terjadi proses perdarahan yang tidak terlihat. Hal ini bisa karena amoeba, parasit ascaris lumbricoides, cacing pita, taenea saginatta dan lainnya yang melukai usus. b) Leucomalachite hijau LMG warna uji ini reagen kimia telah ada sejak awal abad ke- dan mengalami interaksi kimia dengan darah menghasilkan warna hijau yang khas c) Kastle-Meyer warna uji Fenolftalein adalah reagen kimia aktif dalam tes khusus ini. Ketika darah hidrogen peroksida dan fenolftalein dicampur bersama-sama hasil warna gelap merah muda. Perubahan warna ini disebabkan oleh hemoglobin molekul yang mengandung oksigen dalam sel darah merah menyebabkan reaksi kimia antara hidrogen peroksida dan fenolftalein. d) Luminol – Luminol sangat sensitif dan dapat mengungkapkan darah yang hadir dalam jumlah menit. Luminol mampu mengekspos darah di tempattempat yang sudah dibersihkan berulang kali kecuali pelarut seperti pemutih yang digunakan dan bahkan pada dinding yang telah dilukis untuk menyembunyikan darah. Terlepas dari fakta bahwa ia dapat berdampak negatif terhadap beberapa proses pengujian serologi luminol tidak mempengaruhi mengetik darah berikutnya atau analisis DNA. 4. saliva Umumnya saliva digunakan untuk menunjukkan obat-obatan yang dikonaumsi, seperti ganja, kokain dan barbiturat. Dari saliva bisa didapatkan sampel dari DNA. Bahkan, meskipun saliva tidak mengandung sel DNA, tetapi sel-sel dari lapisan mulut dapat ditemukan di sampel saliva Para ilmuwan juga dapat menggunakan saliva untuk menunjukkan berapa banyak obat tertentu dalam tubuh. Para ilmuwan juga dapat menggunakan saliva sebagai alat untuk mendeteksi penyakit, karena jauh lebih mudah, dan dalam banyak kasus lebih aman. Tes HIV merupakan salah satu tes yang mana saliva digunakan sebagai sampel, meskipun tes darah masih merupakan cara standar untuk tes HIV. Biasanya Metode yang digunakan yaitu Metode spitting, dengan cara saliva dikumpulkan terlebih dahulu dalam
keadaan mulut tertutup, setelah itu diludahkan ke dalam tabung gelas. Untuk metode kromatografi, metode HPLC atau KCKT merupakan metode yang sangat populer untuk menetapkan kadar senyawa obat baik dalam bentuk sediaan maupun sampel hayati. Hal ini disebabkan karena KCKT merupakan metode yang memberikan sensitifitas dan spesifitas yang tinggi. contoh penggunaan KCKT untuk analisis beberapa sediaan farmasi dalam cairan biologis. a. allopurinol dalam plasma dan urine ( Brejtthaupt and Gdebel, 1981) Kolom : (SAS-Hypersyl, (300 mm x 4,1 mm, 5µm) Fase gerak : asam sitrat monohidrat 0,1 M- Dinatrium fosfat 0,2 Maquades (190:810:21 v/v/v) Kecepatan Alir: isokratik; 2,0 ml/ menit Detektor: UV 252 nm Kisaran Linier: 0,5-50 µg/mL (dalam ethanol) Volume Injeksi : 20 µL Penyiapan Sampel: prosedur Ekstraksi (darah) : sebanyak 1 ml sampel darah dimasukkan ke dalam tabung yang mengandung heparin dan disentifuge pada 8000 xg selama 5 menit. plasma diencerkan 1:2 dalam fase gerak, disaring dan injeksikan ke sistem KCKT. Sementara untuk urin, dilakukan pengenceran 1:20 dalam aquades, disaring dan diinjeksikan ke sistem KCKT. b. Amitriptilin dalam plas ma dan serum (theurillat and Thormann. 1998) Kolom : C18 (Nova-Pak C18 60 A 4µm, 150 mm x 4,6 mm i.d) Fase gerak : 500 ml buffer KH2PO4 5 Mm + 500 ml asetonitril dan 2 ml dietilamin; pH diatur 8,0 dengan asam folat Kecepatan Alir: 0,9 ml/menit Detektor: UV 242 nm Kisaran Linier: 20-40 ng/ml Standar Internal : Ekonazol Penyiapan Sampel: sebanyak 1 ml sampel serum atau plasma ditambah dengan 50 µL standar internal ekonazol 90 µg/ ml dalam metanol, 1 ml Natrium tetraborat 0,1 M (pH diatur 11 dengan NaOH) dan ditambah 6 ml heksan dalam tabung 10 ml. setelah digojog selama 10 menit, tabung ditutup dan disentrifuge pada kecepatan 300 rpm selama 10 menit, lapisan heksan dipindahkan ke tabung lain yang bersih dan diuapkan sampai kering pada suhu 400C dibawah aliran udara hangat. residu dilarutkan kembali dalam 200 µL metanol.
BAB III PENUTUP A. Kesimpulan berdasarkan pada pembahasan diatas dapat disimpulkan bahwa Sampel biologis adalah sampel yang diambil dari sebagian tubuh untuk tujuan analisis, misalnya darah, urine, feses, saliva atau bagian tubuh. yang dalam penyiapan sampelnya, diperlukan perlakuan/ treatment khusus. B. Saran sebaiknya sebelum menganalisis sampel biologis, semua alat harus dalam keadaan bersih dan steril untuk menhindari terjadinya kontaminasi antara sampel dengan zat-zat lain.
DAFTAR PUSTAKA Brejtthaupt and Gdebel. 1981. Determination Of Allopurinol And Oxipurinol In Biological Fluids By High Performance Liquid Chromatography. Jurnal Of Cromatography, 226: 237-242. Theurillat, R., and Thormann W. 1998. Monitoring of tricyclic antidepressant in human serum andplasma by HPLC: Cahracterization of a simple, laboratory developed method via external quality assessment. Jurnal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 18: 751-760. www.research.ucsf.edu/chr/guide/UCSFBiospecimenGuideMay05.pdf.(diakses pada hari kamis, 5 desember 2013 pukul 20.00 WITA) www.brmc-cares.com/Documents/Blood%20Collection%20Procedure.pdf (diakses pada hari kamis, 5 desember 2013 pukul 20.45 WITA)
.
www.fk.unair.ac.id/pdfiles/Spesimen_Managemen_2007.pdf .(diakses pada hari kamis, 5 desember 2013 pukul 21.00 WITA)
