Perlakuan Awal Sampel Biologis
a. Tujuan
Diharapkan mahasiswa mampu melakukan berbagai tehnik presipitasi protein sesuai s esuai dengan sampel biologis yang diperoleh dan obat yang akan diteliti.
b. Pend nda ahu hulu lua an
Berbag Berbagai ai sampel sampel biolog biologis is dapat dapat diambi diambill untuk untuk penent penentuan uan kadar kadar obat tubuh untuk penelitian farmakokonetika contoh : darah, urin, feses, saliva, jaringan tubuh, cairan spinal dan synovial. Metode pengambilan samp sampel el speci specime men n biol biolog ogis is pada pada umum umumny nyaa meli meliba batk tkan an meto metode de yang yang invasive kecuali untuk pengambilan sampel urin dan saliva. Sampel biologis yang paling umum diambil adalah darah yang walaupun tetap melibatkan metode yang invasive akan tetapi secara umum dapat ditoleransi dengan cukup baik oleh subyek penelitian. Darah Darah merupa merupakan kan sampel sampel biolog biologis is yang yang mengan mengandun dung g berbag berbagai ai komponen seluler seperti sel darah merah, sel darah putih, platelet,dan berbagai protein seperti albumin dan globulin. Pada umumnya bukan darah utuh (whole blood) tetapi plasma ataupun serum yang digunakan untuk penentuan kadar obat. Serum diperoleh dengan membiarkan darah untu untuk k
meng menggu gump mpal al
sent sentri rifu fuga gasi si
adal adalah ah
dan dan
supe supern rnat atan antt
serum serum..
Seda Sedang ngka kan n
yang yang
diku dikump mpul ulka kan n
plasm plasmaa
dipe dipero roleh leh
sete setela lah h deng dengan an
penambahan antikoagulan pada darah yang diambil dan supernatant yang diperoleh diperoleh setelah sentrifugasi sentrifugasi merupakan merupakan plasma. plasma. Jadi, plasma dan serum dibedakan dari protein yang dikandungnya.
Kandun Kandungan gan protein protein dalam dalam sampel sampel biolog biologis is yang yang akan akan dianal dianalisa isa meny menyeb ebab abka kan n dibu dibutu tuhk hkan anny nyaa suat suatu u taha tahap p perla perlaku kuan an awal awal dan/ dan/at atau au penyiapan sampel sebelum penentuan kadar obat dapat dilakukan yaitu dengan dengan mengedapka mengedapkan n protein protein pada sampel. Hal ini dilakukan ketika akan melakukan uji farmakokinetik berikutnya. Perlakuan ini harus dilakukan karena adanya protein dalam sampel akan mengganggu uji farmakokinetik yang dilakukan. Perlakuan ini juga dimaksudkan untuk mengisolasi atau memisahkan obat yang akan diteliti dari matriks sampel yang diperoleh. Prot Protei ein, n, lema lemak, k, gara garam m dan dan seny senyaw awaa endo endoge gen n dala dalam m samp sampel el akan akan mengganggu penentuan kadar obat yang bersangkutan dan selain itu dalam hal analisa menggunakan metode seperti HPLC adanya zat-zat tersebut dapat merusak kolom HPLC sehingga usia kolom menjadi lebih singkat. Prot Protei ein n
dapa dapatt
dien dienda dapk pkan an
kare karena na
memi memili liki ki
berb berbag agai ai
sifa sifatt
dian dianta taran ranya ya bersi bersifat fat sebag sebagai ai amfo amfote terr yakn yaknii memi memili liki ki 2 muat muatan an yang yang berlainan dalam 1 molekul, atau yang dikenal juga juga sebagai zwitter ion.
c. Prosedur
1. Seba Sebany nyak ak 250µL 250µL plasm plasmaa blan blanko ko di ipet ipet dan dan di masukk masukkan an kedalam kedalam tabung ekstraksi 2. Kemudi Kemudian an ditambah ditambahkan kan zat pengenda pengendap p protein protein yang tersedia tersedia dengan dengan perbandingan sebagai berikut:
Plasma 1:0,2 dengan 10% (b/v) trikloroasetat Seba Sebany nyak ak 250µL 250µL plasma plasma di tambah tambahka kan n 50µL 50µL trikloroasetat
Plasma 1:2 dengan Larutan jenuh (NH 4)2SO4
10% 10% (b/v (b/v))
Sebanyak Sebanyak 250µL 250µL plasma di tambahkan tambahkan 500µL 500µL Larutan Larutan jenuh (NH4)2SO4
Plasma 1:0,2 dengan 10% ZnSO 4-NaOH 0,5 N (1:1) Sebanyak 250µL plasma di tambahkan 500µL 10% ZnSO 4 NaOH 0,5 N (1:1)
Plasma 1:0,2 dengan Asetonitril Sebanyak 250µL plasma di tambahkan 500µL Asetonitril Ase tonitril
Plasma 1:0,2 dengan 10% (b/v) Metanol
Sebanyak 250µL plasma di tambahkan tambahkan 500µL Metanol
3. Setela Setelah h itu di Vort Vortex ex selam selamaa 1-2 menit menit 4. Dan disertifu disertifugasi gasi dengan dengan kecepat kecepatan an 3500-600 3500-6000 0 rpm selama 15 15 menit menit 5. Sela Selanj njut utny nyaa dila dilaku kuka kan n peng pengam amat atan an supe supern rnat atan antt dan dan enda endapa pan n yang yang dipe dipero role leh h dan dan diba diband ndin ingk gkan an hasil hasil yang yang dipe dipero roleh leh meng menggu guna naka kan n berbagai zat pengendap protein.
d. Data Data Pen Penga gama mata tan n
Semua Semua tabung tabung menunj menunjuka ukan n adany adanyaa endapa endapan n dengan dengan hasil hasil pengam pengamata atan n sebagai berikut: No
Zat Pengendap
jernih
Keruh
Protein yang di
1
tambahkan 10% (b/v)
2
trikloroasetat Larutan jenuh
Pemisahan
Pemisahan
baik
kurang baik
3
(NH4)2SO4 10% ZnSO 4-NaOH
4
0,5 N (1:1) Asetonitril
5
Metanol
e. Pembahasan
Peng Pengen enda dapa pan n
prot protein ein dila dilaku kuka kan n
deng dengan an
dena denatu tura rasi si
prot protei ein. n.
Denaturasi dapat dilakukan akibat adanya perubahan pH, temperature, dan penambahan senyawa kimia. Cara denaturasi protein yang umum digunakan adalah dengan penambahan precipitating agent. Protein dapat diendapkan karena memiliki berbagai sifat diantaranya bersifat sebagai amfoter yakni memiliki 2 muatan yang berlainan dalam 1 molekul, atau yang dikenal juga sebagai zwitter ion. Sifat ini membuat potein memiliki muatan yang berbeda pada pH yang berbeda pula. Akibatnya protein dapat larut pada rentang pH tertentu dimana protein bermuatan. Suatu saat di pH tertentu protein akan mencapai titik isoelektrik, yakni pH dimana jumlah total muatan protein sama dengan nol (muatan positif sebanding dengan muatan negatif), hal ini akan mempengaruhi kelarutan protein. Pada titik isoe isoele lekt ktri rik, k, kela kelaru ruta tan n prot protei ein n sanga sangatt renda rendah, h, sehin sehingg ggaa potei potein n dapa dapatt mengendap. Selain Selain itu, itu, protei protein n juga juga dapat dapat memben membentuk tuk ikatan ikatan dengan dengan logam logam dimana dimana beberap beberapaa asam amino amino dapat dapat terika terikatt pada pada satu logam logam sehingg sehinggaa molekulnya menjadi besar, beratnya juga menjadi besar sehingga potein mengendap. Selain itu terdapat juga beberapa sifa lain yang berhubungan deng dengan an
pres presip ipit itas asii
prot protei ein n
ini ini
yang yang dije dijela lask skan an
pada pada meka mekani nism smee
pengendapan oleh masing-masing reagen. Agen Agen presip presipitas itasii atau atau agen agen pengen pengendap dapan an yakni yakni ion negati negatiff dari dari TCA akan bergabung dengan protein yang sedang berada pada kondisi sebaga sebagaii kation kation (pH laruta larutan n dalam dalam kondis kondisii asam hingga hingga pH isoelek isoelektrik trik
protein) hingga membentuk garam protein. Beberapa garam yang diha dihasi silk lkan an terse tersebu butt tida tidak k laru larutt deng dengan an demi demiki kian an meto metode de ini ini dapa dapatt digu diguna naka kan n untu untuk k memi memisa sahk hkan an prot protei ein n dari dari laru laruta tan. n. Umum Umumny nyaa agen agen presipitasi akan melarut sedangkan garam protein akan terdekomposisi dengan dengan adanya adanya penambahan penambahan basa (membentuk (membentuk protein yang bermuatan bermuatan negatif atau anionic protein). Larutan (NH4)2SO4 merupakan garam dengan konsentrasi tinggi. Mekanisme (NH4)2SO4 sebagai anti presipitasi protein dikenal sebagai salting out, yakni penurunan kelarutan protein dengan adanya peningkatan konsentrasi garam. Hal ini terjadi karena interaksi antara air dengan gugus polar dari protein menurun. Kelarutan protein akan berkurang bila terdapat garam garam-ga -garam ram
anor anorga gani nik k
dalam dalam
kons konsen entr trasi asi
ting tinggi gi
meng mengak akib ibatk atkan an
pengendapan protein tersebut. Sifat ini terjadi karena kemampuan ion garam untuk terhidrasi dan terjadi kompetisi antara garam dengan molekul protein untuk mengikat air. Mekanisme ZnSO4 – NaOH sebagai agen presipitasi adalah NaOH akan memberikan suasana basa pada larutan dan mengakibatkan protein berada dalam keadaan ion negatif atau anion. Anion protein ini akan berikatan dengan ion positif yang berasal dari logam berat yakni Zn 2+ memb memben entu tuk k loga logam m prot protei ein n yang yang tida tidak k laru larut. t. Loga Logam m berat berat juga juga akan akan merusak struktur sekunder dan tersier dari protein. Ikatan dari ion logam bermuatan positif akan menurunkan kelarutan protein. Ion logam akan berkompetisi dengan proton-proton pada larutan untuk berikatan dengan asam amino. amino. Semaki Semakin n kuat kuat ikatan ikatan ion-ion ion-ion logam logam untuk untuk mengga mengganti ntikan kan ikatan oleh proton-proton akan menurunkan pH larutan. Kombinasi dari perubahan pI, penurunan pH (baik akibat ion logam maupun NaOH) akan menyebabkan protein mengendap Metano Metanoll dan Asetoni Asetonitri trill merupa merupakan kan pelaru pelarutt organi organik k yang yang dapat dapat mengen mengendap dapkan kan protei protein. n. Pengen Pengendap dapan an ini berkai berkaitan tan dengan dengan pI protei protein, n,
dimana semakin jauh dari titik isoelektrik maka kelarutan akan semakin meningkat dan semakin dekat dengan titik isoelektrik maka kelarutan akan semakin menurun. Penambahan larutan organik seperti metanol ataupun asetonitril pada larutan protein dalam air akan menurunkan Kd (Konstanta Dielektrik) pelarut/air yang meningkatkan tarikan antara molekul-molekul bermuatan dan memfasilitasi interaksi elektrostatik protein. Selain itu pelarut organik ini juga akan menggantikan menggantikan beberapa molekul air di sekitar daerah hidrofob dari permukaan protein yang berasosiasi dengan protein sehing sehingga ga menuru menurunka nkan n konsen konsentra trasi si air dalam dalam laruta larutan n dengan dengan demiki demikian an kela kelaru ruta tan n
prot protei ein n
akan akan
menu menuru run n
dan dan
memu memung ngki kink nkan an
terj terjad adin inya ya
pengendapan. Pada hasil percobaan diperoleh bahwa keefektifan pelarut organik asetonitril lebih besar dibandingkan dengan metanol.
f.
Kesimpulan
Dari Dari hasi hasill prak prakti tiku kum m dipe dipero role leh h bahw bahwaa semu semuaa agen agen presi presipi pita tasi si dapa dapatt mengendapkan protein pada sampel plasma. Dari tabel data pengamatan dapat dilihat bahwa yang paling efektif adalah TCA 10% dan ZnSO4 – NaOH. Sedangkan yang kurang efektif adalah Larutan jenuh (NH4)2SO4 dan pelarut organik. Keun Keuntu tung ngan an meto metoda da pres presip ipit itasi asi plas plasma ma prot protei ein n meng menggu guna naka kan n agen agen presipitsi adalah mudah dilakukan dan cepat namun kerugiannya yakni tidak dapat mengendapkan protein secara sempurna.
