Penanganan Awal Sampel
• Senyawa Aktif seperti Obat memiliki peran penting dalam tubuh kita, terutama saat penyembuhan penyakit • Sampel Biologis adalah sample yg diambil dari sebagian tubuh untuk tujuan analisis , misalnya blood/darah, urine, stomach contents ( including stomach washing and vomit/muntah, liver/hati, bile/empedu, brain, kidneys, meat, hairs, atau bagian tubuh!
•
Penyiapan sampel
•
Pemisahan senyawa dari cuplikan/sampel cuplikan/sampel biologis (urin, darah, feses)
•
Analisis senyawa aktif –
Spektrofotometri, kromatografi, RIA, dll
Analisis senyawa aktif dalam sampel biologi mempunyai berbagai tujuan" • #! $ntuk mengetahui/menetapkan adanya atau jumlah senyawa endogenik tertentu" kimia klinik untuk tujuan diagnosa! • %! $ntuk menetapkan adanya atau jumlah senyawa e&ogenik ( berasal dari luar tubuh"analisis metabolit, doping, keracunan, kesetaraan dan ketersediaan hayati suatu obat! • '! $ntuk memantau penggunaan obat baik dalam analisis farmakodinamik, pemantauan maupun kepatuhan pasien
Berbagai kendala perlu diperhatikan dalam analisis senyawa aktif dalam sampel biologi yaitu" • #! adar analit biasanya rendah, oleh karena itu perlu metode analisis yang sensitif! • %! )alam sampel biologi biasanya mengandung berbagai senyawa baik endogen maupun e&ogen yang dapat mempengaruhi hasil analisis! Oleh karena itu perlu analisis yang selektif atau dilengkapi dengan teknik pemisahan sebelum dilakukan analisis
cuplikan/sampel biologis Da r ah
-pl asma -s e r um Ur i n Sal i v a Dl l
SAMPEL DARAH
• Pengumpulan sampel darah (phlebotomy) • Ada ' cara" – tusukan vena (venipuncture (venipuncture – tusukan kulit (skinpuncture (skinpuncture – tusukan tusukan arteri atau nadi
• Ada dua cara dalam pengambilan darah vena, yaitu cara manual dan cara vakum! • *ara manual dilakukan dilakukan dengan menggunakan alat suntik (syring ( syring • sedangkan cara vakum dengan menggunakan tabung vakum vakum (vacutainer ! !
+ang +ang tidak boleh diambil darahnya • )arah edema • ematoma • )aerah dimana darah sedang ditransfusikan • )aerah bekas luka • )aerah intravena lines (tempat infus
-engambilan Sampel )arah • )iambil dari venipuncture (vena • Alat " syringe / vacutainer apparatus / kateter vena • .olume sesuai kebutuhan biasanya 0 # m1 • 2ula3mula bagian atas lengan diikat (torni4uet dioleskan antiseptik pengambilan sampel darah dengan hati3hati
)arah vena tepi biasanya diambil dari lekuk siku!
.ena punggung tangan juga dapat digunakan, tetapi kurang disukai!
-enanganan Sampel )arah !!! • pengumpulan, penanganan, penyimpanan, dan penandaan contoh sampel darah yang tepat akan meningkatkan hasil analisis yang dilakukan! • sampel harus dianalisis segera atau disimpan dengan teknik penyimpanan yang sesuai prosedur, semakin lama serum/plasma bersentuhan dengan eritrosit, semakin besar penurunan kadar obat
penanganan • Sampel darah jangan digojog karena bisa terjadi hemolisis • darah yang dianalisis dapat berupa " darah total, serum, plasma, fraksi bebas protein • jika obat yang akan dianalisis peka terhadap degradasi en5im, maka segera didinginkan atau degradasi en5imnya!
Secara umum dikenal 4 macam turunan sampel darah vena 3 Darah total !whole blood " 3 Serum 3 Plasma 3 #raksi $e$as protein
%omposisi darah &hole Blood Plasma
Serum #i$rinogen
Unsur-unsur cellular (cell)
Eritrosit Leukosit Platelet !trom$osit"
%omposisi darah )arah
terdiri daripada beberapa jenis korpuskula yang membentuk 67 bagian dari darah, angka ini dinyatakan dalam nilai hermatokrit atau volume sel darah merah yang dipadatkan yang berkisar antara 68 sampai 69! Bagian 7 yang lain berupa cairan kekuningan yang membentuk medium cairan darah yang disebut plasma darah serum darah atau plasma terdiri atas" Air"
:#,87 -rotein" ;,87 (Albumin, globulin, protrombin dan
Serum dan -lasma )arah • $ntuk mendapatkan serum " darah utuh didiamkan > %8 menit , disentrifuge kemudian diambil beningannya • $ntuk mendapatkan plasma " )arah utuh ? antikoagulan disentrifuge, diambil beningannya • -enggunaan plasma untuk analisis lebih sering dipakai karena jumlah obat lebih banyak (bebas @ terikat protein plasma
Per$edaan plasma dengan serum
Bila darah tidak di$eri antikoagulan ter'adilah pen'edalan( $ila diputarkan( maka $eningann)a adalah serum*
Analisis sampel plasma darah dikumpulkan dalam tabung yang berisi anti koagulan Anti koagulan heparin !garam +a" kalium oksalat !, mg % -.-/4 0 mL darah"
Plasma dan Serum Sampel plasma dan serum yang baru saja disentrifugasi akan disimpan, gunakan aturan berikut " ,* Pada suhu kamar( 1 'am( tidak ter'adi
peru2$ahan meta$olit atau en3im -* Pada suhu 4 .( -4 'am ( plasma dan serum dapat disimpan tertutup( tanpa peru$ahan 5* 6ntuk pen)impanan dalam waktu )ang lama( sampel dapat di$ekukan
Sampel Darah
Sampel $rine • $ntuk studi obat atau metabolitnya melalui ginjal • 2udah dilakukan @ banyak • lama dan selang waktu penampungan urin sesuai dengan karakteristik obat yang akan diuji • $mumnya tidak mengandung lipid dan protein, mudah diekstraksi menggunakan pelarut organik!
-engertian $rin • Air seni alias air kencing atau urin adalah cairan sisa yang dilepaskan oleh ginjal, yang kemudian dikeluarkan dari tubuh melalui proses urinasi (berkemih! kskresi urin diperlukan untuk membuang molekul3molekul sisa dalam darah yang disaring ginjal dan untuk menjaga kestabilan cairan tubuh!
• =injal merupakan organ yang penting dalam pengaturan kadar cairan tubuh, keseimbanganelektrolit dan pembuangan metabolit3metabolit sisa dan obat dari tubuh! • erusakan atau degenerasi fungsiginjal akan mempunyai pengaruh pada farmakokinetika obat! Beberapa penyebab yang umum dari kegagalan ginjal yaitu penyakit, cidera dan intoksikasi obat
cara pengambilan sampel urin •
$rin sewaktu" urin dikeluarkan pada waktu yang tidak ditentukan secara khusus! ujuan " $ntuk pemeriksaan urin " volume, makroskopi (warna, kejernihan urin dan urin lengkap!
•
$rin pagi" urin yang pertama3tama dikeluarkan di pagi hari setelah bangun tidur ujuan " $ntuk pemeriksaan sedimen, berat jenis, protein, dan test kehamilan berdasarkan *= (uman *horionic =onadotropin!
•
$rin postprandial C urin yang pertama kali dikeluarkan #, 0 ' jam sehabis makan! ujuan " Sampel ini berguna untuk pemeriksaan glukosuria!
•
$rin %6 jam" urin yang dikumpulkan selama %6 jam dalam botol besar yang bersih dan diberi bahan pengawet! ujuan " $ntuk menentukan kuantitas suatu 5at dalam urin!
-engujian umum • • • • • • • • • •
.olor .larit) /dor Speci7c gravit)* pH Protein* 8lucose* +itrites* %etones* Microscopic anal)sis !Red or white $lood cells( .asts( .r)stals( Bacteria( )east cells( or parasites*
warna urin • %uning" Dat warna normal dalam jumlah besar" urobilin, urochrom! Dat warna abnormal" bilirubin! -engaruh obat3obat" santonin, riboEavin, atau pengaruh permen! Fndikasi penyakit" tidak ada (normal! • Hi'au Dat warna normal dalam jumlah besar" indikan (indo&ilsulfat! -engaruh obat3obat" methyleneblue, evanGs blue! Fndikasi penyakit" obstruksi (penyumbatan usus kecil! • Merah Dat warna normal dalam jumlah besar" uroerythrin! Dat warna abnormal" hemoglobin, por
• .okelat Dat warna normal dalam jumlah besar" urobilin! Dat warna abnormal" bilirubin, hematin, porfobilin! Fndikasi penyakit" hepatitis! ,* .okelat tua atau hitam Dat warna normal dalam jumlah besar" indikan! Dat warna abnormal" darah tua, alkapton, melamin! -engaruh obat3obat" derivat fenol, argyrol! Fndikasi penyakit" sindroma nefrotika (penyakit ginjal! -* Serupa susu Dat warna normal dalam jumlah besar" fosfat, urat! Dat warna abnormal" pus, getah prostat, chylus, 5at35at lemak, bakteri3bakteri, protein yang membeku! Fndikasi penyakit" infeksi saluran kencing, kebocoran kelenjar limfa
-enanganan Sampel $rine wadah
penampung urine harus inert dan bebas dari bahan pengganggu analisi untuk menghindari kontaminasi mikroba urin dapat disimpan dalam lemari pendingin untuk analisi biasanya diperlukan #80# ml urine hasil penetapan obat dari urine memberi informasi yang penting tentang timbunan obat dalam tubuh
=ambaran yg teramati pd analisa obat dalam urin • H obat • ec ekskresi • ec eliminasi • 7 obat yang di metabolisme • 7 obat yang diekskresi
Sampel 6rin
Sampel Ieses • $ntuk studi metabolisme kesetimbangan massa, dan analisis obat dan metabolitnya yang terlihat di empedu • 2udah @ banyak • dalam analisis perlu diperhatikan homogenasi dari feses untuk dianalisis selanjutnya
#eses • ditampung menggunakan allumi nium • foil • K1io
*ontoh pengujian • Alergi atau peradangan di tubuh, untuk evaluasi terhadap alergi protein susu pada bayi! • Fnfeksi, yang disebabkan oleh beberapa jenis bakteri, virus, atau parasit yang menyerang sistem pencernaan! • 2asalah pencernaan seperti malabsorpsi tertentu seperti gula, lemak, atau bahan gi5i lainnya! • -erdarahan di dalam saluran gastrointestinal!
Sampel Saliva Orang
normal mampu memproduksi saliva lebih dari % 1 dalam sehari!
Sebagai
alternatif jika tidak memungkinkan mengambil darah
2engandung
obat dalam bentuk tidak terionisasi @ tidak terikat protein
ratmen
untuk analisis lebih mudah dan sederhana!
Pengambilan Sampel Salia
• )lm farmakokinetik klinik" monitoring dan pe netapan aturan dosis theo
)eproteinisasi
Bagian
darah )g tertinggal setelah komponen sel 9 protein plasma dihilangkan* #raksi ini mengandung $ahan )g tidak terikat pd protein plasma !elektrolit( glukosa( dll"* Pengukuran kadar o$at dalam :raksi $e$as protein $erguna untuk menentukan sen)awa $e$as dan )ang terikat pd protein* #raksi ini didapat dengan cara ultra7ltrasi( )g mem$iarkan ;air< dan molekul kecil menero$os lewat pen)aring( sedangkan molekul $esar !al$umin dan glo$ulin" tertahan*
Deproteinisasi
Mengapa Sampel Perlu Di2Deproteinisasi ===
Deproteinisasi
Metode )ang paling umum digunakan adalah Pengendapan protein se$agai garam )ang tidak larut
Pengaruh pH Protein
pH rendah ! asam kuat "
pH tinggi ! $asa kuat "
muatan positi: negati:
muatan
Pengaturan pH Sampel (protein
Sampel (protein
p larutan M
p larutan N
titik isoelektrik
titik isoelektrik
protein sbg kation
protein sbg anion
$ereaksi dng anion ttt* mem$entuk garam tak larut
bereaksi dng kation ttt! membentuk garam tak larut
Precipitating Agents Anionik >
pikrat
> > >
moli$dat tungstat sul:osalisila t meta:os:at perklorat trikloroaset at
> > >
ationik ?on2ion spt* 2 2 2 2 2 2 2
logam
seng merkuri %admiu m uranium $esi tem$ag a
$erat
!@n" !Hg" !.d" !6" !#e" !.u" !P$"
Titik Isoelektrik (TI) adalah daerah pH tertentu di mana protein tidak mempunyai selisih muatan atau jumlah muatan positif dan negatifnya sama, sehingga tidak bergerak ketika diletakkan dalam medan listrik. Pada pH isoelektrik (pI), suatu protein sangat mudah diendapkan karena pada saat itu muatan listriknya nol.
Protein akan mengalami perubahan muatan pd pH di atas di ba!ah titik isoelektriknya. Pada pH di ba!ah TI muatan positifnya lebih besar, sedangkan di atas TI muatan negatifnya lebih besar. Perubahan muatan menyebabkan menurunnya daya tarik menarik antara molekul protein shg molekul lebih mudah terurai. "emakin jauh perbedaannya dari TI maka kelarutan protein semakin meningkat.
)eproteinisasi dgn dehidrasi Bila sejumlah tertentu air dihilangkan dari protein
-rotein akan mengendap
SPFI$=ASF
)eproteinisasi
dengan cara dehidrasi
; Solvent ;
; Salting out <
! suhu rendah "
! protein pada titik isoelektrik "
Asetonitril Aseton 2etanol tanol
=aram ( a sulfat, a sul
(menarik mantel air yg melingkupi molekul% protein
-rotein mengendap
Salting out " kebanyakan protein tidak larut dalam larutan garam pekat @ mengendap atau didesak keluar dari larutan dalam keadaan tidak berubah! -rinsip ini digunakan utk memisahkan protein dari darah!
ara er s ca ran pe aru un u mempersiapkan sampel biologis untuk proses ekstraksi
Alat yang digunakan dalam bioanalisis • ersedia dan terjangkau • Sesuai untuk sampel maupun senyawa yang dianalisis • Selalu dikalibrasi dengan baik • erawat dan memiliki performa yang baik • ujuannya " – data yang dihasilkan dari alat reliabel – data tidak hilang atau menghasilkan data yang inaccurate
Sampel $iologis • Saliva perlu dipertimbangkan sebagai sampel yg ideal mengingat pengambilannya tidak invasiv dengan syarat apabila kadar obat dalam saliv a menggambarkan kadar obat dalam darah! • *airan cerebrospinal juga dapat digunakan sb g sampel, utamanya untuk obat yang bekerja di *S, mengingat kedekatan
Be$erapa permasalahan dengan sampel $iologis • -emisahan/isolasi analit" 2udah3tidaknya sampel dianalisis sebanding dengan Euiditasnya! • *airan cerebrospinal paling mudah ditangani, sedang darah utuh dan jaringan organ/paling sulit • $ntuk meningkatkan Euiditas, sampel hayati yg solid atau semi solid sering kali mengalami proses mekanis, misalnya homogenisasi dll
Storage :or Biological Sa mples
• $ntuk menghindari dekomposisi dan perub ahan kimia lain Bila obat/metabolit sensitif thd esterase" pendinginan pd QR* dan atau penambahan aI pada sample yg mengandung eritromosisin propionat • Apomor
• -lasma dan serum memerlukan sentrifugasi dalam proses perolehannya, .acutainer tube mengandung silikon yang memudahkan memisahkan serum/plasma dari corpus culi • abung palstic (pendorf biasanya mengand ung ester ftalat sbg plastici5er dan ester fosfat" dapat mengganggu analisis • Antikoagulant bila diperlukan" sitrat, heparin, )A dll (selama tidak terjadi interaksi denga n analit • -embekuan/fro5en segera setelah pengambil an sampel sering kali tidak dimungkinkanC pendinginan sementara dengan es dianggap cukup sebelum dipindah ke tempat penyimpanan dalam suhu beku
• ontrol temperatur penyimpanan" klora5epat aka n mengalami dekarboksilasi menjadi nordia5epam ya ng dipengaruhi oleh suhu dan p • adah penyimpanan" wadah gelas lebih disukai se bab kemungkinan berkurangngnya analit dan adanya plasticiser bila dg plastik • itrogliserin terabsorpsi oleh wadah plastik, ada b brp obat yg dapat terabsorpsi oleh wadah gelas" dpt diatasi dengan sililasi • -lastik punya kelebihan tidak mudah pecah, dalam pengangkutan lebih disukai • )alam banyak hal perlu veri
• konsentrasi obat adalah elemen penting untuk menentukan farmakokinetiak suatu individu maupun populasi konsentrasi obat diukur dalm sampel biologis seperti air susu, saliva,plasma dan urin! Sensitivitas, akurasi, presisi dari metode analisis harus ada untuk pengukuran secara langsung obat dalam matriks biologis! $ntuk itu metode penetapan kadar secara umum divalidasi sehingga informasi akurat didapatkan untuk dimonitoring farmkokinteika dan klinik!
