Nama
:
Desak Gede Dian Purnama Dewi
NIM
:
P07134014027
Semester
:
V (Lima)
Judul
:
TPHA (Treponema pallidum Hemagglutination Assay) Test
Hari, Tanggal :
Rabu, 14 September 2016
Tempat
Laboratorium Imunoserologi JAK Poltekkes Denpasar
:
I. TUJUAN Untuk mendeteksi antibodi terhadap Treponema pallidum dalam serum atau plasma pasien secara kualitatif dan semikuantitatif. II. METODE Hemagglutination Indirect test III.PRINSIP Berdasarkan rekasi aglutinasi antara sel darah merah burung angsa yang diselimuti dengan komponen Treponema pallidum (Strain Nichols) sebagai antigen terhadap serum atau plasma pasien sebagai antibodi. IV. DASAR TEORI Sifilis disebabkan oleh Treponema pallidum dari golongan spirochete anaerobik. Penyakit ini dapat ditularkan melalui hubungan seksual dan tidak bertahan hidup di luar inangnya. Treponema berbentuk spiral, langsing berukuran lebar kira – kira 0,2 µm, panjangnya antara 5-15 µm dan tidak dapat di kultur secara in vitro. (Bala, Manju, et al, 2012). T. pallidum dapat menembus melalui mukosa genital atau kulit yang terkelupas, kemudian memasuki kelenjar getah bening dan aliran darah selanjutnya akan menyebar ke berbagai organ (Zhan, Weihai, et al, 2012). Waktu inkubasi dari penyakit ini bervariasi dari 3 sampai 90 hari yang gejala awalnya ditandai dengan adanya lesi primer intrarektal, perianal, atau oral. Penyakit ini dibagi menjadi tiga tahap, antara lain tahap primer, sekunder dan tersier (K Gupta, Sunil, et al. 2012). Tes serologis sifilis merupakan pembantu diagnosis yang penting bagi sifilis terutama pada pasien asymptomatik. Tes serologis pada sifilis dapat dibagi menjadi dua, yaitu treponemal tes dan non treponemal tes. Uji non treponemal adalah uji yang
mendeteksi antibodi IgG dan IgM terhadap materi-materi lipid yang dilepaskan dari sel-sel rusak. Uji ini tidak langsung mendeteksi terhadap keberadaan Treponema pallidum itu sendiri, oleh karena itu uji ini termasuk ke dalam uji non spesifik. Uji ini akan menjadi negatif 1-4 minggu setelah pertama kali memberi hasil positif, seiring dengan pemberian obat dan penyembuhan lesi sehingga hanya digunakan untuk melihat keberhasilan pengobatan terhadap penyakit sifilis. Uji non-treponemal meliputi VDRL (Venereal disease research laboratory), USR (unheated serum reagin), RPR (rapid plasma reagin), dan TRUST (toluidine red unheated serum test) (Zhu, Lin, et al, 2014). Uji treponemal merupakan uji yang spesifik terhadap sifilis, karena mendeteksi langsung antibodi terhadap antigen Treponema pallidum (R. Castro, Arnold, et al, 2011. Biasanya uji ini digunakan untuk mengkonfirmasi uji non-treponemal (non spesifik) dan untuk menilai respon bakteri treponemal tersebut. Pada uji treponemal, sebagai antigen digunakan bakteri treponemal atau ekstraknya, misalnya Treponema Pallidum Hemagglutination Assay (TPHA), Treponema Pallidum Particle Assay (TPPA), dan Treponema Pallidum Immunobilization (TPI). Walaupun pengobatan secara dini diberikan, namun uji treponemal dapat memberi hasil positif seumur hidup (Zhu, Lin, et al, 2014). V. ALAT DAN BAHAN a. Alat 1. Mikropipet dan Yellow tip 2. Mikroplate V 3. Beaker glass 4. Timer b. Bahan 1. Serum atau plasma 2. Kontrol positif dan kontrol negatif 3. Kontrol cell 4. Test cell 5. Diluent VI. CARA KERJA Cara Kerja Kualitatif 1. Disiapkan alat, bahan dan reagen yang akan digunakan
2. Semua komponen pemeriksaan disuhu-kamarkan terlebih dahulu ± 30 menit 3. Sebelum itu, darah disentrifuge terlebih dahulu untuk mendapat serumya. Spesimen Diluent 1. Diambil 190 µl diluent pada tempat well. 2. Ditambahkan 10 µl sampel ke dalam tempat well tersebut. 3. Kemudian dihomogenkan. Tes : 1. Pipet 25 µl specimen diluent yang dibuat ke test well dan kontrol well. 2. Pipet 25 µl kontrol positif dan kontrol negative ke kontrol positif well dan kontrol negative well. 3. Tambahkan 75 µl test cell ke test well, kontrol positif dan kontrol negative dan 75 µl kontrol test ke kontrol well (Masing-masing campuran pada well dihomogenkan. Pengenceran sampel setelah ditambahkan test sel adalah 1:80) 4. Inkubasi 15-300C selama 45-30 menit. 5. Dibaca hasilnya, bandingkan dengan kontrol negative dan kontrol positif NB : Jika hasilnya positif, maka harus dilakukan dengan uji semikuantitatif untuk mengetahui titer TPHA pada sampel. Cara Kerja Semikuantitatif: 1. Disiapkan alat, bahan dan reagen yang akan digunakan 2. Semua komponen pemeriksaan disuhu-kamarkan terlebih dahulu ± 30 menit 3. Sebelum itu, darah disentrifuge terlebih dahulu untuk mendapat serumya Spesimen diluent: 1. Diambil 190 µl diluent pada tempat well. 2. Ditambahkan 10 µl sampel kedalam tempat well tersebut. 3. Kemudian dihomogenkan. Titrasi: 1. Disiapkan sumus mikroplate dan diberi label no 1-8. 2. Untuk sumur 1 dikosongkan, sedangkan sumur 2-8 ditambahkan 25 µl diluent. 3. Untuk sumur 1 dan 2 ditambahkan 25 µl sampel yang telah diencerkan dengan diluent 4. Pipet 25 µl campuran diluent spesiment ke sumur 3 lalu dihomogenkan.
5. Ambil 25 µl campuran dari sumur 3 ke sumur 4 dan seterusnya. Pada sumur 8 dibuang 25 µl campuran tersebut. Test: 1. Ditambahkan 75 µl test cell ke sumur 1-8. 2. Inkubasi 15-300C selama 45-30 menit. 3. Dibaca aglutinasi yang terbentuk dan tentukan titer yang masih
memberikan hasil positif pada pengenceran tertinggi. VII.
INTERPRETASI HASIL Kualitatif Reaksi positif ditunjukkan dengan hemaglutinasi sel Reaksi negatif ditunjukkan dengan adanya pengendapan sel pada dasar sumur seperti titik.
(Negatif)
(Positif)
Semikuantitatif Reaksi positif ditunjukkan dengan hemaglutinasi sel Reaksi negatif ditunjukkan dengan adanya pengendapan sel pada dasar
sumur seperti titik. Gambar hasil yang masih menunjukkan hasil positif :
Gambar hasil yang menunjukan hasil +/-
Berikut ini ilustrasi dari hasil semi kuantitatif:
-
+
+
+
+
+
+/-
-
Titer : pengenceran terakhir yang masih menunjukkan hemaglutinasi.
VIII. HASIL PENGAMATAN Identitas sampel Kode sampel : “TP”
(Mikroplate U)
(Sampel serum pasien)
(Kontrol +)
(Kontrol -)
(Kontrol sel)
(Test sel)
Hasil Uji Kualitatif
Hasil uji sampel “TP” adalah negatif yang ditandai dengan adanya pengendapan eritrosit berupa titi di dasar sumur.
Sampel
Kontrol sel
Kontrol
Hasil : (-)
negatif
Test sel Hasil : (-) Hasil Ujidiluents Semikuantitatif
Kontrol positif
Hasil positif berturut – turut dengan t titer Hasil negatif berturut – 1/80, 1/160, 1/320, dan turut dengan t titer 1/640. Dimana titer 1/1280, 1/2560, 1/5120, IX. PEMBAHASAN tertingginyapallidum adalah dari golongan spirochete dan 1/10240. Sifilis disebabkan oleh Treponema anaerobik. 1/640 Penyakit ini dapat ditularkan melalui hubungan seksual dan tidak bertahan hidup di luar inangnya. Treponema berbentuk spiral, langsing berukuran lebar kira – kira 0,2 µm, panjangnya antara 5-15 µm dan tidak dapat di kultur secara in vitro (Bala, Manju, et al, 2012). Tahap inkubasi dibagi menjadi tiga, tahap primer ditandai dengan timbulnya chancre di tempat inokulasi. Tahap sekunder ditandai dengan ruam polimorfik, limfadenopati dan manifestasi sistemik lainnya. Tahap tersier adalah tahap yang paling merusak dan ditandai dengan adanya gejala gangguan kardiovaskular dan neurologis (K Gupta, Sunil, et al. 2012). TPHA adalah uji treponemal yang berfungsi untuk mendeteksi adanya antibodi spesifik Triponema pallidum dalam serum atau plasma pasien guna membantu
menegakkan diagnosis laboratorium terhadap indikasi penyakit sifilis. Antibodi Treponemal dapat terdeteksi seumur hidup sedangkan antibodi non treponemal akan hilang setelah masa pengobatan. Sedangkan kelemahan dari uji TPHA ini adalah dapat menimbulkan reaksi negatif palsu apabila spesimen yang diperiksa dalam fase sekunder (Bala, Manju, et al, 2012). Metode yang digunakan dalam pemeriksaan sifilis yaitu metode hemaglutinasi tidak langsung (Insert kit, 2014). Prinsip dari pemeriksaan TPHA adalah rekasi aglutinasi antara sel darah merah burung angsa yang diselimuti dengan komponen Treponema pallidum (Strain Nichols) sebagai antigen terhadap serum atau plasma pasien sebagai antibodi (Insert kit, 2014). Pada praktikum kali ini uji TPHA dilakukan secara kualitatif dan semikuantitatif. Uji kualitatif dilakukan dengan cara menambahkan sampel yang telah diencerkan ke dalam sumur sebanyak 25 mikron dan tes sel sebanyak 75 mikron, kedua campuran tersebut dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu selama 45 – 60 menit agar antigen dan antibodi dapat berikatan secara optimal. Pada saat proses inkubasi berlangsung, sampel diletakkan pada tempat yang datar dan terhindar dari getaran. Uji kualitatif bertujuan untuk mendeteksi ada atau tidaknya antibodi spesifik terhadap Treponema pallidum, hasil positif ditandai dengan terbentuknya hemaglutinasi pada sumur dan jika negatif ditandai dengan adanya pengendapan sel pada dasar sumur seperti titik. Hasil yang didapat dibandingkan dengan kontrol positif dan negatif dimana kontrol negatif yang sudah ditambahkan tes sel harus memberikan hasil negatif sedangkan kontrol positif yang sudah ditambahkan test sel harus memberikan hasil positif dan pada uji semikuantitatif harus menunjukkan titer 640 – 2560 (Insert kit, 2014). Metode semikuantitatif dilakukan dengan pengenceran berseri pada sumur dan menggunakan 8 sumur, dimana sumur 2 – 8 diisi 25 mikron diluents, lalu ditambahkan 25 mikron sampel yang telah diencerkan pada sumur 1 dan 2, melalui sumur 2 diambil 25 mikron sampel dan dimasukkan ke dalam sumur 3, kemudian dilakukan pengenceran bersehi hingga mencapai sumur ke-8. Pada sumur 8 sampel diambil 25 mikron untuk dibuang, setelah itu lakukan proses inkubasi seperti pada metode kualitatif (Insert kit, 2014). Uji semikuantitatif bertujuan untuk melihat kadar atau titer antibodi yang terbentuk di dalam tubuh.
Pada praktikum ini, pemeriksaan TPHA menggunakan reagen kit dengan merk healthcare. Dimana dalam satu kit reagen berisi tes sel yang mengandung awetan eritrosit ayam yang dilapisi dengan antigen Triponema pallidum, kontrol sel mengandung awetan eritrosit ayam yang tidak dilapisi antigen Triponema pallidum, diluents yang mengandung larutan garam dengan penyerap absorban, kontrol positif mengandung serum manusia dengan titer 1280, dan kontrol negatif mengandung serum manusia dengan titer <80. Reagen TPHA disimpan pada suhu 2 – 8oC dalam posisi tegak lurus. Sebelum digunakan letakkan reagen pada suhu ruang dan perhatikan tanggal kadaluarsa reagen karena penggunaan reagen yang kadaluarsa akan memberikan interpretasi hasil yang salah (Insert kit, 2014). Sensitivitas dari reagen ini adalah 99,5% sedangkan spesifisitasnya adalah 100%. Menurut Miguel Marino (2013), sensitivitas adalah proporsi orang yang benar sakit dalam populasi yang juga diidentifikasi sebagai orang sakit oleh tes penapisan sedangkan spesifisitas adalah proporsi orang yang benar – benar tidak sakit dan tidak sakit pula saat diidentifikasi dengan tes penapisan. Jadi, reagen TPHA merk Healthcare mampu mendeteksi orang yang benar-benar terinfeksi sifilis sebesar 99,5%, sedangkan kemampuan reagen ini dalam mendeteksi orang yang benar – benar tidak terinfeksi adalah 100%. Reagen ini dapat mendeteksi antibodi anti-treponemal hingga batas terendah yaitu 0,05 IU/ml yang telah diuji oleh First International Standard serum (NIBSC, London,UK). Sedangkan sampel yang digunakan dalam pemeriksaan TPHA dapat berupa serum ataupun plasma harus terbebas dari bakteri kontaminan. Sampel dapat disimpan pada suhu 2 – 8o
C apabila tidak segera diperiksa dan dapat disimpan
lebih lama lagi pada suhu -20oC (Insert kit, 2014). Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan, hasil uji TPHA pada serum pasien dengan kode “TP” menunjukkan hasil negatif pada uji kualitatif ditandai dengan adanya pengendapan eritrosit pada dasar sumur berupa titik setelah melalui proses inkubasi pada suhu ruang selama 60 menit. Hal tersebut menunjukkan bahwa di dalam sampel serum pasien tidak terdapat antibodi spesifik terhadap Treponema pallidum oleh karena itu sampel tersebut tidak dilakukan uji secara semikuantitatif. Namun pada praktikum kali ini uji semikuantitatif dilakukan dengan menggunakan
kontrol positif sebagai sampel yang bertujuan untuk melihat titer yang terbentuk. Hasil titer yang didapat pada uji semikuantitatif menggunakan kontrol positif adalah 1 : 640. Menurut Narinder Kaur Naidu (2012), selain dengan menggunakan uji TPHA untuk mendeteksi antibodi spesifik, uji lain yang dapat digunakan adalah ELISA. Keuntungan dari ELISA adalah kemampuan untuk memproses sejumlah besar sampel dan kemampuan untuk dibaca pada spektrofotometer. X. SIMPULAN Berdasarkan hasil praktikum pemeriksaan TPHA pada serum pasien dengan kode “TP” diperoleh hasil negatif. Hal tersebut mengindikasikan bahwa dalam sampel serum pasien tidak terdapat antibodi spesifik terhadap Treponema pallidum sebagai penanda penyakit sifilis.
DAFTAR PUSTAKA Bala, Manju, et al. 2012. Evaluation of the usefulness of Treponema pallidum hemagglutination test in the diagnosis of syphilis in weak reactive Venereal Disease Research Laboratory sera. [online]. Tersedia : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3505284/. [diakses : 19 September 2016, 18.05 wita] Insert Kit. 2014. TPHA Test Kit. United Kingdom : Healthcare Ltd K Gupta, Sunil, et al. 2012. Syphilis D’ Emblee. [online]. Tersedia : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3401849/. [diakses : 19 September 2016, 19.42 wita] Marino, Miguel, et al. 2013. Measuring Sleep: Accuracy, Sensitivity, and Specificity of Wrist Actigraphy Compared to Polysomnography. [online]. Tersedia : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3792393/. [diakses : 19 September 2016, 20.36 wita] Naidu, Narinder Kaur, et al. 2012. Comparative study of Treponemal and nonTreponemal test for screening of blood donated at a blood center. [online]. Tersedia : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3353627/. [diakses : 19 September 2016, 20.05 wita] Zhan, Weihai, et al. 2012. Concurrent Sexual Partnerships and Sexually Transmitted Diseases in Russia. [online]. Tersedia : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3151331/. [diakses : 19 September 2016, 15.08 wita] Zhu, Lin, et al. 2014. Comparison of the Cerebrospinal Fluid (CSF) Toluidine Red Unheated Serum Test and the CSF Rapid Plasma Reagin Test with the
CSF Venereal Disease Research Laboratory Test for Diagnosis of Neurosyphilis among HIV-Negative Syphilis Patients in China. [online]. Tersedia : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3957747/. [diakses : 19 September 2016, 16.07 wita]
