Nama
: Thalia Anggrea Noor
NIM
: P07134014018
Semester
:V
PEMERIKSAAN TPHA (Treponema pallidum Hemagglutination Assay) Hari / Tanggal: Rabu/ 14 September 2016 Tempat: Laboratorium Bakteriologi Jurusan Analis Kesehatan Poltekkes Denpasar I.
TUJUAN Untuk mendeteksi antibodi terhadap treponema pallidum dalam serum atau plasma secara kualitatif dan semi-kuantitatif.
II. III.
METODE Metode yang digunakan dalam pemeriksaan TPHA adalah Indirek Hemaglutinasi. PRINSIP Berdasarkan reaksi aglutinasi antara reagen TPHA yang mengandung sel darah merah unggas yang dilapisi dengan komponen Treponema pallidum sebagai antigen dengan serum atau pasma pasien sebagai antibodi spesifik terhadap treponema pallidum.
IV.
DASAR TEORI Sifilis adalah infeksi menular seksual yang disebabkan oleh bakteri spirochete Treponema pallidum subsp. pallidum (T. pallidum). Meskipun sebagian besar kasus sifilis terjadi di Amerika Latin, Afrika sub-Sahara, dan Asia Tenggara, perkembangan sifilis telah diamati selama dekade terakhir di AS, Kanada, Australia, China, dan beberapa negara Eropa. Selain itu, bukti bahwa penularan bawaan dari penyakit ini merupakan penyebab utama dari lahir letal dan kematian perinatal di daerah berkembang, dan bahwa pasien dengan sifilis berada pada peningkatan risiko untuk transmisi dan akuisisi HIV, juga berkontribusi untuk membuat sifilis masalah kesehatan global yang penting. (Wujian Ke dkk,2015) Treponema pallidum sangat invasif dan mengalami penyebaran luas melalui sistem peredaran darah dan merupakan penyakit menular seksual kronis yang menginfeksi 12 juta orang per tahun. Sejumlah penelitian telah menunjukkan bahwa T. pallidum mampu
masuk dengan cepat ke sistem peredaran darah setelah infeksi, dengan penyebaran selanjutnya ke daerah host yang jauh. Sifat yang sangat invasif patogen selanjutnya ditekankan oleh manifestasi klinis yang beragam dimana dapat terjadi pada infeksi sifilis yang tidak diobati, termasuk ruam kulit, meningitis, penyakit mata, dan jantung dan komplikasi neurologis, dan oleh kenyataan bahwa T. pallidum dapat menyebabkan kerusakan tulang di sifilis tahap bawaan dan tersier. Selain itu, T. pallidum merupakan salah satu dari hanya beberapa patogen yang dapat melintasi plasenta dan darah-otak hambatan. (Simon Houston dkk,2012) Infeksi T. pallidum biasanya bermanifestasi sebagai chancre menyakitkan pada tempat infeksi sekitar 3 minggu setelah paparan patogen. Beberapa studi telah menunjukkan bahwa patogen ini mampu menyerang hambatan jaringan dan menyebabkan penyebarluasan cepat melalui sistem peredaran darah. Sifat yang sangat invasif T. pallidum lebih lanjut dapat dilihat dari kemampuannya untuk melintasi penghalang plasenta menyebabkan sifilis kongenital dan penghalang darah-otak untuk menyerang systemand saraf pusat dengan manifestasi klinis yang beragam dan luas terkait dengan sifilis sekunder dan tersier. (Simon Houston dkk,2015) Pada tahap primer dan sekunder sifilis, gejala, seperti luka menyakitkan, kelelahan, dan sakit kepala, mungkin terlewatkan atau keliru untuk kondisi lain. Jika terdeteksi pada tahap primer atau sekunder, sifilis kemudian memasuki periode laten tanpa gejala yang panjang; Oleh karena itu, banyak orang terus tidak menyadari bahwa mereka terinfeksi dan bahwa mereka dapat menularkan infeksi melalui hubungan seksual atau selama kehamilan. Jika tidak diobati, infeksi pada akhirnya berkembang ke tahap tersier gejala yang lebih serius, yang dapat menyebabkan komplikasi yang signifikan, seperti keterlibatan otak dan pembuluh darah (misalnya, aneurisma aorta, paresis umum, dan tabes dorsalis). Namun, sifilis dapat berhasil diobati, terutama jika didiagnosis pada tahap awal. Diagnosis Oleh karena itu penting sehingga pengobatan yang dapat dimulai lebih awal untuk meningkatkan hasil dan mencegah penularan.(Martin Enders dkk,2015) Biasanya dalam waktu 3 bulan dari infeksi, gejala sifilis sekunder muncul. Manifestasi klinis yang paling umum adalah ruam makulopapular disebarluaskan. Gejala tambahan mungkin termasuk malaise, penurunan berat badan, nyeri otot, limfadenopati generalisata, alopecia tambal sulam, meningitis, radang mata, patch lendir (peradangan
lokal dari jaringan mukosa di rongga mulut dan alat kelamin), hepatitis, dan dismotilitas lambung, mencerminkan T. pallidum invasi dan mengakibatkan infiltrasi sel kekebalan jaringan tersebut. (Emily L Ho dkk,2011) Dalam pemeriksaan Treponema pallidum terdapat dua katagori yaitu deteksi langsung dari treponema dalam spesimen biologi (termasuk tes molekuler) dan tes serologi. tes serologi untuk sifilis dan treponematoses endemic dibagi menjadi dua yaitu tes nontreponemal dan treponema, berdasarkan antigen yang diakui selama reaksi. penggunaan tes nontreponemal (untuk tujuan screening) perlu dikombinasikan dengan tes treponemal untuk mengkonfirmasi hasil awal. tes nontreponemal menggunakan campuran antigen lipid untuk mendeteksi antibodi hadir dalam sera pasien dengan infeksi treponema. Tes nontreponemal paling umum termasuk cepat reagin plasma (RPR) dan, Veneral Desease Reaserch Laboratory (VDRL) tes yang semakin menurun. Yang mana kedua tes berupa flokulasi yang hasilnya dibaca dengan bantuan mikroskop atau dengan mata telanjang. Tes treponemal didasarkan pada reaktivitas antibodi terhadap asli atau rekombinan T. pallidum subsp. antigen pallidum dan biasanya digunakan di Amerika Serikat dan di banyak negara lain untuk mengkonfirmasi tes nontreponemal reaktif. Tes treponemal tradisional termasuk tes imunofluoresensi tidak langsung seperti tes Treponemal Fluoresecnt T pallidum Antibody-Absorption (FTAABS), tes aglutinasi (misalnya, T. pallidum hemagglutination assay [TPHA] dan T. pallidum partikel aglutinasi [TPPA]), Western and dot blot assays with native and recombinant antigens and selain itu juga ada, automated enzyme immunoassays (EIAs), chemiluminescent immunoassays (CIAs), and multiplex flow immunoassay (MFI) (Lorenzo Giacani dkk,2014) V.
ALAT DAN BAHAN a. Alat 1. Mikropipet ( 25µl, 75 µl, 200 µl, 10 µl) 2. Yellow tip atau blue tip 3. Microplate V 4. Timer b. Bahan 1. Reagen test Cell TPHA 2. Reagent Control Cell TPHA 3. Reagen kontrol Positif (+)
4. Reagen kontrol Negatif (-) 5. Reagen Diluent c. Sampel 1. Serum atau Plasma VI.
CARA KERJA - Uji Kualitatif 1. Disiapkan alat dan bahan 2. Sampel dan reagen diletakkan pada suhu ruang 3. Dihomogenkan reagen yang akan digunakan 4. Buat spesimen diluent, dengan cara : - Dipipet 190 µl diluent, diletakkan pada sumur - Ditambahkan dengan 10 µl spesimen - Dihomogenkan 5. Tahap Test - Disiapkan 4 buah sumur, diberi label (test well, control well, kontrol
-
-
positif, kontrol negatif) Dipipet 25 µl spesimen diluent, dimasukkan kedalam test well dan control
-
well Dipipet 25 µl kontrol positif, dimasukkan kedalam sumur yang telah
-
diberi label (+) Dipipet 25 µl kontrol negatif, dimasukkan kedalam sumur yang telah
-
diberi label (-) Ditambahkan 75 µl test cell pada test well, kontrol positif dan kontrol
-
negatif Ditambahan pada control well 75 µl control cell Diinkubasi campuran tersebut pada suhu 15-30°C selama 45-60 menit Dibaca aglutinasi yang terjadi. Dicatat hasil yang didapatkan
Uji Semi-Kuantitatif 1. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan 2. Dikeluarkan sampel dan reagen yang akan digunakan pada suhu ruang 3. Dihomogenkan reagen yang akan digunakan 4. Buat spesimen diluent, dengan cara: - Dipipet 190 µl diluent, diletakkan pada sumur - Ditambahkan dengan 10 µl spesimen - Dihomogenkan 5. Tahap Titrasi - Disiapkan 8 buah sumur, diberi label 1-8 - Dimasukkan 25 µl diluet kedalam sumur 2 sampai 8 - Dimasukkan 25 µl spesimen diluent kedalam tabung 1 dan 2
-
Dilakukan pengenceran dengan cara memipet 25 µl campuran pada sumur 2 yang sudah dihomogenkan dan dimasukkan ke sumur 3, dihomogenkan, dari sumur 3 dipipet 25 µl dipindahkan ke sumur 4, begitu seterusnya
hingga sumur 8, lalu dibuang 25 µl campuran pada sumur 8 6. Tahap Test - Ditambahkan pada sumur 1 sampai dengan 8 75 µl test cell, VII.
dihomogenkan Diinkubasi pada suhu 15-30°C selama 45-60 menit. Dibaca aglutinasi yang terbentuk dan tentukan titernya.
INTERPRETASI HASIL - Uji Kualitatif Positif : terjadi hemaglutinasi yang ditandai dengan adanya bulatan Negatif
berwarna merah di permukaan sumur. : tidak terjadi hemaglutinasi, yang ditandai dengan terlihatnya titik
berwarna merah ditengah permukaan sumur. Jika pada uji kualitatif memberiksan hasil yang positif (+) maka harus dilanjutkan pemeriksaan dengan uji Semi-kuantitatif untuk mengetahui titer -
antibodi T.pallidum pada spesimen. Uji Semi-Kuantitatif Dilihat titer atau pengenceran tertinggi yang masih menunjukkan hasil positif. SUMUR TITER
VIII.
1 1:80
2 1:160
3 1:320
4 1:640
5 1:1280
6 1:2560
7 1:5120
8 1:10240
HASIL PENGAMATAN a. Identitas Sampel Kode Sampel : TP Nama : Mr.X Jenis Kelamin : Umur :b. Hasil Pemeriksaan
:Negatif (-) antibodi T.pallidum Tidak terbentuk hemaglutinasi, namun terbentuk titik berwarna merah dibagian tengah sumur.
c. Gambar Hasil Pemeriksaan: - Sampel
Sampel serum probandus
-
Reagen
Control cell
Tes cell
Control negatif
Diluent
Control positif
-
Hasil Pengamatan Campuran + test cell
Campuran: Diluents + spesimen
Campuran + control cell
Control positif Control negatif
Diketahui hasil pada mikroplate, yaitu : - Pada test well : Negatif (-) Antibodi T. pallidum - Pada control well : negatif (-) Antibodi T.pallidum - Control (+): Positif (+) Antibodi T.pallidum - Control (-): Negatif (-) Antibodi T.pallidum IX.
PEMBAHASAN Sifilis adalah multistage, seksual penyakit menular yang disebabkan oleh obligat patogen manusia Treponema pallidum subsp. pallidum dan ditandai dengan manifestasi klinis protean. Berikut proses inokulasi yang terjadi, biasanya di daerah genital, spirochetes meniru lokal, merangsang respon inflamasi yang menghasilkan khas yaitu chancre yang menyakitkan pada sifilis primer. Dalam beberapa minggu selama
menyembuhkan chancre akan menunjukkan clearance lokal T. pallidum, dimana spirochetes telah disebarkan ke berbagai jaringan dan organ. Sifilis sekunder, yang dihasilkan dari penyebaran hematogen dari organisme, biasanya terjadi enam sampai delapan minggu setelah infeksi. Tahap ini penyakit yang paling umum melibatkan kulit, selaput lendir dan kelenjar getah bening namun dapat mempengaruhi hampir setiap organ termasuk sistem saraf pusat. T. pallidum diduga dibersihkan oleh makrofag melalui opsonophagocytosis antibodi-mediated. Infeksi yang terkandung tetapi sering tidak dihilangkan. Spirochetes memiliki kapasitas untuk bertahan selama bertahun-tahun di situs penyebaran tanpa menyebabkan gejala. Untuk alasan yang tidak jelas, sekitar sepertiga dari pasien dengan infeksi laten mengembangkan salah satu bentuk yg timbul penyakit, yang dikenal sebagai sifilis tersier. (Adam C Silver dkk, 2013) Untuk mengidentifkasi bakteri patogen spirochaeta Treponema pallidum, pada praktikum
ini
menggunakan
pemeriksaan
TPHA
atau
Treponema
pallidum
Hemagglutination Assay sebagai penguji adanya antibodi yang terdapat dalam spesimen. Tes TPHA merupakan uji treponemal untuk konfirmasi serologis sifilis, sesuai dengan algoritma tradisional. Pemahaman sederhana dari hasil serologi tidak mendefinisikan kondisi fisik pasien. Setiap kombinasi yang mungkin dihasilkan dengan tes ini memiliki interpretasi yang berbeda dalam kaitannya dengan konteks individu masing-masing pasien. (Islay Rodriguez dkk,2015) Meskipun serologi tetap metode diagnostik yang paling umum untuk infeksi treponema, tak satu pun dari tes serologi yang tersedia mampu membedakan antara agen penyakit ini. Kemampuan saat ini terbatas untuk metode molekuler yang menargetkan tanda tangan genetik yang dianggap spesifik untuk setiap subspesies. Kegunaan praktis dari sebagian besar tes diagnostik lebih rumit oleh kurangnya layanan laboratorium canggih di daerah di mana treponematoses endemik yang paling umum. (Lorenzo Giacani dkk,2014) Dalam pemeriksaan TPHA baik spesimen serum maupun plasma dapat digunakan, karena tidak akan mempengaruhi hasil dari pemeriksaannya dan spesimen yang digunakan pada pemeriksaan kali ini berupa serum. Spesimen yang sudah selesai digunakan dapat disimpan pada suhu 2-8°C yang dapat bertahan selama 7 hari (1 minggu) atau -20°C yang dapat bertahan dalam jangka waktu yang lebih lama.
Pada pemeriksaan ini, menggunakan 5 jenis reagen Merk Lab 21 HealthCare, United Kingdom, yang mana setiap reagen memiliki fungsi dan komposisi yang berbeda. Reagen ini terdiri dari control cell, test cell, control positif (+), control negatif (-), serta diluent. Berdasarkan komposisinya, diketahui dari kit yang digunakan bahwa test cell mengandung awetan eritrosit ayam yang dilapisi dengan antigen Treponema pallidum, control cell mengandung awetan eritrosit ayam yang tidak dilapisi, diluent mengandung pencair larutan garam yang mengandung penyerap absorbant, kontrol positif (+) mengandung serum manusia dengan titer 1: 1280, serta kontrol negatif (-) yang mengandung serum manusia dengan titer <80. Pada bahan kontrol yang berasal dari serum manusia merupakan serum yang telah diuji ditingkat donor dan menunjukkan negatif untuk hepatitis B dan C, serta HIV 1 dan 2. Namun, bagaimanapun reagen kontrol harus diperlakukan seolah-olah mampu menularkan penyakit. Sebelum melakukan pemeriksaan perlu diperhatikan tanggal kadaluarsa dari kit yang digunakan, serta mengeluarkan reagen pada suhu ruang. Reagen yang sudah disuhu ruangkan harus dihomogenkan sebelum digunakan untuk mengoptimalkan fungsi dari reagen tersebut. Saat mencampurkan reagen dengan sampel maupun sampel yang sudah diencerkan pastikan untuk menukarkan yellow tip untuk mengurangi kemungkinan terjadinya kesalahan hasil pemeriksaan akibat terkontaminasinya campuran satu dengan yang lainnya. Reagen yang telah selesai digunakan harus disimpan pada refrigerator pada suhu 2-8°C dan dipastikan reagen tersimpan pada keadaan tegak lurus serta tidak dibekukan. Hasil pemeriksaan TPHA positif ditandai dengan terjadinya hemaglutinasi pada mikroplate dengan bentuk bulatan seperti pasir berwarna merah pada permukaan sumur, sedangkan hasil negatif ditandai dengan terdapatnya titik berwarna merah pada bagian tengah permukaan sumur. Perlu diperhatikan bahwa sumur control serta test tidak boleh memberikan hasil yang positif, namun bila hemaglutinasi terjadi pada keduanya dalam pemeriksaan maka perlu dilakukan pembuatan spesimen diluent ulang dengan cara menginkubasi spesiment diluent sebelumnya selama 30 menit lalu disentrifuge dengan kecepatan 1500 g selama 3 menit, dan campuran ini yang akan digunakan untuk uji kualitatif.
Kit ini memiliki sensitifitas 99,5% serta spesifisitas 100% yang menandakan alat ini memiliki kemampuan untuk mengidentifikasi secara tepat orang yang benar-benar sakit (sensitifitas) sebesar 99,5%, dan kemampuan untuk mengidentifikasi orang yang benarbenar tidak sakit (spesifisitas) sebesar 100%. Sehingga sangat baik untuk digunakan sebagai uji screening untuk identifikasi adanya antibodi Treponema pallidum pada spesimen manusia. Dari pemeriksaan, diketahui bahwa sampel dengan kode TP negatif antibodi Treponema pallidum, karena pada uji kualitatif menunjukkan hasil negatif berupa titik berwarna merah di bagian tengah permukaan sumur pada campuran spesimen diluent dengan control cell dan test cell. Sedangkan pada campuran test cell dengan kontrol positif (+) dan kontrol negatif (-) memberikan hasil yang sesuai yakni pada kontrol positif (+) memberikan hasil yang positif antibodi Treponema pallidum sedangkan pada kontrol negatif memberikan hasil yang negatif antibodi Treponema pallidum. Reagen kontrol ini berfungsi untuk melihat apakah reagen yang digunakan masih dalam kondisi yang baik sehingga akan memberikan hasil yang lebih akurat serta mengurangi kemungkinan terjadinya kesalahan hasil pemeriksaan. Pemeriksaan tidak dilanjutkan ke uji semi-kuantitatif dikarenakan hasil negatif pada uji kualitatif. X.
SIMPULAN TPHA atau Treponema pallidum Hemagglutination Assay merupakan suatu uji serologi yang digunakan untuk mengidentifikasi adanya antibosi T.pallidum pada spesimen manusia. Berdasarkan hasil pemeriksaan TPHA (Treponema pallidum Hemagglutination Assay) pada sampel serum TP didapatkan hasil negatif antibodi Treponema pallidum.
XI.
DAFTAR PUSTAKA Enders,Martin.2015. Performance Evaluation of the Elecsys Syphilis Assay for the Detection
of
Total
Antibodies
to
Treponema
pallidum.
[online].tersedia:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4278932/. [diakses:16 September 2016; 18:22] Giacani,Lorenzo dkk.2014. The Endemic
Treponematoses.[online].tersedia:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3910905/.[diakses:16 September 2016; 18:22]
Houson, Simon dkk.2015. Conservation of the Host-Interacting Proteins Tp0750 and Pallilysin among Treponemes and Restriction of Proteolytic Capacity toTreponemapallidum. [online].tersedia:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4598410/. [diakses:16September 2016;18:38] Houston,Simon dkk.2012. Activation and Proteolytic Activity of the Treponema pallidum
Metalloprotease,
Pallilysin.[online].tersedia:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3406077/.[diakses:16 September 2016; 18:22] Ho, Emily L dkk.2011.[online]. Syphilis: using modern approaches to understand an oldDisease. [online].tersedia:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3225993/. [diakses:16 September 2016; 18:22] Ke,Wujian dkk.2015. Treponema pallidum subsp. pallidum TP0136 Protein Is Heterogeneous among Isolates and Binds Cellular and Plasma Fibronectin via itsNH2
Terminal
End.[online].tersedia:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4368718/. [diakses:16september 2016;18:34] Majs,David.2012. Genetic diversity in Treponema pallidum: implications for pathogenesis, evolution and molecular diagnostics of syphilis and yaws. [online].tersedia:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3786143/. [diakses:16 september 2016;18:30] Rodriguez,Islay dkk.2015.Considerations on the use and interpretation of Treponema pallidum hemagglutination test for diagnosis of syphilis.[online].tersedia: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4660574/.[diakses:16 September 2016; 18:22] Silver,Adam C dkk.2013. MyD88
Deficiency
Markedly
Worsens
Tissue
Inflammation and Bacterial Clearance in Mice Infected with Treponema pallidum,
the
Agent
ofSyphilis.
[oline].tersedia:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3734110/. [diakses:16 September 2016; 18:22]
