2.1UJI 2.1UJI KEMURNIAN Berbagai metode kromatografi memberikan cara pemisahan paling kuat dilaboratorium kimia. Metode kromatografi, karena pemanfaatannya yang leluasa, dipakai secara luas untuk pemisahan analitik dan preparatif. Biasanya, kromatografi analitik dipakai pada tahap permulaan untuk semua cuplikan , dan kromatografi preparatif hanya dilakukan juka diperlukan fraksi murni dari campuran. Pemisahan secara kromatografi dilakukan dengan cara mengotak-atik langsung beberapa sifat fisika umum dari molekul. Sifat utama yang terlibat ialah : (1) Kecenderungan molekul untuk melarut dalam cairan (kelarutan), (2) Kecender ungan molekul untuk melekat pada permukaan serbuk halus (adsorpsi, penjerapan), dan (3) Kecenderungan molekul untuk menguap atau berubah ke keadaan uap (keatsirian) . Pemisahan
atau
pemurnian
kandungan
tumbuhan
terutama
dilakukan
dengan
menggunakan salah satu dari empat teknik kromatografi atau gabungan teknik tersebut. Keempat teknik kromatografi itu adalah kromatografi kertas (KKT), Kromatografi lapis tipis (KLT), Kromatogfrafi gas cair (KGC), dan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT). Metode pemisahan dan pemurnian kandungan tumbuhan terutama dilakukan dengan menggunakan salah satu dari empat teknik atau gabungan teknik tersebut. 1.
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Kedua cara ini serupa dalam hal fase diamnya berupa lapisan tipis dan fase geraknya mengalir karena kerja kapiler. Perbedaannya dalam sifat dan fungsi fase diam. Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
Proses isolasi yang terjadi berdasarkan perbedaan daya serap dan daya partisi serta kelarutan dari komponen-komponen kimia yang akan bergerak mengikuti kepolaran eluen, oleh karena daya serap adsorben terhadap komponen kimia tidak sama, maka komponen bergerak dengan kecepatan yang berbeda sehingga hal inilah yang menyebabkan pemisahan. Kromatotron
Proses isolasi yang terjadi berdasarkan adsorpsi dan partisi. Adsorpsi adalah senyawa kimia dapat terpisah-pisah disebabkan oleh daya serap adsorban terhadap tiap-tiap komponen kimia tidak sama. Sedangkan partisi adalah kelarutan tiap-tiap komponen kimia dalam cairan pengelusi (eluen) tidak sama dimana arah gerakan
eluen disebabkan oleh gaya sentrifugal sehingga komponen kimia dapat bergerak dengan kecepatan yang berbeda-beda yang menyebabkan terjadi pemisahan. 2. Kromatografi Gas Cair (KGC)
Pemisahan pada kromatografi gas didasarkan pada titik didih suatu senyawa dikurangi dengan semua interaksi yang mungkin terjadi antara solute dengan fase diam. Fase diam berupa gas akan mengelusi solute dari ujung kolom lalu menghantarkannya ke detector. Penggunaan suhu yang meningkat (biasanya pada kisaran 50-350°C) bertujuan untuk menjamin bahwa solute akan menguap dan karenanya akan cepat terelusi. Ada 2 jenis kromatografi gas : 1.
Kromatografi gas-cair (KGC)
Pada KGC ini, fase diam yang digunakan adalah cairan yang diikatkan pada suatu pendukung sehingga solute akan terlarut dalam fase diam. Mekanisme sorpsi-nya adalah partisi. 2.
Kromatografi gas-padat (KGP)
Pada KGP ini, digunakan fase diam padatan (kadang-kadang polimerik). Mekanisme sorpsi-nya adalah adsorpsi. 3. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
KCKT dapat disamakan dengan KGC dalam hal kepekaan dan kemampuan menghasilkan data kualitatif dan kuantitatif dengan sekali kerja saja. Perbedaannya adalah fase diam yang terikat pada polimer berpori terdapat pada kolom baja tahan karat yang bergaris tengah kecil dan fase gerak cair mengalir akibat tekanan yang besar. Maka, dari berbagai kromatografi diatas, penggunaan untuk kualitatif dapat digunakan KKt dan KLT serta KGC dan KCKT. Untuk penggunaan kuantitatif dan untuk pemurnian (isolasi) maka dapat dipertimbangkan penggunaan beberapa metode berikut, yaitu : KLT preparatif, kromatografi kolom (termasuk kromatografi gas dan kromatografi cair kinerja tinggi). 4. KROMATOGRAFI KOLOM
Pelarut (fase gerak) dibiarkan mengalir melalui kolom karena aliran yang disebabkan oleh gaya berat atau didorong dengan tekanan. Pita, senyawa linarut
bergerak melalui kolom dengan laju yang berbeda, memisah dan dikumpulkan berupa fraksi ketika keluar dari alas kolom. Kromatografi kolom merupakan metode kromatografi klasik yang masih banyak digunakan. Kromatografi kolom digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa dalam jumlah yang banyak berdasarkan adsorpsi dan partisi. Kemasan adsorben yang sering digunakan adalah silika gel G-60, kieselgur, Al2O3, dan Diaion. Cara pembuatannya ada dua macam :
Cara kering yaitu silika gel dimasukkan ke dalam kolom yang telah diberi kapas kemudian ditambahkan cairan pengelusi.
Cara basah yaitu silika gel terlebih dahulu disuspensikan dengan cairan pengelusi yang akan digunakan kemudian dimasukkan ke dalam kolom melalui dinding kolom secara kontinyu sedikit demi sedikit hingga masuk semua, sambil kran kolom dibuka. Eluen dialirkan hingga silika gel mapat, setelah silika gel mapat eluen dibiarkan mengalir sampai batas adsorben kemudian kran ditutup dan sampel dimasukkan yang terlebih dahulu dilarutkan dalam eluen sampai diperoleh kelarutan yang spesifik. Kemudian sampel dipipet dan dimasukkan ke dalam kolom melalui dinding kolom sedikit demi sedikit hingga masuk semua, dan kran dibuka dan diatur tetesannya, serta cairan pengelusi ditambahkan. Tetesan yang keluar ditampung sebagai fraksi-fraksi
1. Kromatografi Kolom Isap : Suction Colomn
Isolasi komponen kimia dalam jumlah yang banyak, berdasarkan absorpsi dan partisi, dimana kolom diisi dengan fase diam divakumkan dengan suatu pompa vakum agar eluen dapat turun mengelusi komponen kimia yang selanjutnya keluar sebagai fraksi-fraksi. Rapid-Sigel
Isolasi komponen kimia dalam jumlah yang sedikit berdasarkan absorpsi dan partisi, dimana kolom diisi dengan fase diam divakumkan dengan suatu
pompa vakum agar eluen dapat turun mengelusi komponen kimia yang selanjutnya keluar sebagai fraksi-fraksi. Press Colomn
Kromatografi kolom sederhana di mana fase gerak bergerak dengan cepat karena penggunaan tekanan positif dari tabung nitrogren. Udara yang ditekan mengandung O2 dan uap air yang dapat menyebabkan peruraian produk dari ekstrak dan berubah saat pemisahan kromatografi. Keterbatasan kromatografi kolom-terbuka klasik ialah sebagai berikut : (3) a.
Pemisahan lambat
b.
Penjerapan linarut yang tidak bolak-balik
c.
Tidak dapat dipakai jika partikel terlalu kecil.
Kombinasi antara kromatografi kolom kering dan kromatografi cair vakum memiliki kelebihan dimana laju pengelusian lebih tinggi dan memperpendek waktu kontak linarut dengan penjerap. Untuk kolom gaya tarik bumi yang memakai penjerap berukuran 602
230 mesh (63-250 μm), umumnya laju aliran sekitar 10-20 mL/cm penampang kolom/jam. Untuk partikel yang lebih kecil dari 200 mesh diperlukan semacam pemompaan atau sistem bertekanan. Kemudian laju dapat ditingkatkan sampai 2 mL atau lebih setiap menitnya, atau sampai batas sistem tekanan.
Kromatografi Vakum Cair mempunyai keuntungan yang utama dibandingkan dengan kolom konvensional yaitu : 1.
Konsumsi fase gerak KCV hanya 80% atau lebih kecil disbanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10-100μl/menit)
2.
Adanya aliran fase gerak lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spectrometer massa
3.
Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solute lebih pekat karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas missal sampel klinis
Kerugian KCV (Kromatogravi Vakum Cair) :
1.
Membutuhkan waktu yang cukup lama
2.
Sampel yang dapat digunakan terbatas
5. KROMATOGRAFI KERTAS Kromatografi kertas atau KKt pada hakekatnya adalah KLT pada lapisan tipis
selulosa atau kertas. Cara ini ditemukan jauh sebelum KLT dan tetap dipakai secara efektif selama bertahun-tahun untuk pemisahan molekul biologi seperti asam amino, gula dan nukleotida. Metode ini merupakan metode KCC dengan fase diam cair, biasanya air pada serabut kertas. KKt tidak memerlukan pelat pelindung dan kertas dapat mudah diperoleh dengan dalam bentuk murni sebagai kertas saring. Lapisan selulosa harus dicetak lebih panjang dari pada serabut pada lapisan selulosa yang lazim, menyebabkan lebih banyak terjadi difusi kesamping dan bercak lebih besar Akhirnya lapisan selulosa lebih rapat dan pelarut lebih cenderung mrngalir melaluinya. lebih cepat menghasilkan pemisahan lebih tajam (Roy, 1991). Mekanisme pemisahan dengan kromatografi kertas prinsipnya sama dengan mekanisme pada kromatografi kolom. Adsorben dalam kromatografi kertas adalah kertas saring, yakni selulosa. Sampel yang akan dianalisis ditotolkan ke ujung kertas yang kemudian digantung dalam wadah. Kemudian dasar kertas saring dicelupkan kedalam pelarut yang mengisi dasar wadah. Fasa mobil (pelarut) dapat saja beragam. Air, etanol, asam asetat atau campuran zat-zat ini dapat digunakan. Kromatografi kertas diterapkan untuk analisis campuran asam amino dengan sukses besar Ketika pelarut mencapai ujung atas kertas proses dihentikan. Setiap asam amino bergerak dari titik awal sepanjang jarak tertentu. Dari nilai R, masing-masing asam amino diidentifikasi. Kromatografi kertas dua-dimensi (2D) menggunakan kertas yang luas bukan lembaran kecil, dan sampelnya diproses secara dua dimensi dengan dua pelarut ( www.Indigo. Com ,1994).
Menurut Sastrohamidjojo, H (1991) menyatakan bahwa apabila akan melakukan pemisahan dengan kromatografi kertas maka hal-hal seperti berikut perlu mendapatkan perhatian. a. Metode
Ada beberapa metode dalam pemisahan dengan kromatografi kertas diantaranya :
Metode penurunan yaitu berupa bejana yang terbuat dari gelas , platina atau logam tahan karat yang di atasnya ditutup untuk mencegah dari pelarut. Untuk menyangga agar kertas tak lepas perlu diberi penahan dari batang gelas. Untuk beberapa centimeter pelarut mengalir oleh gaya kapiler dan mengalir oleh gravitasi setelah permukaan pelarut melintasi batang gelas.
Metode penaikan. Bejana yang digunakan untuk kromatografi penaikan sama seperti untuk kromatografi penurunan, tetapi pelarut diletak dibagian bawah bejana dan kertas dicelupkan di atasnya.
Metode mendatar. Dalam cara ini kertas dibentuk bulat ditengahnya diberi lubang sebagai tempat untuk meletakkan sumbu yang terbuat baik dari gulungan kertas atau dari benang dimana melalui ini pelarut akan naik yang kemudian akan membesahi kertas untuk kemudian mengembang, melingkar, membawa senyawa yang dipisahkan.
b. Kertas
Kromatografi kertas menggunakan kertas saring whatman no. 1 dan sampai saat ini masih dipakai. Kertas dalam pemisahan terutama mempunyai pengaruh pada kecepatan alir pelarut. Sedangkan fungsi dari kertas sendiri sangat kompleks. Efek efek serapan disebabkan oleh sifat polar dari gugus-gugus hidroksil dimana ini kemungkinan sangat penting dan sejumlah kecil dari gugus karboksil dalam selulosa dapat menaikkan terhadap efek-efek pertukaran ion. Kecepatan aliran naik dengan penurunan kekentalan dari pelarut (dengan kenaikan dalam suhu), tetapi aliran pelarut pada suhu yang tertentu, ditentukan oleh kerapatan dan tebalnya kertas. c.
Pelarut
Fase bergerak biasanya merupakan campuran yang terdiri atas satu komponen organic yang utama , air dan berbagai tambahan seperti asam-asam, basa atau pereaksi pereaksi kompleks untuk memperbesar kelarutan dari beberapa senyawa atauuntuk mengurangi yang lainnya. Anti oksida sering digunakan juga dan harus didapati dengan kemurnian yang tinggi . Pelarut harus sangat mudah menguap, karena terlampau cepat mengadakan kesetimbangan, pada keadaan yang lain volalitas yang tinggi mengakibatkan lebih cepat hilang meninggalkan lembaran kertas setelah bergerak. Kecepatan bergeraknya harus tidak cepat dipengaruhi oleh perubahan
perubahan suhu. Contoh penggunaan dari pelarut yang dipilih untuk senyawasenyawa organic yang polar akan lebih mudah larut dalam air dari pada dalam zat – zat cair organic akan terjadi gerakan-gerakan yang lambat jika fase bergerak anhidrida digunakan, penambahan air terhadap pelarut akan menyebabkan senyawasenyawa tersebut untuk bergerak. Jadi n-butanol bukan merupakan suatu pelarut untuk asam-asam amino jika tidak dijenuhkan dengan air penambahan asam cuka disertai dengan pemberian lebih banyak air akan menjadi baik, yaitu akan menaikkan kelarutan dari asam-asam amino terutama yang bersifat basa, campuran tiga komponen ini sangat baik untuk senyawasenyawa asam amino. d. Cara penempatan cuplikan pada kertas
Larutan campuran yang akan dipisahkan ditempatkan pada kertas yang berupa noda. Biasanya dibiarkan untuk berkembang membentuk suatu bulatan . Bagian kertas yang ditetesi dibiarkan dalam keadaan mendatar, sehingga larutan pada keadaan kompak dalam bentuk bulatan. Dan jangan biarkan kertas tersentuh zat-zat yang lain. Biasanya diameter dari noda yang digunakan adalah 0,5 cm (Sastrohamidjojo, 1991). e. Identifikasi dari senyawa-senyawa
Menurut Sastrohamidjojo, H (1991) menyatakan bahwa dalam mengidentifikasi nodanoda dalam kertas sangat lazim menggunakan harga Rf (retordation factor) yang didefenisikan sebagai
Ada beberapa faktor yang menentukan harga Rf yaitu diantaranya adalah 1.
Pelarut , disebabkan pentingnya koefisien partisi, maka perubahan-perubahan yang sangat kecil dalam komposisi pelarut dapat menyebabkan perubahan perubahan harga Rf
2. Suhu , perubahan dalam suhu merubah koefisien partisi dan juga kecepatan aliran.
3. Ukuran dari bejana , volume dari bejana mempengaruhi homogenitas dari atmosfer jadi mempengaruhi kecepatan penguapan dari komponen-komponen pelarut dari kertas. 4. Kertas .pengaruh utama kertas pada harga Rf timbul dari perubahan ion dan serapan, yang berbeda untuk macam-macam kertas. Kertas mempengaruhi kecepatan aliran.ia akan juga mempengaruhi pada kesetimbangan partisi. 5. Sifat dari campuran. Berbagai senyawa mengalami partisi dan antara volumevolume yang sama dari fase tetap dan bergerak. Mereka hampir selalu mempengaruhi karakteristik dari kelarutan satu terhadap yang lainnya hingga harga Rfnya.
2.2 ISOLASI PREPENTIF Kromatografi Lapis Tipis Preparatif merupakan proses isolasi yang terjadi berdasarkan perbedaan daya serap dan daya partisi serta kelarutan dari komponen-komponen kimia yang akan bergerak mengikuti kepolaran eluen oleh karena daya serap adsorben terhadap komponen kimia tidak sama, maka komponen bergerak dengan kecepatan yang berbeda sehingga hal inilah yang menyebabkan pemisahan.
Kromatografi lapis tipis preparatif .
Salah satu metode pemisahan yang memerlukan biaya paling murah dan memakai peralatan sangat sederhana ialah kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP).Walaupun KLTP dapat memisahkan dalam jumlah gram,sebagian besar pemakaian hanya dalam jumlah miligram. KLT preparatif dilakukan dengan menggunakan lapisan tebal (sampai 1 mm) sebagai pengganti lapisan penyerap yang tipis (Harborne, 1987) Pada kromatografi lapis tipis preparatif, cuplikan yang akan dipisahkan ditotolkan berupa garis pada salah satu sisi pelat lapisan besar dan dikembangkan secara tegak lurus pada garis cuplikan sehingga campuran akan terpisah menjadi beberapa pita. Pita ditampakkan dengan cara yang tidak merusak jika senyawa itu tanwarna, dan penyerap yang mengandung senyawa pita dikerok dari pelat kaca. Kemudian cuplikan dielusi dari penyerap dengan pelarut polar. Cara ini berguna untuk memisahkan campuran reaksi sehingga diperoleh senyawa murni untuk telaah pendahuluan, untuk menyiapkan cuplikan analisis, untuk meneliti bahan alam yang lazimnya berjumlah kecil dan
campurannya
rumit dan untuk memperoleh cuplikan yang murni untuk mengkalibrasi kromatografi lapis tipis kuantitatif (Gritter, 1991) Pengembangan plat KLTP biasanya dilakukan dalam bejana kaca yang dapat menampung beberapa plat. Keefisienan pemisahan dapat ditingkatkan dengan cara pengembangan berulang. Harus diperhatikan bahwa semakin lama senyawa berkontak dengan penyerap maka semakin besar kemungkinan penguraian (Hostettman, 1995) Jel silika adalah bentuk dari silikon dioksida (silika). Atom silikon dihubungkan oleh atom oksigen dalam struktur kovalen yang besar. Namun, pada permukaan jel silika, atom silikon berlekatan pada gugus -OH. Jadi, pada permukaan jel silika terdapat ikatan Si-O-H selain Si-O-Si. Gambar ini menunjukkan bagian kecil dari permukaan silika.
Permukaan jel silika sangat polar dan karenanya gugus -OH dapat membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa-senyawa yang sesuai disekitarnya, sebagaimana halnya gaya van der Waals dan atraksi dipol-dipol. Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah alumina-aluminium oksida. Atom aluminium pada permukaan juga memiliki gugus -OH. Apa yang kita sebutkan tentang jel silika kemudian digunakan serupa untuk alumina. Analisis preparatif ditujukan untuk memisahkan analit dalam jumlah yang banyak lalu senyawa yang telah dipisahkan ini dianalisis lebih lanjut, misalkan dengan spektrofotometri atau dengan teknik kromatografi lain. Pada KLT preparatif ini, sampel ditotolkan dalam lempeng dengan lapisan yang besar lalu dikembangkan dan dideteksi dengan cara yang non-destruktif. Bercak yang mengandung analit yang dituju selanjutnya dikerik dan dilakukan analisis selanjutnya a)
Penyerap (adsorben)
Berbagai penelitian telah dilakukan untuk memeriksa pengaruh ketebalan penyerap terhadap kualitas pemisahan tetapi ketebalan yang sering dipakai adalah 0,5 2 mm . ukuran pelat kromatografi biasanya 20x20 cm atau 20x40 cm . pembatasan ketebalan ukuran lapisan dan ukuran pelat sudah tentu mengurangi jumlah bahan yang dapat dipisahkan dengan KLTP. Penyerap yang paling umu ialah silica gel dan dipakai untuk pemisahan campuran senyawa lipofil maupun campuran senyawa hidrofil. Untuk pembuatan lapisan tanpa retak dianjurkan memakai penyerap niaga yang tersedia. Ukuran partikel dan porinya kurang lebih sama dengan ukuran tingkat mutu KLT. (Hostmann. 1995 : 9) Pelat KLTP dapat dibuat sendiri atau dibeli dengan sudah terlapisi penyerap (biasanya disebut pelat siap pakai atau pelat pralapis). Keuntungan membuat pelat sendiri ialah bahwa ketebalan dan susnan lapisan dapat kia atur sendiri. Jadi, perak nitrat, senyawa dapr, dsb. Dapat dicampur dengan penyerap pembuatan lapisan penyerap. (Hostettmann. 1995 : 9) Pembuatan lapisan penyerap yang diperlukan dapat dikerjakan denganmemakai salah satu dari alat penyaput niaga yang banyak jenisnya misalnya dari camag, desaga dsb. Petunjuk untuk penggunaan pelat biasanya terdapat pada kemasan penyerap yang bersangkutan. (Hostettmann. 1995 : 9 b) Penotolan Cuplikan
cuplikan dilarutkan dengan sedikit pelarut sebelum ditotolkan pada pelat KLTP. Pelarut yang baik ialah pelarut atsiri (heksana, diklorometana, etil asetat), karena jika tidak atsiri terjadi pelebaran pita. Konsentrasi cuplikan harus sekitar 510%. Cuplikan ditotolkan berupa pita yang harus sesempit mungkin karena pemisahann bergantung pada lebar pita. Penotolan dapat dilakukan dengan tangan (pipet) tetapi lebih baik dengna penotolan otomatis (camag, desaga, dsb). Untuk pita yang terlalu lebar, dapat dilakukan pemekatan dengan cara pengembangan memakai palerut polar sampai kira-kira 2 cm diatas tempat totolan . kemudian pelat dikeringkan dan dielusi dengan pelarut yang diinginkan (Stahl 1967). Pelat pralapis khusus dengan daerah pemekatan dapat dibeli. (Hostettmann. 1995 : 9)
c) Isolasi Senyawa Yang Sudah Terpisah
Kebanyakan
penyerap
KLTP
mengandung
indikator
fluoresensi
yang
membantu mendeteksi kedudukan pita yang terpisah sepanjang senyawa yang dipisahkan menyerap siunar UV. Akan tetapi beberapa indicator menimbulkan masalah bereaksi dengan asam kadang-kadang asam asetat. Untuk senyawa yang tidak menyerap UV ada beberapa pilihan :
Menyemprot dengan air (misalnya saponini)
Menutup pelat dengan sepotong kaca meyemprot salah satu sisi dengna pereaksi semprot.
Menambahkan senyawa pembanding Pita yang kedudukanya telah diketahui dikerok dari pelat dengan spatula atau
pengerok berbentuk tabung yang disambungkan ke pengumpul vakum. Cara terakhir tidak dapt dilakukan untuk senyawa peka karena penyerap yang mengandung senyawa yang sudah murni terus menerus kena aliran udara dan risiko kena otooksidasi selalu ada. Cara mengumpulkan mana pun yang dipakai, senyawa harus diekstrasi dari penyerap dengan pelarut yang paling kurang polar yang mungkin (sekitar 5 ml pelarut untuk 1 gram penyerap). Harus diperhatikan bahwa makin lama senyawa berkontak denga penyerap makin besar kemungkinan penguraian. Ekstrak disaring melalui “frit “ kaca berkeporian 4 dan kemudian melalui membran 0,2-0,45 µm. (Hostettmann. 1995 : 11) d) Keuntungan Dan Kerugian KLTP
keuntungan : Salah satu pemisahan yang memerlukan pembiayaan paling murah dan memakai peralatan paling dasar adalah kromatografi lapis tipis preparatif.
Kerugian: Ketebalan dari lempeng menyebabkan waktu yang dibutuhkan menjadi lebih lama dibadingkan dengan KLT pada umumnya
e)
Dasar Pertimbangan Penggunaan KLTP :
Pada Kromatografi Lapis Tipis (KLT), zat penjerap merupakan lapisan tipis serbuk halus yang dilapiskan pada lempeng kaca, plastik ataulogam secara merata. Dengan memakai KLT, pemisahan senyawa yang amat berbeda seperti senyawa organik alam dan senyawa organik sintetik, kompleks anorganik-anorganik dan bahan ion anorganik dapat dilakukan beberapa menit dengan alat yang harganya tidak terlalu mahal
