LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA “ PENETAPAN KADAR GLUKOSA DALAM DARAH DENGAN METODE GOD-PAP “
Disusun oleh: Hayu Ajeng Anggana Raras (098114004) Amelia Felicia Cornelius Putri (098114005) Kenny Ryan Limanto (098114006)
LABORATORIUM BIOKIMIA FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2010
PERCOBAAN IV PENETAPAN KADAR GLUKOSA DALAM DARAH DENGAN METODE GOD-PAP A. TUJUAN Menentukan kadar glukosa dalam darah dengan metode GOD-PAP B. DASAR TEORI Glukosa merupakan karbohidrat yang paling penting dalam biokimia mamalia karena hampir semua karbohidrat dalam makanan akan dikonersi menjadi glukosa untuk metabolisme selanjutnya (Murray, 1999). Glukosa adalah suatu aldoheksosa dan sering disebut dekstrosa karena mempunyai sifat dapat memutar cahaya terpolarisasi ke arah kanan. Di alam, glukosa terdapat pada buah-buahan dan madu lebah. Dalam alam, glukosa dihasilkan dari reaksi antara karbon dioksida dan air dengan bantuan sinar matahari dan klorofil dalam daun (Poedjiadi, 1994). Penggunaan glukosa diatur dalam tubuh oleh insulin. Kelebihan glukosa akan diubah menjadi glukagon dan akan disimpan dalam hati dan otot , dan akan digunakan bila diperlukan dan akhirnya diubah menjadi lemak dan disimpan sebagai jaringan lemak (Anonim, 2002). Kadar glukosa dalam darah merupakan faktor yang sangat penting untuk kelancaran kerja tubuh. Kadar normal glukosa dalam darah adalah 70-90 mg/100 ml. keadaan di mana kadar glukosa berada di bawah 70 mg/ 100 ml disebut hipoglisemia, sedangkan jika di atas 90mg/ 100 ml disebut hiperglisemia. Hipoglisemia ekstrim dapat menghasilkan suatu rentetan reaksi goncangan yang ditunjukkan oleh gejala gemetarnya otot, perasaan lemah badan dan pucatnya warna kulit. Hipoglisemia yang serius dapat menyebabkan kehilangan kesadaran (pingsan) sebagai akibat kekurangan glukosa dalam otak yang perlu untuk pembentukan energi, sehingga kemudian dapat menyebabkan kematian (Wirahadikusuma, 1985). Kadar glukosa yang tinggi merangsang pembentukan glikogen dari glukosa, sintesis asam lemak, dan kolesterol dari glukosa. Kadar glukosa antara 140-170 mg/ 100mL disebut kadar ambang ginjal. Gejala ini disebut glikosuria, yaitu keadaan ketidakmampuan ginjal untuk menyerap kembali glukosa yang telah mengalami filtrasi (Poedjiadi, 1994). Hormon insulin berperan sentral dalam mengatur glukosa darah. Hormon ini dihasilkan oleh sel β pulau Langerhans di pankreas sebagai respons terhadap hiperglikemia. Sel-sel β pulau Langerhans bersifat permeabel bebas terhadap glukosa melalui pengangkut GLUT 2, dan glukosa mengalami fosforilasi oleh glukokinase. Oleh karena itu peningkatan glukosa darah akan meningkatan aliran metabolik
melalui glikolisis, siklus asam sitrat, dan pembentukan ATP. Oleh karena itu, kadar insulin dalam darah setara dengan konsentrasi glukosa darah. Meskipun tidak secara langdung mempengaruhi penyerapan glukosa oleh hati, namun insulin meningkatkan penyerapan jangka panjang akibat kerjanya pada enzim-enzim yang mengendalikan glikolisis, glikogenesis, dan glukoneogenesis (Murray, 1999). Glukosa ditetapkan kadarnya setelah dioksidasi secara enzimatis menggunakan enzim GOD (Glucose oksidase). H2O2 yang terbentuk kemudian bereaksi dengan fenol dan 4-aminoantipirin dengan katalis enzim peroksidase (POD) yang membentuk quinoneimine. Intensitas warna yang terbentuk sebanding dengan konsentrasi glukosa dalam sampel (Anonim, 2009). GOD (Glukosa-oksidase) adalah suatu enzim spesifik FAD yang diperoleh dari jamur, karena dipakai untuk penafsiran glukosa. Semua aerobic dehidrogenase yang diterangkan mengandung 2 molekul glukosa nukleotida. PAP (Phenol Amino Peroksidase) mengandung antigen atau antibody dalam patogen jaringan. Mempertahankan kadar glukosa dalam darah hingga stabil adalah salah satu yang paling baik pengaturannya dari semua mekanisme homeostatik (Mayes, 1984). Glukosa + O2 + 2 H2O
GOD
2 H2O2 + phenol + 4-aminoantipirin
asam glukonat + H2O2 POD
quinoneimine + 4 H2O (Diachem, 2007)
C. ALAT DAN BAHAN Alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah : 1. Sentrifuge
4. Efendorf
2. Tabung sentrifuge
5. Tabung reaksi
3. Mikropipet
6. Microlab-200
Bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah : 1. Reagen, yang terdiri dari : -
Fosfat buffer
-
4-amino antipirin
-
Glucose oksidase (GOD)
-
Peroksidase (POD)
2. Aquabidest 3. Serum/plasma darah
D. SKEMA KERJA 1. Pembuatan Blanko Mengambil aquadest sebanyak 10 µL
Memasukkannya ke dalam tabung reaksi
2. Pembuatan larutan standar Mengambil 1000 µL reagen dalam tabung reaksi
Menambahkan 10 µL larutan standard glukosa
3. Pembuatan larutan sampel Mengambil 1000 µL reagen dalam tabung reaksi
Menambahkan 10 µL serum darah tikus sebagai sampel yang akan diuji
Melakukan replikasi (didapat 2 larutan sampel tiap kelompok)
4. Pengukuran dengan Microlab-200 Memvortex semua larutan yang telah dibuat
Mendiamkannya selama operating time , kurang lebih 20-25 menit
Mengukur aktivitas serumnya dengan Microlab-200 pada panjang gelombang 546 nm
Mengukur serapan blanko dan standar, sebelum mengukur kadar sampel
E. DATA PENGAMATAN kadar komposisi blanko standar
sampel 1 sampel 2
standar
sampel 3 sampel 4
standar
sampel 5 sampel 6
10 µL aquadest 10 µL larutan standard glukosa + 1000 µL reagen 10 µL serum tikus + 1000 µL reagen 10 µL serum tikus + 1000 µL reagen 10 µL larutan standard glukosa + 1000 µL reagen 10 µL serum tikus + 1000 µL reagen 10 µL serum tikus + 1000 µL reagen 10 µL larutan standard glukosa + 1000 µL reagen 10 µL serum tikus + 1000 µL reagen 10 µL serum tikus + 1000 µL reagen
(
-
)
Absorbansi 0
(
)
( − ) -
| − |
160
0,409
31,111
967,894
224
-
95,111
9046,102
158
-
29,111
847,450
100
-
-28,889
834,574
128,889 146
-
17,111
292,786
78
-
-50,889
2589,690
101
-
-27,889
777,796
93
-
-35,889
1288,020
100
-
-28,889
834,574
| − | ( ∶
±
= (128,889 − 46, 742) = 82,147
)=
− 175,631
-
∑| − | = −1
17478,886
9−1
=
17478,886
8
17478,886
= 46, 742
− (128,889 + 46, 742)
Data yang tidak masuk dalam range, data sampel 1 yang menunjukkan kadar 224 mg/ dL dan data sampel 4 yang menunjukkan kadar 78 mg/ dL.
F. PEMBAHASAN Tujuan dari percobaan ini adalah untuk menentukan kadar glukosa dalam darah dengan metode GOD-PAP. Metode GOD-PAP adalah salah satu metode penentuan kadar glukosa sesudah oksidasi enzimatik oleh glukosa oksidase. Reaksinya adalah :
Pada reaksi di atas , glukosa oksidase (GOD) mengkatalisis oksidase glukosa,pada reaksi ini terbentuk H2O2 , yang dengan adanya peroksidase (POD) akan bereaksi dengan fenol dan aminoantipirin. Sebenarnya dapat digunakan 2,4-dichloro phenol, namun karena susah didapat, sifatnya yang tak stabil dan harganya mahal, maka digunakan fenol dalam percobaan ini. Oksidasi ini akan menimbulkan zat warna yang intensitasnya sebanding dengan kadar glukosa, diukur secara fotometrik. Reaksinya:
Prinsip dari pengujian ini adalah dengan menembakkan panjang gelombang tertentu (dalam percobaan ini, digunakan λ = 546 nm) pada suatu senyawa. Karena cahaya yang ditembakkan mengandung energi ( = ℎ ), hal ini akan membuat elektron dari senyawa tersebut akan tereksitasi
ke orbital yang lebih tinggi. Setelah mengalami eksitasi, elektron tersebut akan turun kembali ke ground state (keadaan dasar), sambil melepaskan emisi yang kemudian dapat diukur oleh Microlab200. Salah satu yang memegang peran dalam pengujian ini adalah gugusan kromofor (ikatan rangkap terkonjugasi), yang dapat menangkap panjang gelombang tertentu. Metode GOD-PAP ini memiliki akurasi dan presisi yang baik karena enzim GOD spesifik untuk reaksi pertama. Sedangkan pada reaksi kedua rawan interferen (sifatnya tidak spesifik). Interferen yang dapat mengganggu antara lain bilirubin, asam urat , asam askorbat. Untuk itu bagian yang diuji bagian serumnya, protein darah (sel padatnya) tidak boleh ikut terambil. Pada praktikum yang digunakan adalah darah tikus. Tikus tidak dalam keadaan puasa karena kadar glukosanya akan menurun. Pada tubuh manusia, pengaturan kadar glukosa dalam darah berkaitan erat dengan hormon insulin dan glukagon. Pada waktu kadar glukosa darah naik, hormon insulin disekresikan, yang akan menurunkan kadar glukosa darah. Dalam keadaan puasa, kadar glukosa darah menurun, hormon glukagon disekresikan untuk meningkatkan kadar glukosa darah. Keduanya bekerja berlawanan, hormon insulin dihasilkan oleh sel-sel beta pulau Langerhans dan glukagon dihasilkan oleh sel-sel alfa pulau Langerhans. Gangguan pada pengeluaran hormon insulin dapat menyebabkan penimbunan glukosa dalam darah (hiperglikemia = di atas 90 mg / 100mL) yang kita kenal sebagai penyakit diabetes melitus. Sebaliknya jika hormon glukagon tidak disekresikan dengan baik maka kita dapat merasakan pusing, gemetar, lemah, pucat, hipoglikemia (di bawah 70
mg/ 100mL) dapat mengakibatkan pingsan sebagai akibat kekurangan glukosa dalam otak yang perlu untuk pembentukan energi. Kemudian dapat menyebabkan kematian (Wirahadikusuma, 1985). Setelah itu dilakukan sentrifugasi (pemisahan campuran berdasarkan perbedaan berat jenis). Kecepatan yang digunakan 3000 rpm. Setelah memisah, terdapat bagian yang menggumpal dan cairan yang bening. Yang diambil adalah cairan bening itu (serumnya), selain sudah dijelaskan di atas, akan ada interferen dari protein-protein darahnya, juga karena yang dibutuhkan pada percobaan ini adalah bagian cair bening yang dapat ditembus cahaya, sedangkan padatan tentu tidak bisa ditembus oleh cahaya sehingga jika plasma darah dalam serum itu mengalami lisis, maka tidak dapat diukur menggunakan Microlab-200, karena prinsip dari Microlab-200 itu sendiri adalah spektroskopi, yang bisa mengukur jika larutan itu bening sehingga dapat ditembus oleh cahaya. Setelah serum didapat , diambil sebanyak 10 µL dan ditambahkan reagen sebanyak 1000 µL dan di-vortex dengan tujuan agar serum dan reagen homogen. Larutan direplikasi sebanyak 2, sehingga masing-masing tabung berisi 5 µL serum dan 500 µL reagen. Larutan blanko dibuat dengan mengambil aquadest sebanyak 10 µL. Tujuan dari pembuatan larutan blanko adalah untuk membuktikan bahwa aquadest (pelarut) yang digunakan tidak memiliki daya absorbansi (sama dengan nol) sehingga ketika kita mengukur sampel, hanya kadar yang ingin kita ukur saja (glukosanya) yang terbaca. Kemudian dibuat juga larutan standard yang berisi 1000 µL reagen dan 10 µL larutan standard glukosa. Larutan standard ini sebagai pembanding kedua sampel yang ada. Kemudian setelahnya didiamkan selama 20-25 menit (operating time) supaya didapatkan hasil optimal di mana reagen dan serum bereaksi optimal. Langkah selanjutnya adalah mengukur aktivitas serum dengan Microlab-200 pada panjang gelombang 546 nm. Pada panjang gelombang inilah daya absorbansinya optimal. Pada saat akan menggunakan Microlab, pipa perlu dicuci dengan aquadest dengan tujuan supaya tidak terkontaminasi senyawa/ bahan-bahan sebelumnya. Glukosa oksidase (GOD) adalah enzim yang mengkatalisis oksidasi β-D-glukosa menjadi glukonolakton yang kemudian dengan adanya molekul air terhidrolisis menjadi asam glukolonat dan peroksida. Reaksinya sebagai berikut: GOD β-D-glukosa + FAD β-D-glukonolakton + FADH2 β-D-glukonolakton + H2O asam D-glukolonat FADH2 + O2 H2O2 + FAD β-D-glukosa + O2 + H2O asam-D-glukolonat + H2O2
(Whitaker, 1972).
Berdasarkan teori seharusnya kadar glukosa normal dalam darah adalah sekitar 70-110 mg/dl, namun pada percobaan kami dihasilkan kadar glukosa yang sangat tinggi melebihi standar, hal ini dapat disebabkan karena pemipetan serum yang kurang benar dan pencucian alat yang tidak bersih, sehingga masih ada zat pengotor lainnya yang tertinggal di dalam tabung reaksi. Hal ini dapat mengganggu hasil pengukuran dengan Microlab-200 yang sensitif. Dari data-data di atas, didapatkan range dari hasil percobaan sebesar 82,147
175,631
−
. Dari range tersebut, terdapat dua data yang tidak masuk dalam range tersebut. Hal
ini dapat disebabkan oleh kesalahan praktikan, baik dari pemipetan maupun pencucian alat yang kurang bersih.
G. KESIMPULAN 1. Dari percobaan yang telah dilakukan didapatkan data sebagai berikut: a. Range kadar glukosa yang didapat sebesar 82,147
− 175,631
b. Kadar rata-rata dari glukosa yang diuji sebesar 128,889 mg/ dL
2. Kadar glukosa terbesar sebesar 224 mg/ dL, kadar glukosa terkecil sebesar 78 mg/ dL 3. Reaksi dalam percobaan ini adalah HO HO
OH
OH HO O O
oxygen
O
O
O H
water HO
HO
HO
H
OH
hydrogen peroxide O
HO
OH
glucuronic acid
OH
glucose N HO
OH
N
HN
HO
O
hydrogen peroxide NH2
phenol
quinone imine
O
4-aminoantipyrine
H. DAFTAR PUSTAKA Anonim, 2002, Kamus Kedokteran Dorland Edisi 29, 931-932, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta Anonim, 2009, Glucose GOD-PAP, http://www.chemoquip.com/html/downloads/18.pdf+god +pap&cd=10&hl=id&ct=clnk=&gl=id, diakses tanggal 6 April 2010 Diachem, 2007, GLUCOSE GOD/PAP DIACHEM Ltd, http://www.diachem.hu/CE%20Diag on%20angol%20utas/Glucose_PAP_stable_liliqu.pdf, diakses tanggal 19 April 2010 Mayes, P. A. A., 1984, Biokimia, 146, 284, 285, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta Murray, R. F., 1999, Biokimia Harper edisi 24, 141-142, EGC, Jakarta Poedjiadi, A., 1994, Dasar-Dasar Biokimia, 8-11, UI Press, Jakarta Whitaker, R.J., 1972, Principle of Enzimology for The Food Science, 561-570, Mergel Dekker Inc., New York Wirahadikusumah, M., 1985, Biokimia Metabolisme Energi, Karbohidrat, dan Lipid, 127128, ITB Press, Bandung
Yogyakarta, 20 April 2010 Praktikan, 1. Hayu Ajeng Anggana Raras (098114004)
2. Amelia Felicia Cornelius Putri (098114005)
3. Kenny Ryan Limanto (098114006)
