RESUMEN
1
RESUMEN
Stev St evia ia re reba baud udia iana na Be Bert rt. . (y (yer erba ba du dulc lce) e), , es un una a planta arbustiva semiperenne, originaria del noreste del Paraguay, perteneciente a la familia de las compuestas. Su importancia económica radica en que, en sus hojas, posee una sustancia, denominada esteviósido, constituida por
una
mezcla
de
por
lo
menos
seis
glucósidos
diterpénicos, que es 100 a 400 veces más dulce que la sacarosa y que por sus características físico-químicas y toxicológicas permite su inclusión en la dieta humana para pa ra
se ser r
util ut iliz izad ada a
como como
un
edul ed ulco cora rant nte e
diet di etét étic ico o
natural, sin efectos colaterales.
Su inc inclus lusión ión en el cód código igo ali alimen mentar tario io nac nacion ional al (Res (R esol oluc ució ión n
101 10 1
del de l
22-2 22 -2-1 -199 993) 3)
y
la
posi po sibi bili lida dad d
de
exportación ha incrementado el interés en esta especie por parte de los productores.
Naturalmente se propaga por aquenios, pero el bajo valor
cultural
de
las
semillas
(10
al
15
%)
y
la
heterogeneidad de las poblaciones resultantes indican la necesidad
de
desarrollar
y/o
ajustar
técnicas
altern alt ernati ativas vas, , sen sencil cillas las y eco económ nómica icas, s, que per permit mitan an la propagación masiva de genotipos selectos.
2
El objetivo del presente trabajo de intensificación es estudiar algunos factores que afectan la propagación vegetativa de esta especie, para lo cual se utilizaron estacas apicales y subapicales, provenientes de plantas clonad clo nadas, as, de ori origen gen jap japoné onés, s, que se enc encuen uentra tran n en el camp ca mpo o
expe ex peri rime ment ntal al
trataron
con
una
de
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solución
facu fa cult ltad ad, ,
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de
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ácido
indolb ind olbutí utíric rico o (25 mg/ mg/l l dur durant ante e 24 hor horas) as), , pla plantá ntándo ndose se pos po ste ter rio iorm rmen ent te
en
band ba ndej eja as
de
plás pl ásti tic co,
sob so bre
un
sustrato de turba y humus de lombriz (1:1) ó turba y arena (1:1). A las cuatro semanas, se evaluó, porcentaje de enraizamiento, longitud y peso de raíces y peso de la parte aérea.
Esta experiencia se repitió a lo largo del período de crecimiento anual (desde primavera a fin de otoño), siempre que en el stand de plantas madres, los vástagos alcancen un tamaño que permita extraer estacas apicales y subapicales.
Se
real re aliz izó ó
un
ensa en sayo yo
fact fa ctor oria ial l
con co n
medi me dida das s
repetidas en el tiempo, con un diseño de bloques al azar y los resultados se evaluaron a través de un análisis de varianza.
3
INTRODUCCION
4
INTRODUCCIÓN:
De los cuatro sabores básicos: dulce, salado, amargo y placer este
agrio, el primero es el que
fisiológico, sabor
sacarosa utiliza
y
estaba aún
como
al
ser
humano.
íntimamente
hoy,
patrón
el de
sabor
produce mayor
Tradicionalmente,
relacionado de
comparación
este de
con
la
compuesto la
se
calidad
e
intensidad del sabor dulce de un producto. Además de su sabor, la sacarosa presenta una serie de propiedades físicas, químicas y biológicas que la convierten en un ingrediente ideal para la industria de la alimentación y la cocina familiar.
Lamentablemente, existen motivos por los cuales su uso debe ser limitado y/o
eliminado de la dieta de
muchas personas (ejemplo: diabetes, obesidad),
y
sin
embargo, el hombre no parece dispuesto a renunciar al placer que le produce el sabor dulce, por lo que ha buscado sustancias naturales o artificiales capaces de sustituir al azúcar.
A pesar de la gran cantidad de sustancias que poseen sabor dulce, muy pocas de ellas se utilizan en forma limitan
extensiva su
uso
como son
edulcorantes. de
diversa 5
Las
razones
índole:
que
legales,
económicas, toxicológicas, etc.; y es por ello que en la actualidad existen pocos edulcorantes que se utilizan en forma
extensiva
y
cuya
comercialización
alcance
un
volumen apreciable. Los más importantes son: sacarina, ciclamato,
aspartamo,
acesulfame-K
y
esteviósido
(Cardozo y Rodríguez, 1986).
El poder edulcorante de estas sustancias varía entre si y para la cuantificación del sabor dulce de las mismas
se
recurre
a
métodos
de
carácter
subjetivo,
basados en la degustación. Los resultados obtenidos con estas sustancias puras y estos métodos no pueden ser extrapolados
para
predecir
su
comportamiento
en
la
formulación de un alimento
Al producirse la mezcla de un edulcorante con las demás sustancias componentes de la formulación de un alimento,
normalmente
se
producen
interacciones
y
cambios más o menos profundos en el sabor. Algunos de estos cambios pueden ser favorables y aprovecharse para mejorar la calidad o el poder de los edulcorantes, ya que
en
los
mismos,
al
mezclarse,
se
produce
una
expansión del sabor dulce, es decir, se consigue una dulzura superior a la simple aditividad de los poderes de ambos edulcorantes por separado (Morita, 1977).
6
Por lo general, el sabor dulce de un edulcorante nunca es "puro" como en la sacarosa, ya que normalmente viene acompañado de sabores secundarios no deseados. El caso más común de sabor secundario es el amargo y/o metálico, debido a que los centros receptores del mismo se hallan localizados en las vecindades de los del sabor dulce. Existen sustancias, que adicionadas en pequeñas cantidades, son capaces de suprimir o disminuir algunos sabores
indeseables,
formulación
de
los
utilizándose alimentos.
ampliamente Ejemplo:
la
en
la
mezcla
ciclamato-sacarina en la relación 10:1.
Asimismo, existen otras sustancias que, adicionadas en
pequeñas
determinados
cantidades, sabores
de
aumentan la
mezcla,
la
intensidad
por
ejemplo,
de el
cloruro de sodio y los condimentos (Morita, 1977).
1 - Propiedades de un edulcorante ideal:
Un
edulcorante "ideal"
deberá satisfacer
siguientes requerimientos: (Ishima y Kakayama, 1976).
- Tener el sabor dulce de la sacarosa, sin componentes secundarios indeseables. 7
los
- Tener bajo contenido calórico, referido a una misma base de poder edulcorante. Esta condición puede ser satisfecha bien
por poseer un alto
poder edulcorante o por no ser metabolizado por organismo.
- Poseer propiedades físicas similares a la sacarosa: resistencia a las temperaturas elevadas y a los ph comunes en los alimentos, ser soluble en agua, poseer similares características de textura y viscosidad que la sacarosa en iguales condiciones, no ser higroscópico, etc.
- Ser inerte con respecto a las sustancias presentes en la formulación de alimentos y no interferir en sus sabores.
- No ser tóxico por si mismo, ni producir sustancias tóxicas por descomposición o reacción.
- Ser estable y mantener sus características con el tiempo. 8
- No poseer propiedades carcinógenicas
En la práctica, no existe ninguna sustancia que satisfaga todas estas condiciones, lo que obliga, en algunos casos para
algunas
a limitar el uso de un edulcorante dado aplicaciones
o
recurrir
a
mezclas
de
edulcorantes, uso de aditivos, etc.
2 - Caracterización de los edulcorantes de uso extensivo: (Ishima y Kakayama, 1976)
2.1 - Sacarina:
Este compuesto es ácido y poco soluble en agua, por lo
que
normalmente
calcio.
Es
un
se
utiliza
producto
de
como
sal
síntesis.
de
sodio
Su
o
poder
edulcorante, referido a la sacarosa, varía de 200 a 700, dependiendo de la concentración (300 en sus usos más comunes).
La mayor limitación para su uso es su sabor amargo y metálico, muy difícil de enmascarar hasta la aparición del ciclamato. Asimismo, en los últimos años, el uso de 9
la sacarina se ha cuestionado duramente, por comprobarse que producía tumores malignos, en mezclas con ciclamato, prohibiéndose su uso en EE.UU. y Canadá.
Actualmente,
se
comercializa
en
Argentina,
Australia, Austria, Bélgica, Brasil, Francia, Holanda, Italia, Japón, México, Portugal, Sudáfrica, Reino Unido, EE.UU., España y Alemania.
2.2 - Ciclamato:
Normalmente se usa como sal sódica o cálcica, y es muy soluble en agua. El poder edulcorante referido a la sacarosa es de 30 en las concentraciones más utilizadas. La calidad del sabor es muy diferente al de la sacarosa, ya que además de estar acompañado de sabores agrio y amargo, tiene distintas velocidades de percepción y de duración de sabor. Es un producto de síntesis.
En
1969,
se
descubrieron
carcinogénicas de la ciclohexilamina,
las
propiedades
producto de la
metabolización del ciclamato, siendo prohibido su uso en EE.UU., Canadá y Reino Unido.
10
Actualmente se utiliza en: Argentina, Bélgica, Brasil,
Francia,
Italia,
Holanda,
Alemania,
México,
Portugal, España y Sudáfrica.
2.3 - Aspartame:
Presenta una solubilidad del 1% a 20ºC; se produce industrialmente
a
partir de aminoácidos por diversos
caminos. El poder edulcorante se encuentra entre 100 y 400, aunque a las concentraciones habituales varía entre 150 y 200.
Su sabor es muy parecido al de la sacarosa, hasta el punto que algunas personas prefieren su sabor al de la misma.
Es un edulcorante muy adecuado para una gran variedad de alimentos, debido a la sabor
con
la
sacarosa,
aunque
similitud de su debe
evitarse
su
utilización en los casos de cocción o calentamientos prolongados.
Actualmente está permitido en Argentina, Francia, Bélgica, Luxemburgo, Filipinas, Brasil y EE.UU.
11
2.4 - Acesulfame-K:
Es
la
sal
potásica
de
un
derivado
de
la
oxatiazinona. Tiene un poder edulcorante de 170 a 300. Presenta buen sabor y buenas propiedades de mezcla.
3 - Características edulcorantes del esteviósido:
3.1 - La Stevia rebaudiana Bert contiene en sus hojas, principios
edulcorantes
que
han
sido
reconocidos
y
utilizados por siglos por las poblaciones nativas que viven en la zona de origen de esta especie (Paraguay) (Sumida, 1980).
La
designación
de
esteviósido,
principio
edulcorante de la especie, se debe a los investigadores franceses Bridel y Lavielle que en 1931 cristalizaron el principio edulcorante y determinaron que es 300 veces más dulce que el azúcar, y que no posee efectos tóxicos al realizar pruebas de laboratorio con animales (Bridel y Lavielle, 1931).
12
Asimismo, se demostró que el esteviósido es el edulcorante encuentra
natural en
la
no
nitrogenado
naturaleza
y
más
que
dulce
está
que
se
compuesto
solamente de carbono, hidrogeno y oxígeno, siendo su formula C38 H60 O18.
En 1952 un equipo de investigadores americano del National Institute of Arthritis and Metabolic Diseases, dirigidos
por
el
Doctor
Hewit
y
Fletcher
jr.,
determinaron la estructura química del esteviósido; el que resultó ser un glucósido diterpénico con un aglycon denominado steviol (Mosetting y Nes, 1955).
Durante
la
década
de
1970,
investigadores
japoneses de las Universidades de Hiroshima y Hokkaido identificaron otros principios edulcorantes en las hojas de Stevia: Rebaudiósidos A, B, C, D y E, Dulcósidos A y B y otros de menor importancia. El rebaudiósido A es el que presenta el mayor grado de dulzor (aproximadamente 350-400 veces más dulce que el azúcar) y, es por ello que,
se
procura
seleccionar
individuos
con
altos
contenidos de este componente (Kohda, 1976).
3.2 - Propiedades físico-químicas del esteviósido de interés en el procesado de alimentos: (Fujita, 1979)
13
-Resistencia al calor: presenta estabilidad a las temperaturas habituales en el procesado de alimentos. Se funde a 238 º C.
-Alteración del color: no se observa oscurecimiento, aún en las condiciones más rigurosas de procesado de alimentos.
-Solubilidad: es altamente soluble en agua, alcohol etílico y metílico e insoluble en éter.
-Resistencia al ph: es suficientemente estable entre ph 3 a 9.
-Contenido de calorías: no es metabolizado por el organismo, por lo tanto se convierte en no calórico, y es adecuado para usos dietéticos.
-Capacidad osmótica: presenta buenas propiedades osmóticas para la preparación de pikles dulces (Japón).
-Fermentabilidad: no es fermentable, ni atacado por las bacterias orales. No es hidrolizable por Aspergilus níger, ni por el fermento seco de levaduras. Se hidroliza con ácido sulfúrico 14
diluido y por diastazas.
Otras propiedades:
Dentro de la medicina popular paraguaya se utiliza como
hipoglicemiante
(Miquel,
1977),
digestivo,
cardiotónico, diurético, antiácido, etc (Jordán Molero, 1984; Yang et al, 1979).
3.3 -
Propiedades edulcorantes: (Fujita, 1979)
La mayor parte de los autores coinciden en que el esteviósido es 300 veces más dulce que la sacarosa y el rebaudiósido A, 400. Pero debido
a las extraordinarias
características de potenciar su dulzura por la acción de diversas
sustancias
comunes
en
la
formulación
de
alimentos, tales como cloruro de sodio, leche, ácidos, etc., se puede fijar como valores razonables de poder edulcorante para la mezcla natural de glucósidos, un rango de 100 a 400, dependiendo de cada alimento.
3.3.1 - Calidad del sabor dulce:
Conjuntamente con el sabor dulce, el esteviósido presenta un sabor secundario, persistente, definido como 15
sabor
a
regaliz-mentol,
detectable
a
altas
concentraciones. Este sabor secundario es evidente en el extracto natural. El rebaudiósido A posee un sabor dulce más puro.
Este sabor no deseado se puede enmascarar con la utilización
de
edulcorantes.
combinaciones
Los mejores
de
otras
sustancias
resultados se obtienen con
sacarosa y glucosa, siguiéndoles la fructuosa, sorbitol y malitol.
Con respecto a la velocidad de percepción del sabor del esteviósido, se observó que la curva de intensidad percibida
en
función
del
tiempo,
tiene
una
gran
similitud con la correspondiente a la sacarosa en lo que respecta a la ubicación del máximo, pero presenta una diferencia en
la
duración
o
persistencia del
sabor,
siendo menor, aunque la similitud es superior a la de cualquier otro edulcorante actualmente utilizado.
Con el fin de suavizar la persistencia del sabor dulce, se obtienen buenos resultados con el agregado de fructuosa,
glucosa,
péptidos,
aminoácidos,
cítrico, acético, láctico, málico y tartárico.
16
ácidos
El
esteviósido
presenta
sinergismo
con
el
aspartame, sacarina, glucosa, fructuosa y muchas otras sustancias edulcorantes.
4 - Inocuidad del esteviósido:
La primera prueba de inocuidad del esteviósido es la utilización de las hojas de Stevia por los indígenas guaraníes durante varios siglos, y por los habitantes de Paraguay, hasta la actualidad, sin observarse efectos colaterales. Ya aislados los principios activos de la Stevia, comenzaron los ensayos de laboratorio con el fin de detectar posibles efectos toxicológicos. En 1931, Poniaret
y
Lavielle,
observaron
que
tras
la
administración subcutánea del mismo en cobayos, no se producían
afecciones
hemolíticas
ni
otros
efectos
tóxicos (Felippe, 1982).
En 1968, Plana y Kuc , informaron que suministrando una solución de esteviósido a ratas, se observaba una reducción
del
Posteriormente,
20
al
Persinos
30 y
%
de
Whistler,
la y
fertilidad. más
tarde,
Doffmmann y Nes demostraron que dicho efecto no se debía al
esteviósido
sino
al
dihidroesteviol,
compuesto
inexistente en las hojas de Stevia y producido durante 17
la
extracción
o
purificación
defectuosas
(Felippe,
1982).
En Japón, previo a la utilización masiva del esteviósido,
se
realizaron
rigurosos
ensayos
que
probaron su inocuidad. El Ministerio de Salud de Japón, coordinó
un
amplió estudio
en
el
cual
nueve
grupos
científicos estudiaron en forma independiente la acción del
esteviósido.
Por
unanimidad
se
concluyó
que
el
esteviósido, con un 90 % de pureza, no poseía actividad mutagénica
o
teratogénica,
coincidiendo,
además,
con
otros estudios realizados anteriormente (Fujita, 1979)
Por otra parte, se observaron efectos beneficiosos de esta sustancia en la prevención de caries dentales, no sólo por la disminución de azúcares en la boca, sino que,
además
se
demostró
que
el
mismo
inhibe
el
desarrollo de bacterias orales cariogénicas (Felippe, 1977; Sakaguchi y Kan, 1982).
5 - Utilización actual del esteviósido:
La rápida y amplia aceptación que ha tenido el esteviósido en Japón (consumo aproximado de 4000 ton/año (CEPEX,
1982)),
demuestra 18
significativamente
sus
potencialidades.
Se
debe
recordar
que
los
productos
edulcorantes que dominan el mercado mundial (sacarina, ciclamato), cuentan con serios cuestionamientos por sus propiedades
nocivas
para
la
salud
(Felippe,
1977;
Sakaguchi y Kan, 1982; Jordán Molero, 1984), y debe adicionarse el atractivo que, en la actualidad, para la opinión pública, tiene el origen natural y edulcorante del esteviósido.
Además del Japón otros países del Lejano Oriente donde se produce el esteviósido son Corea del Sur y Taiwan (CEPEX, 1982).
En Latinoamérica su consumo es habitual en dos países. En Paraguay se utiliza, en hojas, desde siempre, y desde 1988 en Brasil, ya que en Maringá (Paraná), se comenzó la industrialización del mismo (Marcavillaca y Divo de Sesar, 1993).
Países
interesados
en
la
producción
y/o
industrialización de Stevia rebaudiana Bert., incluyen a Alemania,
Canadá
y
necesitarán grandes
EE.UU.,
lo
cantidades
abastecer la demanda.
19
que
implica,
de materia
que
se
prima para
Actualmente los usos más destacados del esteviósido son
en:
bebidas,
gomas
de
mascar,
helados
y
cremas
heladas, alimentos de bajo contenido calórico, pikles, salsas
y
otros
productos
de
sabor
delicado
(CEPEX,
1985).
6 - Formas de comercialización: (CEPEX, 1982)
En
el
mercado
japonés
se
encuentran
muchos
productos a base de esteviósido o extracto purificado de stevia, comercializados bajo diversas denominaciones o marcas
comerciales.
En
su
composición
únicamente
participan compuestos de origen natural, considerándose que puede satisfacer las necesidades de cualquier tipo de producto alimenticio.
7 - Otros campos de aplicación: (CEPEX, 1982)
En el caso de que la sustitución del azúcar por el esteviósido
se
hiciere
con 20
vistas
únicamente
a
una
disminución
de
costos,
la
proporción
recomendada
es
sustituir el 30 % de la sacarosa, ya que así se obtiene el
máximo
de
sinergismo,
sin
que
se
note
el
sabor
característico del esteviósido.
8 - Mercado mundial de edulcorantes: (CEPEX, 1989)
La situación presentada por el mercado mundial de edulacorantes de alto poder ha presentado muchos cambios fundamentales cuestionamientos
debido a
que
a
las
fueron
prohibiciones sometidos
los
o más
importantes, y a que los efectos indeseables tuvieron diversa incidencia en los distintos países.
A continuación se analizará la situación aproximada del mercado para fines de la década de 1980.
8.1 - Sacarina:
Es el edulcorante más utilizado. El consumo y la producción puede ser desglosado de la siguiente manera: 21
Consumo(kg/año)
Producción(kg/año)
EE.UU.
3.500.000
2.270.000
Europa
2.000.000
-
Japón
800.000
2.800.000
Otros
2.700.000
3.930.000
Total
9.000.000
9.000.000
El precio actual de la sacarina sódica en EE.UU. es de 8,42 U$S/kg.
8.2 - Ciclamato:
Antes de su prohibición en EE.UU., se había constituido en el edulcorante más utilizado en volumen, ya que solamente en EE.UU. su producción había alcanzado los
9.500.000
kg/año.
En
la
actualidad,
se
sigue
produciendo en dicho país, pero en una escala reducida y para exportación. No se conoce el consumo mundial. El consumo en Europa alcanzó los 1.300.000 kg en 1982. Su precio fue de 9,90 U$S/kg.
8.3 - Aspartame: 22
Se considera que su producción aproximada fue de 1.000.000 kg, en 1983. Este volumen es considerable, teniendo en cuenta que la aprobación de uso era muy reciente, y con muchas limitaciones, en EE.UU., Gran Bretaña, Francia, Bélgica y otros países. Su precio en dicho año fue de 152 U$S/kg.
8.4 - Esteviósido:
En Japón, en 1979, la producción y consumo fue de 140.000 kg, aunque se consideraba que en dicho año el mercado japonés podía absorber 1.400.000 kg, equivalente al 10 % del consumo de sacarosa en poder edulcorante. En ese
mismo
año
aproximadamente
la
700.000
producción kg,
mundial
incluyendo
era
Japón,
de
China
Popular y Corea. No se cuenta con información oficial respecto a precios, pero se estima en alrededor 120 U$S/kg (Marcavillaca, comunicación personal).
9 - Perspectivas del esteviósido:
9.1 - Mercado mundial:
23
El mercado total de edulcorantes de alto poder y bajo contenido calórico, es equivalente a entre 12 a 15 millones de kg de esteviósido por año. La conquista de una
pequeña
fracción
de
este
volumen,
por
el
esteviósido, representaría cifras significativas.
Teniendo edulcorantes
en
que
cuenta
que
dominan
los
el
tres
productos
mercado
mundial,
especialmente en los países occidentales, cuentan con serios cuestionamientos por sus propiedades nocivas para la
salud,
las
posibilidades
del
esteviósido
como
sustituto de los mismos son buenas, presentándose como su principal limitación la imposibilidad de provisión de materia entrar
prima a
en
tan
gran
competir
en
industrializado,
deberá
escala.
pasar
el por
Además, mundo todas
antes
de
occidental las
pruebas
previas a su aprobación, especialmente las de la Food and Drug Administration de EE.UU. En este organismo, se encuentra actualmente en los próximos 10 productos en ser aprobados (Marcavillaca, comunicación personal).
10 - Evolución histórica: (Marcavillaca y Divo de Sesar, 1993)
1887- Se tuvo la primera referencia de la especie, llegando la noticia al naturalista Dr. Moisés Bertoni, a 24
través de mineros e indios de la región de Caaguazú y Monday de la República del Paraguay.
1899- El Dr. Bertoni describe a la planta como Eupatorium.
1900- El químico paraguayo Ovidio Rebaudi, realiza los primeros estudios del componente dulce de la hoja.
1904- Bertoni verifica que la planta pertenece al género Stevia.
1905- Se registra como Stevia rebaudiana Bertoni en los libros internacionales.
1908- Juan B. Aranda Jiménez en Puerto Bertoni-Alto Paraná, realiza el primer cultivo extensivo, obteniendo 1000 kg/ha de hoja seca. P. Rasennack (Alemania) realiza los
primeros
análisis
químicos
y
cristaliza
el
componente dulce de la hoja.
1909- Karl Dietrich (Alemania) aísla dos sustancias dulces de la muestra enviada por Aranda Jimenéz y las denomina eupatrina y rebaudina.
25
1913- Aranda Jimenéz envía muestras a Europa a los laboratorios de Amberes, Wiesbadenn y Hamburgo, donde se aíslan también los mismos compuestos.
1915- Kobert considera a la eupatrina como una saponina y concluye que existen dos tipos: una ácida y otra neutra con propiedades hemolíticas.
1919- Se envían muestras a la Facultad de Agronomía y
Veterinaria
de
la
República
Argentina,
donde
se
realizan análisis y estudios de las hojas, llegándose a la conclusión que se trata de una especie de alto valor económico por su poder endulzante.
1921- El Dr. Bertoni pide que el cristal denominado eupatorino sea designado con un nombre que recuerde el género de la planta, para lo cual propuso stevina y la Unión
Internacional
de
Química
lo
adoptó
como
esteviósido.
1931-
Bridel
y
Lavielle,
químicos
franceses,
cristalizan el esteviósido con un 6 % de rendimiento y determinaron que su poder endulzante era 300 veces mayor que
el
azúcar
de
caña
y
rectificaron
quedando finalmente en C 38H60O18. refutan
el
trabajo
de
Kobert, 26
Pomaret
la y
demostrando
fórmula, Lavielle que
el
esteviósido no tenía relación con la saponina y que la propiedad
hemolítica
era
debido
a
las
impurezas
presentes, además encontraron que el esteviósido no es asimilado por el organismo, siendo eliminado en su forma original.
1942- Es publicado en Inglaterra un artículo que presenta al esteviósido como sustituto del azúcar.
1945- El Instituto Biológico Argentino ensaya y obtiene algunos preparados para diabéticos.
1946- Una expedición encabezada por Aranda Jimenéz, contratada
por el Servicio Técnico
Interamericano de
Cooperación Agrícola, se dirigió al lugar de origen en la zona de Amanbay y llegó a traer 780 plantitas que plantaron en el Instituto Agronómico de Caacupé.
1951- Nuevamente, Aranda Jimenéz y Arturo Florentín del Ministerio de Agricultura y Ganadería recolectaron en el mismo lugar, 350 plantas, que plantaron en el Colegio de Agricultura "Mariscal Estigarribia" de San Lorenzo.
1952- The National Institute of Arthritis and Metabolic
Diseases
en
Bethesda, 27
Maryland,
EE.UU.,
estudia la estructura química y hace investigaciones con el esteviósido.
1953- El Dr. Miguel Ovidio de Paraguay, concluye un estudio
sobre
el
esteviósido
y
su
efecto
sobre
la
glucemia.
1954- El químico inglés F. Bell después de varios estudios
describe
al
esteviósido
como
el
único
edulcorante, comparado con los demás conocidos.
1959- Se planta en el Jardín Botánico de Río de Janeiro la especie, y en el mismo año el botánico José Correa
Gomez
lleva
nuevas
plantas
desde
Paraguay al
Instituto de Botánica de San Pablo. Durante la década del 50 se realizaron numerosos estudios en los distintos laboratorios
del
mundo
despertando
gran
interés
el
edulcorante presente en Stevia.
1961- Luis Enrique De Gásperi inicia un cultivo extensivo
en
Horqueta
(Concepción),
con
plantitas
multiplicadas en la zona de Capitán Bado.
1962- Ángel Gonzaléz Aranda y Hnos. en la Colonia Ex-Combatientes
de
Horqueta
(Concepción),
instala
un
vivero y cultivo extensivo con plantitas traídas de la 28
zona de Capitán Bado, lugar denominado Cerro Cuatía, sobre el arroyo Taracá
1963- Ruddat, Lang y Mosetting, encontraron que el steviol ejerce la misma función que la Giberelina A 3.
1966- Se inicia en Paraguay la venta de ka´á-he´é en forma natural bajo la denominación de "Dulce té del Paraguay" del señor De Gasperi. Se registra la Patente de Invención al señor De Gásperi sobre "Utilización de Ramas y Tallos de Stevia" y otra sobre "Extracto de la hoja".
1967- Se inicia la investigación de la stevia en Kosakoka, Japón, con muestras llevadas desde Paraguay. Von
Schmelling estudió
el
método
de
aislamiento
del
esteviósido y su uso como edulcorante no calórico.
1969- Sumida lleva la especie al Japón y Tayomenka Kaisha Ltda. empezó a investigar sobre muestras enviadas del Paraguay por Akira Suggi donde identificaron otra sustancia,
el
rebaudiósido.
El
prof.
Derek
Bonton
(Premio Nobel de Química) en el Colegio Imperial de Ciencia y Tecnología de Londres expone un trabajo sobre stevia.
29
1970- Los japoneses llevan nuevas plantas al Japón y la industrial Química Shuda comienza el cultivo y la investigación. La Compañía Tamasei
inicia el cultivo
experimental en chacras del Ministerio de Salud. Carlos Oviedo,
paraguayo,
hipoglicemiante investigaciones
concluye un estudio de
con
la
sobre "Acción
Stevia".
stevia
en
Brasil,
Se
inician
en
distintos
institutos.
1971- El Ministerio de Agricultura y Producción Acuática del Japón inicia el cultivo experimental de stevia. Haku Miura de la Universidad de Hokaido comienza la investigación y el análisis de la planta. La firma Química
Industrial
comercialización
del
Shuda
realiza
producto
con
la el
primera
nombre
de
"Steviarol". En la colonia japonesa Yguazú se realizan trabajos de investigación de Stevia rebaudiana Bertoni.
1972- La Compañía Química Tamasei obtiene el primer éxito
en
el
Japón
en
la
comercialización
del
esteviósido.
1973- Se inicia el cultivo experimental de la stevia
en
las
50
dependencias
del
Ministerio
Agricultura del Japón en las distintas zonas del país.
30
de
1974Paraguay,
Isao
instala
Ohira, un
en
vivero
Pedro e
Juan
inicia
Caballero, un
cultivo
extensivo de stevia. La Cía. Química Tamasei registra como marcas comerciales "Stevicus y Steviosin".
1975- En Japón se organiza una organización de la stevia,
formada
por
las
Química
Nikkon,
Celulosa
compañías Yamasaki
Shuda,
Tamasei,
Kokokiku,
Química
Ikeda, Kosho Kagaku y otras para realizar todos los estudios
sobre
el
cultivo,
la
industrialización
y
comercialización del esteviósido.
1976- En Paraguay, aparece la marca "Pirungá" del señor Ángel González para la venta de la yerba dulce en todas
sus
Salud.
En
formas, el
autorizados 6º
Congreso
por
el
Ministerio
Latinoamericano
de de
Farmacología, realizado en Buenos Aires, se presentan los
siguientes trabajos preparados por
el
Centro
de
Investigación de la Stevia en San Pablo: "El efecto inductor de la pérdida de peso corporal y la obesidad" y "Los efectos antiarrítmicos reguladores del corazón". La Dra. Gila Anmaral de Von Schmellings en la 28º. Reunión Anual
para
trabajo
el
"Stevia
progreso
de
rebaudiana
la
Ciencia,
Bertoni
y
presenta sus
el
efectos
hipoglicemiantes en conejos alexamizados", corroborando el
efecto
antidiabético
de 31
la
planta.
Se
inicia
la
primera reunión general de la Sociedad de la Stevia en el Japón. Ishima y Katayama, experimentan mezclas con diversos
azúcares
y
esteviósido,
obteniendo
buenas
respuestas y/o resultados en sabor en relación con la fructuosa. Se crea en San Pablo, Brasil, el Centro de Investigaciones
de
la
Stevia.
Se
incrementa
la
producción en otros países del Sudoeste Asiático (Corea, Taiwan, Filipinas, Indonesia y Malasia).
1977- La Compañía Química Shuda, obtiene el registro
del
exportación
producto
masiva
de
rebaudiósido. hoja
seca
de
Se
inicia
Ka´a-he´e
la
desde
Paraguay a Japón.
1978- Se incorpora a la Sociedad Química Maruzen, Química Vegetal Zyomu. En un estudio realizado por la Sociedad de la Stevia del Japón, se demostró que no es tóxica, que no afecta al embarazo y el efecto negativo anticoncepcional. ácidos tartárico,
Maruzen
Kasei
S.A.
revela
láctico, cítrico, acético
que y
los
málico
disminuyen el efecto residual del esteviósido.
1979- Se inicia la provisión masiva de hoja al Japón proveniente de Taiwan, Corea, Filipinas y otros países. Farmacia
El y
Dr.
Mauro
Alvarez
Bioquímica de
la 32
del
Departamento
Universidad
de
de
Maringá-
Brasil, obtiene una metodología para la extracción y cristalización del esteviósido. Se crea la Cooperativa de
Productores
de
Ka´á-He´é
Ltda., para el
fomento,
producción y comercialización de la especie en Paraguay. En la Universidad de California, en Davis, Clinton C. Shock realiza investigaciones con semilla
llevada
de
Paraguay.
1980- Una misión oficial de la Cooperativa de Productores de Ka´á-He´é de Paraguay, con el apoyo del Ministerio de Agricultura y Ganadería viajan al Japón, a fin de investigar el cultivo y su industrialización. Se incorporan Química
la
Compañía
Industrial
Gran
Farmacéutica Japón
INKI
Oriental a
la
y
la
Sociedad
Japonesa de Stevia. La producción de Japón llega a 60 toneladas de hoja. Por decreto Nº 15.595 del 5 de mayo de 1980, la Cooperativa de Productores de Ka´á-He´é del Paraguay obtiene la personería jurídica y es inscripta bajo el Nº 163 de Cooperativismo del M.A.G. que está regulada por la Ley 349/72 y por el Decreto Nº 27.348 que lo reglamenta.
1981- Se incorporan las Compañía Fuji Furu, Química Industrial Kyosui y Kokubum a la Sociedad. Se inicia el estudio
sobre
aspectos
crónicos
a
largo
plazo
del
esteviósido. Se realiza el Primer Seminario Brasilero 33
sobre Stevia, organizado por el Instituto de Tecnología de Alimentos (ITAL). Se instala un vivero en la Colonia Pte. Stroessner-Alto Paraná, Ruta internacional Nº 7 km 28.
1982- Se instala el Vivero La Fortuna en el km 296 de la Ruta Internacional Nº 7 (Colonia Pte. StroessnerAlto
Paraná),
promoción
del
con
variedades
cultivo
en
mejoradas
dicha
zona.
y Se
se
inicia
inicia
el
Segundo Seminario Brasilero de la Stevia organizado por ITAL.
El
Ministerio
resolución
de
23/05-02-82,
Agricultura declara
de
y
Ganadería
interés
para
por el
desarrollo agrícola al ka´a-he´e y el fomento de su cultivo. Se instala una planta piloto de extracción del esteviósido Brasil.
en
Shoch,
la
universidad
Clinton
Estadual
(EE.UU.),
de
expresa
Maringá, que
los
compuestos químicos de la especie de mayor interés son el esteviósido y el rebaudiósido A, aunque existan otros seis componentes dulces.
1983- Se realiza el Primer Simposio Nacional de la Stevia en Asunción-Paraguay, organizado
por la Coop.
Productores
producción
de
la
especie.
Inicia
su
la
planta piloto instalada en la Universidad de Maringá con 10
kg/día
de
esteviósido.
Francisco
Jordán
Molero,
introduce en el Instituto Agronómico Nacional de Caacupé 34
una
colección
de
plantas
procedentes
de
distintos
lugares del Paraguay y del Brasil.
1984- Finaliza los estudios la Sociedad de Stevia del Japón, concluyendo que el edulcorante es apto para el consumo humano sin efectos colaterales. La Dra. Laura Fracchia del I.N.T.N. de Paraguay, obtiene un método de cristalización del esteviósido en el laboratorio de la Institución.
1985- En el Instituto de Fisiología de I.N.T.A.Castelar, el Ing. Agr. Manuel C. Marcavillaca inicia sus estudios sobre la acción giberélica de stevia y realiza ensayos sobre propagación vegetativa de la especie.
1986- INGA Stevia Industrial S.A. (Brasil) empresa formada
para
comercial
de
la la
explotación stevia,
agrícola, firma
industrial
contrato
con
y la
Universidad Estadual de Maringá y el Banco Do Brasil, para
la
explotación
de
la
licencia
y
patente
del
esteviósido a nivel industrial. El Ministerio de Salud del
Brasil,
autoriza
el
uso
del
esteviósido
como
edulcorante natural en alimentos y bebidas dietéticas. Se realiza el Tercer Seminario Brasilero, organizado por ITAL. La empresa Phoenix Agrícola S.A. del Paraguay en su
planta
piloto
llega
a 35
la
cristalización
del
esteviósido,
rebaudiósido
y
separa,
con
tecnología
nacional la clorofila.
1987- Se constituye la Sociedad Fortuna Stevia del Paraguay
S.R.L.,
empresa
dedicada
a
la
promoción,
cultivo, acopio, industrialización y comercialización de Ka´á-He´é que, con tecnología propia elabora el extracto acuoso de la hoja. El Ing. Agr. Marcavillaca (Argentina) logra las primeras plantas de stevia micropropagadas e integra ensayos en laboratorio y a campo con el objetivo de
establecer las
condiciones
óptimas
de
manejo del
cultivo.
1988- INGA Stevia Industrial S.A. inaugura la primera industria en Occidente el 8 de agosto de 1988 en Maringá-Brasil,
con
una
capacidad
instalada
de
9
toneladas por día de procesamiento de hoja, y que en la primera fase solamente utilizará 3.000 kg/día, por falta de materia prima, obteniendo un rendimiento del 10 % en esteviósido.
1993-
Se
incorpora
el
esteviósido
al
Código
Alimentario Nacional (Resolución 101 del 22 de febrero de 1993).
36
11 - Caracterización de la
Stevia rebaudiana Bert.:
11.1 - Origen y distribución:
La mayoría de los estudiosos admiten que el ka´á-he ´é es una planta auténticamente paraguaya, originaria de la Región Oriental del país, donde era utilizada por los indios como edulcorante y para fines medicinales (Shock, 1982).
Según distintas fuentes se encuentra desde las sierras del Mbaracayú, Campos Altos del Amambay hasta el Monday, zonas de San Pedro, Capitán Bado, Yhú, Bella Vista, San Salvador, Vacá Retá, entre el río Ypané e Ybyraró, próximo al Cerro Cuarepotí, en Itacuí y en Campos
de
encuentra
Cerro entre
Departamentos
de
Cuatía 22-26º
(Shock, sur
Amambay,
y
1982). 54-57º
Concepción,
La
región oeste.
San
se Los
Pedro,
Canendiyú, Alto Paraná y Caaguazú estarían representados en la zona mencionada. Otros autores indican que la planta es autóctona de las fronteras del Paraguay con Brasil (Pagliosa, 1982) encontrándose en el suroeste del Brasil en la región de Amambay, división del Paraguay con Matto Grosso do Sul. ha sido colectada en Ponta Porá (Felippe, 1982). Monteiro (1982) menciona estudios de 37
especies brasileñas de Stevia y su interrelación con el ka´á-he´é y de revisión taxonómica - morfológica de la serie Multiaristatae de Stevia en Brasil. Sumida (1980) observa que Stevia crece naturalmente o es cultivada en los distritos de Amambay e Iguazú, frontera de Brasil, Paraguay y Argentina (latitud 25ºS). Se ha naturalizado en todo el Noreste Argentino. Se cultiva en Brasil en Santa Catarina, Paraná, Sao Paulo, Matto Grosso do Sul y Goias; en Paraguay en el Alto Paraná, Horquetas, Pedro Juan Caballero, Capitán Bado, Quiindy, Coronel Oviedo y la región del Chaco.
Actualmente Japón, China, Brasil y Paraguay parecen ser
los
principales
productores.
Del
Japón
se
ha
extendido a todo el sudeste asiático (Jordán Molero, 1984).
11.2 - Descripción botánica:
Stevia rebaudiana Bert. (yerba dulce), es una planta arbustiva originaria
del noreste
de Paraguay,
perteneciente a la familia de las compuestas, que crece en estado silvestre en forma de planta aislada. Fue descripta
botánicamente
en
38
1905,
por
el
naturalista
Moisés Santiago Bertoni, como una planta herbácea de 40 a 80 cm de altura.
La raíz es fibrosa, filiforme y perenne, formando abundante
cepa que
distribuyéndose
apenas
cerca
de
ramifica y
la
no
superficie;
profundiza, es
el
único
órgano de la planta que no contiene el esteviósido (De Vargas, 1980). En plantas que se propagan asexualmente por pedazos de tallos en arena gruesa, se ha observado abundante (1980)
ramificación
observó
que
del
las
sistema
raíces
radicular.
finas
Sumida
abundan
en
la
superficie y las gruesas en las zonas más profundas del suelo.
El
tallo
es
anual,
subleñoso,
más
o
menos
pubescente, con tendencia a inclinarse, es más o menos ramificado.
Durante
su
desarrollo
inicial
no
posee
ramificaciones, tornándose multicaule después del primer ciclo vegetativo llegando a producir hasta 20 tallos en 3
a 4
años.
En condiciones óptimas, el tallo puede
llegar hasta un metro y medio de altura (Sagakuchi, 1982).
Las
hojas
son
elípticas
oval
o
lanceoladas,
pequeñas, simples; borde o margen dentado; a veces en
39
verticilos; algo velludas. La hoja es el órgano con mayor contenido del edulcorante (C.C.N., 1980).
Una planta tarda más de un mes en producir todas sus flores. En Paraguay florece en octubre, diciembre y marzo pero se clasifica como una planta de día corto, situando el fotoperíodo crítico en 12 - 13 horas según el
ecotipo.
blanquecina, axilares,
La
flor
en
capítulos
agrupados
es
en
hermafrodita pequeños
panículas
pequeña
y
terminales
o
corimbosas
(Shock,
1982).
La polinización es entomófila; se dice que la planta
es
autoincompatible
(protandria)
de
tipo
esporofítico y clasificada como apomíctica obligatoria (Monteiro, 1982).
El fruto es un aquenio que es diseminado por el viento. Se clasifica en: claro estéril, oscuro fértil y oscuro estéril (Gattoni, 1945).
El género Stevia tiene más de 100 especies en el continente Stevia
americano,
rebaudiana
de
Bert.
donde es
la
es
originaria,
única
especie
pero con
principios edulcorantes en las hojas (Grashoff, 1972).
40
En el Paraguay es conocida con su denominación: Ka'áHe'é, que significa yerba dulce en español.
11.3 - Ecotipos:
Esta
especie
presenta
numerosos
ecotipos.
Mitsuhashi (1975), seleccionó 28 ecotipos diferentes. Para
diferenciarlos
se
basó
principalmente
en
sus
características morfológicas. Al determinar el contenido de esteviósidos estos variaron entre 2,07 y 18,34 %. Sumida (1980) describe una serie de experimentos donde 22
variedades
de
Stevia
rebaudiana
Bert.
fueron
estudiadas para correlacionar, varias características de la
planta
con
características contenido.
la
heredabilidad.
morfológicas
y
6
Se
observó
características
De estas 17 características,
11 de
solamente el
peso seco de hojas mostró una baja correlación con la heredabilidad. morfológicas principios
Sumida, y
de
activos,
concluyó, contenido, tienen
evidente.
11.4 - Citología:
41
que
características
principalmente
efecto
de
seleccionador
Observaciones de Brucher (1974), revelan que la planta es diploide, conteniendo 22 cromosomas.
Estudios de poliploídia fueron realizados por Brucher (1974), por Utsunomiya (1977) y Sato y Kawakami (1975).
Estos
variedades resultar
de un
últimos alta
buen
investigadores
calidad.
método
para
La
obtuvieron
poliploídia
obtener
puede
aumentos
de
productividad en términos de masa foliar y contenido de principio activo, reduciendo el área plantada y por ello los costos (Handro, 1984).
11.5 - Clima:
La región donde crece el ka´a-he´e es subtropical, semihúmeda, con 1.400 a 1.800 mm. de lluvia, que se distribuyen
regularmente
durante
todo
el
año
y
temperaturas extremas de -6º a 43ºC, con promedio de 24ºC.
Según
Sakaguchi
(1982)
la
temperatura
más
apropiada para Stevia es de 15 a 30ºC con un límite inferior de -3ºC. Soporta medias mínimas de 5ºC.
42
La habilidad para resistir inviernos, aparentemente es determinada por la temperatura del suelo. La amplitud crítica está entre 0 a 2ºC. Mudas de 5 cms. con 10 hojas soportaron
temperaturas
(Sagacuchi,
1982),
potenciales
de
extenderse
a
lo
de que
producción
latitudes
-5ºC
por
70
implica
que
de
especie
la
mayores.
En
minutos
las
nuestra
áreas podría
facultad
existe una pequeña parcela, con 50 plantas desde hace aproximadamente 2 años. Durante el invierno su parte aérea se seca, rebrotando desde la base en primavera.
La planta resiste la humedad pero no la sequía, y esto puede explicarse por la morfología de su sistema radicular.
Desarrolla mejor donde la estación de crecimiento es
larga,
donde
la
intensidad
de
luz
es
alta,
con
temperaturas tibias, riesgos mínimos de heladas luego de la
brotación
fotoperíodos entrenudos,
y
sin
largos área
períodos
de
aumentan
la
foliar,
peso
larga
sequía.
longitud
seco
y
de
aceleran
Los los la
aparición de hojas. La materia seca se reduce a la mitad con fotoperíodos, de días cortos. Azúcares, proteínas y esteviósidos aumentan tanto en valores absolutos como relativos en días largos (Sagacuchi, 1982).
43
Para la producción de mudas (propagación) es necesario temperaturas por sobre los 15ºC.
11.6 - Suelos:
Se la puede cultivar en suelos muy variados. En su estado natural, la planta crece en suelos tanto de baja fertilidad, ácidos, de tipo arenoso como hasta orgánicos y
con
alta
humedad
(Shock,
1982).
Algunos
autores
recomiendan tierras areno-arcillo-humífera-ferruginosa o simplemente arena humífera. Se desarrolla bien en suelos colorados del Alto Paraná. La tierra ideal es la arenoarcillosa con regular proporción de humus. Se adapta bien a suelos arcillosos con buen drenaje, no así a lugares con exceso de humedad. Prospera bien en suelos de desmonte, no así en tierras recién desmontadas, con mucha materia orgánica, por problemas de enfermedades (C.C.N., 1980). La planta crece naturalmente en suelos de ph 4-5, pero crece bien entre 6.5-7.5 siempre que no sean salinos (Shock, 1982).
12 - Características agronómicas:
44
Stevia rebaudiana Bert. es una especie semiperenne que en cultivo puede durar entre 5 y 6 años, con 2 o 3 cortes anuales; el rendimiento anual de hoja seca en Paraguay oscila entre 1500 y 2500 kg/ha, en condiciones de secano y alrededor de 4300 kg/ha con riego (Jordán Molero, 1984).
En Japón, en 1 o 2 cosechas por año, el rendimiento de hoja seca varía entre 3000 y 3500 kg/ha en el primer año, 4000 a 4500 kg/ha en el segundo, 4000 a 6000 kg/ha en el tercero, disminuyendo a 4000 kg/ha en el cuarto (Sumida, 1980).
Según distintos autores la densidad de plantación puede variar entre 20.000 a 400.000 pl/ha, en hileras sencillas, dobles o triples. Altas densidades, reducen el desarrollo de ramas laterales y el rendimiento en peso seco por planta, aumentando el número de plantas muertas luego de la cosecha y las dificultades en la misma (Sakaguchi, 1982).
Se estima que la densidad optima de 88000 pl/ha, se da a distancias de 75 cm entre hileras y 15 cm dentro de la misma (Jordán Molero, 1984).
45
12.1 - Propagación sexual de Stevia rebaudiana (Bert):
Se reproduce sexualmente por aquenios, observándose alta heterogeneidad en las poblaciones resultantes. La planta es de polinización cruzada y gran parte de sus aquenios
son
estériles;
son
livianos
y
de
fácil
dispersión por el viento. La floración no es uniforme, lo mismo que la maduración de la semilla, siendo la recolección lenta y difícil. Para mejorar la calidad de las semillas se recomienda incorporar apiarios en la plantación. El porcentaje de germinación varia entre 10 y 38 %. La longevidad de los aquenios es corta y ya a los 4 meses el potencial de germinación se reduce un 4070 %, después de 8 meses es casi nulo. Las semillas deben guardarse en condiciones de baja humedad, baja temperatura,
preferentemente
en
la
oscuridad
y
en
envases herméticos (Felippe et al., 1971; De Vargas, 1980; Sagakuchi et al., 1982; Jordán Molero, 1984).
12.2 - Propagación vegetativa de Stevia rebaudiana (Bert):
Esta especie puede propagarse vegetativamente por separación
de
hijuelos.
Este
46
método
sólo
puede
utilizarse para pequeñas plantaciones, ya que el número de mudas producidas es reducido.
En la base del tallo, o bajo tierra, en la primavera temprana aparecen pequeños vástagos, muchos con
sus
respectivas
raíces
que
pueden
separarse
y
plantarse en el lugar definitivo (Jordán Molero, 1984).
Otra forma de propagación vegetativa es a través de estacas; método que convenientemente ajustado podría ser usado a escala comercial.
Diferentes autores obtuvieron respuestas variables al utilizar estacas apicales o subapicales, con diversos sustratos, en distintas épocas del año y al incluir tratamiento rizogénico (Felippe, 1977; De Vargas, 1980; Sumida, 1980; Shock, 1982; Jordán Molero, !983 y 1984).
El cultivo de tejidos es otro método de propagación vegetativa uniformes,
que
permite
obtener
plantaciones
más
además de la rápida multiplicación clonal
(Yang, 1979 y 1981; Marcavillaca, 1985).
Marcavillaca et al (1993) proponen la combinación de macro y micropropagación; las plantas micropropagadas se utilizan como banco de plantas madres y en sólo 3 47
ciclos
de
multiplicación
macropropagación), se
(1
de
lograría a
micro
y
partir de
2
una
de sola
planta, material para cultivar 3 ha (225.000 plantas).
13 - Propagación vegetativa:
La
historia
de la
caracterizado
por
avanzada
facilitan
que
el
producción vegetal
desarrollo y
de
optimizan
se
tecnologías la
ha de
propagación
vegetativa. La posibilidad de controlar el ambiente (uso de nieblas, calefactores, termostatos, serenos, etc), amplia el espectro de especies que pueden seleccionarse y multiplicarse de esta forma (Marsden, 1955).
La propagación vegetativa o asexual se utiliza para producir una planta que posea el mismo genotipo que la planta madre (planta donadora) y esto es posible porque todas las células de una planta poseen la información necesaria
y/o
suficiente
para
reproducir
la
planta
entera (Hartmann et al., 1992).
En la multiplicación por estacas solo es necesario que
un
nuevo
sistema
de
raíces
adventicias
se
desarrolle, ya que la estaca posee yemas con aptitud
48
potencial para desarrollar nuevos vástagos (Hartmann et al., 1992).
Las raíces adventicias son de dos tipos: raíces preformadas y raíces de herida (inducidas). Las raíces preformadas se forman naturalmente durante los primeros periodos de desarrollo
del vástago, pudiendo emerger
antes de la realización de estacas o permaneciendo en dormición
hasta
colocadas
en
que
se
condiciones
realicen
las
ambientales
mismas
y
sean
favorables.
Las
raíces de herida desarrollan sólo después que la estaca es cortada, por efecto de la herida producida en la preparación de la misma. como
formadas
de
novo
Estas raíces, son consideradas (nueva
formación)(Davies
y
Hartmann, 1988).
Cuando se prepara una estaca, las células más cercanas a la superficie son lesionadas y expuestas, comenzando la respuesta de cicatrización de la herida (Cline y Neely, 1983). En el proceso de regeneración de raíces, ocurren los siguientes tres pasos:
- A medida que las células externas, lesionadas, se mueren, se forma una lámina necrótica que sella la herida con un material suberoso y se 49
tapona el xilema con gomas. Esta lámina ayuda a proteger la superficie del corte de desecamientos y patógenos.
- Por detrás de la lámina, células vivas comienzan a dividirse después de algunos días y una capa de células parenquimatosas (callo), forma una peridermis.
- Ciertas células, en la vecindad del cambium vascular y floema, comienzan a dividirse e inician la formación de raíces adventicias.
13.1 - Bases fisiológicas de la iniciación de raíces adventicias:
Varias clases de reguladores de crecimiento, tales como
auxinas,
inhibidores,
cytokininas, como
el
giberelinas
ácido
abscísico
y y
etileno
e
fenólico,
influyen sobre la iniciación de raíces. De ellas, la auxina
es
la
que
tiene
el
mayor
efecto
sobre
la
formación de raíces en estacas (Hartmann et al., 1992).
50
13.1.1 - Efecto de las hojas sobre el enraizamiento: (Hartmann et al., 1992)
Es ampliamente conocido que la presencia de las hojas
en
la
estaca,
ejerce
una
fuerte
influencia,
estimulando la iniciación de raíces.
La traslocación de carbohidratos desde las hojas sin
duda
contribuye,
a
la
formación
de
raíces,
sin
embargo, la mayor promoción del enraizamiento por efecto de las hojas y yemas, es posiblemente resultado de otros factores más directos (Breen, 1974). Hojas y yemas, son conocidas como poderosos centros productores de auxinas, y los efectos son observados directamente por debajo de ellos, demostrando el transporte polar, desde el ápice a la
base.
Estacas
de
ciertas
especies son
fácilmente
enraizadas, mientras que estacas de otras enraízan con mayor dificultad.
13.1.2 - Fotosíntesis de las estacas:
La
fotosíntesis
de
las
estacas
no
es
un
requerimiento absoluto para la formación de raíces. Esto puede ser observado en estacas con muchas hojas, que se llevan
a
un
sitio
oscuro 51
y
con
estacas
deshojadas
(nofotosíntetizantes),
que
enraízan
(Davis
y
Potter,
1981). Pero puede generalizarse que, la fotosíntesis en estacas, es probablemente más importante después de la iniciación
de
raíces
y
ayudaría
en
el
desarrollo y
crecimiento más rápido de las raíces (Davis, 1989).
13.2 - Factores que afectan la multiplicación por estacas:
13.2.1 - Diferencias entre plantas individuales procedentes de semilla:
Al enraizar estacas tomadas de plantas individuales de
una
especie,
semillas, existir
la
que
de
experiencia
amplias
ordinario ha
se
propaga
demostrado
diferencias entre estacas
que
por
pueden
tomadas
de
ellas (efectos y/o variabilidad del genotipo )(Hartmann et al., 1992).
13.2.2 - Diferencias entre las zonas apicales y básales de la rama: (Hartmann et al., 1992) 52
En la composición química de las ramas hay marcadas diferencias
de
la
base
a
la
punta.
En
las
estacas
tomadas de distintas partes de las ramas en ocasiones se observa variabilidad en la producción de raíces y en muchos casos el mayor porcentaje de enraíce se obtiene en estacas procedentes de la porción basal de la rama.
Puede ocurrir que en tallos de un año o más de edad, los carbohidratos se hayan acumulado en la base de las ramas y tal vez se han formado algunas iniciales de raíz,
posiblemente
bajo
la
influencia
de
sustancias
promotoras de raíces procedentes de yemas y de hojas, y por
lo
tanto
el
mejor
material
para
estacas
puede
provenir de la porción basal de esas ramas.
Pero,
el
mejor
enraizamiento
de
las
estacas
apicales podría explicarse por la posibilidad de que en el
ápice
se
encuentre
una
mayor
concentración
de
sustancias endógenas promotoras del enraizamiento ya que las mismas se originan en las secciones apicales (yemas apicales). También, las estacas apicales son más jóvenes y en consecuencia, hay más células capaces de volverse meristemáticas. En las especies que enraízan fácilmente, este factor es de poca importancia, cualquiera sea la posición de la estaca en la rama. 53
13.2.3 - Estado reproductivo o vegetativo:
En la mayoría de las plantas se pueden hacer estacas de ramas en condición vegetativa o en condición reproductiva. fácilmente
Nuevamente,
no
existen
en
especies
grandes
que
enraízan
diferencias
entre
distintos estados fenológicos en que se encuentre la planta, pero en especies que enraízan con dificultad, éste puede ser un factor de importancia. Por ejemplo, en dalia, mayor
las
estacas
dificultad
que
para
portan
yemas
enraizar
que
florales las
tienen
estacas
que
tienen solamente yemas foliares (Biran y Halevy, 1973).
13.3 - Sustratos para el enraizamiento:
Hay diversos medios y mezclas de éstos que se usan con
el
buenos
fin
de
hacer
resultados
enraizar se
estacas.
requieren
las
Para
obtener
siguientes
características (Richards; Warneke y Aljibury, 1964):
- El medio debe ser lo suficientemente firme y denso para mantener las estacas en su sitio 54
durante el enraíce; su volumen no debe variar mucho, ya sea seco o mojado; resulta perjudicial que tenga un encogimiento excesivo al secarse.
- Debe retener la suficiente humedad para que no sea necesario regarlo con mucha frecuencia.
- Debe ser lo suficientemente poroso, de modo que se escurra el exceso de agua y permita una aireación adecuada.
- Debe estar libre de malezas, nemátodos y otros patógenos.
- No debe tener un nivel excesivo de salinidad.
- Debe poderse esterilizar con vapor o químicos sin que sufra efectos nocivos.
- Debe existir una adecuadada provisión de nutrientes para todo el período, aunque suplementaciones con fertilizantes de lenta liberación son frecuentemente recomendados.
55
Un medio ideal de propagación, debe estar provisto de
suficiente
porosidad
para
permitir
una
buena
aireación y una alta capacidad de retención de agua, debe tener un buen drenaje y estar libre de patógenos (Hartmann et al., 1992).
13.3.1 - Arena:
La arena está formada por pequeños granos de piedra,
de
alrededor
de
0.05
a
2
mm
de
diámetro,
dependiendo su composición mineral de la que tenga la roca
madre.
En
propagación,
generalmente,
se
emplea
arena de cuarzo. De preferencia se debe fumigar o tratar con
calor
antes
de
usarla
para
esterilizarla.
Virtualmente no contiene nutrientes minerales y no tiene capacidad intercambio
amotiguadora cationico.
(Buffer) Casi
o
siempre
capacidad se
usa
de en
combinación con algún material orgánico (Hartmann et al., 1992).
13.3.2 - Turba:
56
La
turba
se
forma
con
restos de
vegetación
acuática, de marismas, ciénagas o pantanos, que se ha preservado bajo el agua en un estado de descomposición parcial.
La turba de pantanos esta formada por restos de pastos, juncos y otras plantas de pantanos. Este tipo de turba es variable en su composición y color. Su pH varía alrededor de 4 a 7.5 y su capacidad de retención de humedad es de 10 veces su peso seco (Hartmann et al., 1992).
13.3.3 - Humus de lombriz:
El humus de lombriz con forma de restos vegetales, restos animales (no deben utilizarse crudos) y restos domiciliarios
orgánicos,
que
acumulados,
forman
un
compost, y con el agregado de lombrices que digieren la materia orgánica, resulta en un producto final, llamado vermicompuesto,
semejante al humus, atóxico
para
los
vegetales y excelente mejorador de suelos.
Algunas modifican
las
microbiologicas
características del humus de propiedades del
suelo:
físico a)-
57
le
-
lombriz
químicas
comunica
al
y
suelo
mayo ma yor r
poro po rosi sida dad d
y
aire ai reac ació ión, n,
mejo me jora rand ndo o
tamb ta mbié ién n
la
infiltración y favoreciendo el desarrollo radical; b)se liberan gradualmente los nutrientes que las plantas necesitan, pues al mantener el pH dentro de un rango cercano a la neutralidad (6-7)( con gran poder buffer) , les
permite
una
microelementos:
Cu,
mayor Mn,
solubilidad. Mo
y
Zn,
es
El
tenor
elevado;
de c)-
contiene los mismos microorganismos benéficos que tiene el suelo, pero en mayor cantidad, destacándose los que tran tr ansf sfor orma man n la ce celu lulo losa sa y lo los s qu que e in inte terv rvie iene nen n en la asimilación de nitrógeno y fósforo; d)- aumento de la veloci vel ocidad dad de eme emerge rgenci ncia a de las plá plántu ntulas las; ; e)- per permit mite e una larga permanencia de ciertos hongos benéficos del suelo. sue lo. Est Estos os mic microo roorga rgani nismo smos s que sue suelen len ser efe efecti ctivos vos para controlar hongos dañinos del suelo, suelen tener en él poca durabilidad. El humus de lombriz les permite un buen bu en
desa de sarr rrol ollo lo tó tórn rnad adol olo o
efec ef ecti tivo vo en
la
luch lu cha, a, po por r
ejemplo contra dampig off ( Mirabelli, 1995).
13.4 - Mezclas de suelo para cultivo en maceta: (Hartmann et al., 1992)
En
los lo s
sist si stem emas as de
prop pr opag agac ació ión, n, la las s
esta es taca cas s
enraizadas algunas veces se plantan directamente en el campo, cam po, per pero o por lo gen genera eral, l, est esto o no es sat satisf isfact actori orio o 58
par pa ra
la
sob obre revi viv ven enci cia a
frec fr ecue uenc ncia ia se le les s
de
las
mism mi smas as, ,
inic in icia ia en un una a
por po r
ell el lo
mezc me zcla la de su suel elo o
con co n en
diversos recipientes.
Para lograr mezclas de suelo más uniformes y de mejor textura para macetas, a veces se añade arena a la tierra y algo de materia orgánica, en forma de turba, viruta de madera o corteza desmenuzada. También se usan otr ot ras
mezc me zcla las s,
sin si n
el
agr ag reg ega ado
de
tier ti err ra,
para pa ra
la
propagación y cultivo de plantas. Pueden citarse mezclas de turba y perlita o turba y arena, pero al ser pobres en nutrientes, necesitan el agregado de fertilizantes. El humus de lombriz puede utilizarse satisfactoriamente por todas las buenas características que presenta.
59
JUSTIFICACION OBJETIVO HIPOTESIS
60
JUSTIFICACIÓN:
La
inclusión
del
esteviósido
en
el
Código
Alimentario Nacional (Resolución 101 del 22-2-93) y la posibilidad de exportación ha incrementado el interés en esta especie por parte de productores.
El bajo valor cultural de las semillas (10 al 15 %) (Felippe
et
poblaciones necesidad
al,
1971)
resultantes de
y
la
heterogeneidad
(Pagliosa,
desarrollar
y/o
1982), ajustar
de
indican
las la
técnicas
alternativas, sencillas y económicas, que permitan la propagación masiva de genotipos selectos (Marcavillaca et al, 1993).
OBJETIVO:
El objetivo del presente trabajo de intensificación es estudiar, como el origen de la estaca, la época del año y/o estado fenológico, el sustrato de enraizamiento y la presencia de sustancias rizogénicas, afectan la propagación vegetativa de Stevia rebaudiana Bert.
HIPÓTESIS: 61
- Las respuestas en el enraizamiento de Stevia rebaudiana Bert. están condicionada por la posición de la estaca en la planta (estaca apical vs estaca subapical).
- El tipo de sustrato afecta la longitud y peso de las raíces formadas.
- Durante el período de crecimiento anual (desde primavera a fines de otoño), pueden realizarse varios ciclos de multiplicación (cortes de estacas), con el mismo stand de plantas madres con porcentajes de enraizamiento razonables.
62
MATERIALES Y METODOS
63
MATERIALES Y MÉTODOS:
Estas experiencias se realizaron con material extraído de plantas
de Stevia rebaudiana Bert. (tres
clones: A-B-C), de origen japonés, que se mantienen en el campo experimental de la Facultad de Agronomía (UBA) (fotografía),
las
periódicamente;
los
que
se
ensayos
riegan se
y
iniciaron
fertilizan luego
del
rebrote primaveral cuando el crecimiento en la mayoría de los vástagos fue tal que permitió extraer estacas apicales (Ap) y subapicales (Sap) de aproximadamente 1012 cm (2 o 3 nudos).
Las bases de las estacas (2 cm), apicales (Ap) y subapicales (Sap) se trataron durante 24 hs, en una solución
de
ácido
indolbutírico
(IBA)(25
mg/l,
en
solución alcohólica al 10 %) (Marcavillaca et al, 1993). Previamente, a las mismas, se les disminuyó el número de hojas presentes en los nudos inferiores, para disminuir la superficie de transpiración (Hartmann et al, 1992).
Posteriormente se plantaron en bandejas de plástico (32 por 32 por 18 cm), sobre un sustrato de turba y arena (Ta)(1:1) ó turba y humus de lombriz (Tl)(1:1), y colocando 36 estacas por bandeja (12 estacas de cada clon),
realizándose
tres 64
repeticiones
de
cada
tratamiento. Sobre las bandejas se construyó un armazón de alambre, abovedado y se cubrió con una lámina de polietileno, para crear una cámara húmeda, manteniéndose las mismas a la sombra. Al comienzo del ensayo y a las dos
semanas
se
pulverizó
con
Captan
(1,5
gr/l
de
solución), para disminuir la posibilidad de enfermedades fúngicas. A las cuatro semanas se contabilizó el número de
estacas
porcentaje
muertas
y
enraizadas,
de enraizamiento
determinándose,
(%E), longitud de raíces
(LgR) por el método de Tennant (1975)(ver anexo) y peso seco de raíces (PSR) y parte aérea (PSA).
Este primer ensayo se inició el 29 de noviembre de 1994 (F1) y se repitió durante todo el período anual de crecimiento, cada vez que los vástagos de las plantas madres alcanzaron una longitud tal que permitió el corte de estacas apicales y subapicales; el segundo se realizó el 12 de enero de 1995 (F 2); el tercero el 2 de marzo de 1995 (F3) y el cuarto el 6 de abril de 1995 (F 4) y las evaluaciones se iniciaron el 29 de diciembre de 1994, el 15 de febrero de 1995, el 4 de abril de 1995 y 9 de mayo 1995, respectivamente.
En el ensayo iniciado el 12 de enero de 1995 (F 2), a las estacas correspondientes al clon A se les incluyó otro
factor:
con
y
sin
tratamiento 65
hormonal
(IBA
y
noIBA), factor que también fue estudiado en las fechas restantes (F 3 y F4) para los tres clones (A, B, C), tipos de estaca (Ap y Sap) y sustratos (Ta y Tl) (Tabla 1).
En cada una de las fechas de los ensayos se tomaron muestras de estacas (n=10) apicales (Ap) y subapicales (Sap) y se estimó peso seco de las mismas.
Para evaluar peso seco se separaban las raíces de la parte aérea. En por lo menos cinco estacas de cada tratamiento, se determinó la longitud de las raíces y luego se secó todo el material enraizado en estufa a 50ºC, durante 72 hs, pesándose posteriormente en balanza analítica (precisión: 10 -4 gr). El peso de la parte aérea se ajustó según:
Crecimiento de la parte aérea (CpA) = Peso seco aéreo total - media del peso seco inicial de cada fecha y tipo de estaca.
Se
realizó
un ensayo factorial, con
medidas
repetidas en el tiempo, con un diseño de bloques al azar y los resultados se evaluaron a través de un análisis de varianza,
para
el
mismo
se
utilizó
el
programa
estadístico Number Cruncher Statistical System (NCSS) 66
(Hintze,
1991).
porcentaje
Las
variables
de enraizamiento
estudiadas
fueron:
(%E), longitud de raíces
(LgR), peso seco de raíces (PSR) y peso seco de la parte aérea (PSA) y relación peso de las raíces/peso total (rPSR/PT) con:
Peso total= Crecimiento de la parte aérea (CpA) + peso de las raíces (PSR).
Cuando las variables analizadas son porcentaje de enraizamiento previamente
o
relación
se
realizó
peso
de
raíces/peso
transformación
(arcoseno).
67
de
total, datos
RESULTADOS Y DISCUSION
68
RESULTADOS Y DISCUSIÓN:
Durante
las
realizaciones
del
ensayo
al
contabilizar el número de individuos muertos, a los 15 y 28 días se observó que el número de los mismos era mayor en los tratamientos de turba y arena. Sobre un total de 432, 462 y 576 estacas para cada una de las fechas, las pérdidas fueron en la primer fecha 61 y 70, segunda fecha 46 y 53 y en la tercer fecha 40 y 75, para turba y humus
de
lombriz
y
turba
y
arena
respectivamente;
valores que implican 22% de perdida total para las tres fechas juntas.
La cuarta fecha (F 4), se excluyó del análisis de los datos ya que sólo esporádicamente algunas estacas subapicales enraizaron. A comienzos del mes de marzo, con fotoperiódos de 13 1/2 hs comienza la floración en los tres clones. Se ha postulado la hipótesis de la existencia de un complejo hormonal complementario de la floración, y las giberelinas, que se sintetizan en esta etapa,
serían
las
responsables
esenciales
de
la
formación y crecimiento de los tallos florales (Barceló Coll et al, 1983).
Se
ha
concentraciones
observado
que
relativamente 69
las
giberelinas,
elevadas,
de
en
manera
consistente
han
inhibido
la
adventicias (Sircar, 1974). Esta
formación
de
raíces
inhibición sería un
efecto local directo que impediría la división temprana de las células que intervienen en la transformación de tejido maduro a una condición meristemática (Brian et al, 1960). En estacas de hoja de Begonia se observó que el ácido giberélico inhibía la formación, tanto de yemas como de raíces adventicias, probablemente, bloqueando las divisiones
celulares organizadas, que inician
la
formación de los primordios de yemas y de raíces (Heide, 1969).
En la mayoría de las plantas se pueden hacer estacas de ramas en condición vegetativa o en condición reproductiva.
En especies que enraízan fácilmente
no
existen grandes diferencias entre los distintos estados fenológicos
en
que
se
encuentre
la
planta,
pero
en
especies que enraízan con dificultad, éste puede ser un factor de importancia. Por ejemplo, en el arándano azul (Vaccinium
atrococcum),
las
estacas
de
madera
dura
conteniendo yemas florales no enraízan tan bien como las que sólo tienen yemas foliares. Cuando se usó madera vegetativa, enraizó un 39% de las estacas, pero cuando las estacas contenían una o más yemas florales, ninguna enraizó (Hartmann et al., 1992). En dalia, las estacas que portan yemas florales tienen mayor dificultad para 70
enraizar
que
las
estacas
que
tienen solamente
yemas
foliares (Biran y Halevy, 1973). En los rododendros, la remoción
temprana
de
las
yemas
florales
potenciales
aumentó el enraizamiento, presumiblemente debido a la eliminación
de
un
estímulo promotor de
la
floración
antagonista del enraizamiento. La remoción posterior de las yemas florales todavía aumentó el enraíce, tal vez eliminando la competencia por los materiales necesarios para la formación de raíces (Hartmann et al., 1992). La floración es un fenómeno complejo
que puede disminuir
la
en
competencia
entre
destinos
perjuicio
del
enraizamiento. En nuestro caso en F 4 solo enraizaron algunas estacas subapicales las cuales poseen muy pocas yemas florales. Manchado de Carvalho y Zaidan (1995) también
observaron
en
esta
especie
bajos
a
nulos
porcentajes de enraizamiento cuando las plantas madres se
encuentran
especies
en
estado
ornamentales
reproductivo.
(Abelia,
Con
Ligustrum,
muchas
Ilex,
etc)
cuando se trabaja en escala comercial, se remueven yemas florales en las estacas para un desarrollo de raíces más rápido, un crecimiento vegetativo temprano y una mayor eficiencia
en
la
producción
(Hartmann et al., 1992).
71
de
la
cicatrización
Porcentaje de enraizamiento:
Los resultados obtenidos se observaron en las figuras 1, 2, y 3 y las tablas 2, 3 y 4. Se encontraron diferencias altamente significativas entre clones (F** 14,47) y entre sustratos (F** 66,68) y no significativas (ns)
entre
tipo
de
estaca
y
entre
fechas
de
corte
(figura 1 y tabla 2). Los porcentajes de enraizamiento fueron siempre altos, variando entre 55 y 75% (tabla 2). Al
estudiar
la
tercer
fecha,
con
inclusión
de
tratamiento rizogénico (figura 2 y tabla 3), se hallaron diferencias significativas (F* 5,62) entre estacas
y
altamente significativas entre sustratos (F** 47,75) y entre
tratamientos
hormonales
(F**
12,83).
Los
porcentajes de enraizamiento variaron entre 35 y 74% (tabla 3). Al estudiar el clon A (figura 3 y tabla 4) incluyendo tratamiento con y sin hormona (IBA-noIBA), se encontraron diferencias altamente
significativas entre
sustratos (F** 47,75) y entre tratamientos rizogénicos (F** 12,83) y significativas al 8% entre estacas (F* 3,07). Los porcentajes de enraizamiento variaron entre 41 y 90% (tabla 4).
72
Longitud de raíces:
Los resultados obtenidos se observan en las figuras 4,
5,
y
6
y
las
tablas
5,
6
y
7.
Se
encontraron
diferencias altamente significativas entre fechas (F** 7,08),
entre
clones
(F**
10,09),
entre
estacas
(F**27,13) y entre sustratos (F** 294,29) (figura 4 y tabla 5) y entre las interacciones Fecha x Estaca (F** 8,39) (tabla 5.1), Clon x Estaca (F** 8,45) (tabla 5.2) y significativas entre Fecha x Clon (F* 4,09) (tabla 5.3), las longitudes variaron entre 75 y 225 cm (tabla 5).
Al
analizar
tratamiento
la
tercer
rizogénico
fecha,
(figura
5
con y
inclusión tabla
6)
de se
encontraron diferencias altamente significativas entre sustratos (F** 75,25) y entre hormonas (F** 14,04) y significativas entre estacas (F* 3,33) y entre clones (F* 3,4). Las medias variaron entre 66 y 189 cm (tabla 6). Al estudiar el clon A durante dos fechas (F 2 y F 3), se
encontraron
entre
sustratos
diferencias (F**
altamente
58,74),
entre
significativas tratamientos
hormonales (F** 8,85) y las longitudes extremas fueron 51 y 222 cm (figura 6 y tabla 7).
73
Peso de raíces:
Los resultados obtenidos se observan en las figuras 7,
8
y
9
y
las
tablas
8,
9
y
10.
Se
encontraron
diferencias altamente significativas entre clones (F** 5,7)
y
entre
sustratos
(F** 165,8) y
significativas
entre fechas (F* 2.90), con medias que variaron entre 7 y 31 mg (figura 7 y tabla 8). Al analizar la tercer fecha con inclusión de tratamiento rizogénico (figura 8 y
tabla
9),
se
significativas
encontraron
entre
sustrato
diferencias (F**
31,86)
altamente y
entre
tratamientos rizogénicos (IBA-noIBA) (F** 6,33) y los pesos variaron entre 8 y 23 mg (tabla 9). Estudiando el clon
A
durante
diferencias
dos
fechas
altamente
(F 2
y
F3)
significativas
se
observaron
entre
sustratos
(F** 31,31) y significativas entre hormonas (F* 4,23) y los pesos de todos los tratamientos variaron entre 5 y 19 mg (tabla 10).
Peso de parte aérea:
En esta parte del ensayo se analiza el crecimiento verificado inicial
de
de
la las
parte
aérea,
estacas
por
encima
iniciales,
del
durante
peso el
enraizamiento. Los datos observados se muestran en las 74
figuras 10,
11
y
12
y las
tablas 11, 12
y
13.
Se
encontraron diferencias significativas entre fechas (F** 122,72), entre clones (F** 5,37), entre estacas (F** 13,29) y entre sustratos (F** 9,71) y significativas en la interacciones Fecha x Clon (F* 3,85)
(figura 10 y
tablas 11 y 11.1) y los pesos variaron entre 31 y 64 mg. Al analizar la tercer fecha se encontraron diferencias altamente significativas entre sustratos y hormonas (F** 7.29
y
5,63
respectivamente)
y
significativas
entre
clones (F* 3,76) y estacas (F* 4,08), con pesos que variaron entre 14 y 26 mg (tabla 12). Cuando se estudió el clon A durante dos fechas (F 2 y F3) con respecto a estas
variables
significativas
se
encontraron
entre
diferencias
sustratos
(F**
altamente 6,22)
y
significativas entre estacas (F** 4,75) (figura 12), con pesos que variaron entre 15 y 26 mg (tabla 13).
Relación peso de raíces parte aérea:
Los datos observados se muestran en las figuras 13, 14 y 15 y las tablas 14, 15 y 16. Se encontraron, diferencias altamente significativas entre fechas (F** 26,73), entre estacas (F** 12,10) y entre sustratos (F** 36,32) y las mismas variaron entre 0,04 y 0,15 (tabla 14).
Al
analizar
la
tercer 75
fecha
con
tratamiento
rizogénico,
se
significativas
observaron
entre
diferencias
sustratos
(F**
altamente
10,1)
y
entre
estacas (F** 6,08) y significativas entre clones (F* 2.64) (figura 14) y las estacas variaron entre 0,12 y 0,21 (tabla 16). Al analizar al clon A
durante dos
fechas (F 2 y F3), se encontraron diferencias altamente significativas entre fechas (F** 7,27) y significativas entre sustratos (F* 4,23), entre estacas (F* 3,78) y entre hormonas (F* 4,25) (figura 15), mientras que las medias variaron entre 0,1 y 0,18 (tabla 16).
Al analizar en conjunto las distintas variables (porcentaje de enraizamiento, longitud de raíces, peso de raíces, peso de la parte aérea y relación peso de raíces/peso total), surge de inmediato la superiodidad del sustrato humus de lombriz y turba, sobre turba y arena, ya que en todos los ensayos se observaron mayores valores que sobre cualquier tratamiento (tablas 2 a 16), incluso
al
estudiar
el
largo
de
raíces
y/o
peso
correspondientes a los tratamientos sin hormona, eran mayores que los de turba y arena con hormona (tablas 6.1 y
9.1).
químicas altamente comercial
Es
evidente que
del
mismo
lo
recomendable de
las
características
convierten, para
distintas
la
un
propagación
especies, 76
en
ya
que
físicosustrato
a
escala por
su
consistencia y tamaño de partículas, permite un anclaje adec ad ecua uado do
de
ten te nor ore es
las la s
de
esta es taca cas, s,
hume hu med dad ad, ,
sin si n
aireación
que
libe li bera rand ndo o
grad gr adua ualm lmen ente te
el
mant ma nten enim imie ient nto o
dis di smi min nui uir r
fac fa cilitan
el
los lo s
la
alto al tos s
por oro osi sida dad d
intercambio nutr nu trie ient ntes es
de
y
gaseoso,
nece ne cesa sari rios os. .
Asimismo, podría postularse que los menores porcentajes de pérdidas con este sustrato serían consecuencia de la presencia en el mismo de poblaciones de microorganismos benéficos.
En la ma mayo yorí ría a de lo los s en ensa sayo yos s se en enco cont ntra raro ron n diferencias significativas entre clones, lo que da idea de
la
vari va ria abi bili lida dad d
exis ex iste tent nte e
entr en tre e
los
mism mi smo os.
Se
esperaba encontrar menor heterogeneidad entre ellos, ya que
a
pesar
originaron
de
ser
provenían
hete he tero roge gene neid idad ad
de
las la s
clones, de
las
una
semillas
misma
pobl po blac acio ione nes s
que
los
planta.
La
resu re sult ltan ante tes s
de
la
multiplicación sexual, señalan la necesidad de trabajar con mat materi erial al sel selecc eccion ionado ado y pro propag pagado ado veg vegeta etativ tivame amente nte (Ma (M arc rca avi vill llac aca a
y
Div ivo o
de
Ses Se sar ar, ,
1993 19 93) ).
Al
eval ev alua uar r
porcentajes de enraizamiento en la tercer fecha no hubo diferencias entre clones (figura 2 y tabla 3), pero si en la calidad de las raíces formadas (longitud y peso, figuras
5
y
8
y
tablas
6
y
9).
La
aptitud
para
diferenciar raíces de especies herbáceas suele ser alta y es por ello que las diferencias genotípicas suelen ser 77
menos
evidentes.
En
los
clones
A
y
C
siempre
se
encontraron mejores respuestas que en el B. Entre A y C las la s
dif di fer eren enci cia as
son
meno me nos s
noto no tor ria ias s
e
inc ncl lus uso, o,
al
analiz ana lizar ar una mis misma ma var variab iable, le, se obs observ ervan an dif difere erenci ncias as partic par ticula ulares res est estaci aciona onales les (in (inter teracc acción ión Clo Clon n x Fec Fecha) ha). . Cuando se estudian las tres fechas siempre es superior el clon A (peso de raíces y parte aérea, figuras 7 y 10 y tablas 8 y 11), pero en la tercer fecha, C supera a A (longitud y peso de raíces, figuras 5 y 8 y tablas 6 y 9), lo que indicaría una mejor aptitud de este clon para climas más frescos. Las temperaturas medias de cada una de las fechas de corte fueron 25, 24 y 21 1/2ºC.
Al analizar el factor fecha, se observan que aunque no se enc encont ontrar raron on dif difere erenci ncias as sig signif nifica icativ tivas as en tod todas as las variables, la tendencia indicaría que la mejor fecha fue
la
segunda,
luego
la
tercera
y
por
último
la
primera. Durante la primer fecha (29 de noviembre al 29 de diciembre de 1994), las temperaturas estuvieron muy por encima de las habituales (mínima media 20ºC y máxima media 30,2ºC), lo que implica que las estacas, a pesar de estar en la sombra, debieron registrar algún tipo de éstres ést res. . Las úni únicas cas var variab iables les que fue fueron ron sup superi eriore ores s en esta fecha fueron peso de la parte aérea y de raíces. Altas temperaturas tienden a promover el desarrollo y/o crecimiento de las yemas, en detrimento del desarrollo 78
radicular (Hartmann et al, 1992)(figuras 7 y 10 y tablas 8 y 11 11). ). Ta Tamb mbié ién n hu hubo bo cr crec ecim imie ient nto o im impo port rtan ante te de la las s raíces pero el de la parte aérea fue mucho mayor. En la relación peso de raíces/peso total (figura 13 y tabla 14), las diferencias son altamente significativas
y en
la pr prim imer er fe fech cha a la pa part rtic ició ión n ha haci cia a ra raíc íces es fu fue e mu much cho o menor. Las temperaturas de las fechas restantes fueron mínima media 19.3 y 16,9ºC y máxima media 29,2 y 27,2ºC respectivamente. Temperaturas diurnas del aire entre 21 y 27ºC, con temperaturas nocturnas cercanas a 15ºC son satisfactorias para la mayoría de las especies de clima templado cálido (Marcavillaca y Divo de Sesar, 1993). La inicia ini ciació ción n de raí raíces ces en est estaca acas s est está á reg regula ulada da por la tem te mpe per rat atur ura, a, fuertemente disp di spon onib ible les. s.
per pe ro
el
crec cr ecim imi ien ent to
dependiente Las La s
esta es taca cas s
de
de
las la s
los
inic in icia iale les s
mis isma mas s
es
carbohidratos
de
la
segu se gund nda a
y
tercer fecha fueron más livianas que las de la primera, pero per o la rel relaci ación ón pes peso o de raí raíces ces/pe /peso so tot total al fue muc mucho ho mayor en estas dos fechas (figura 13 y tabla 14). La respiración se redujo probablemente como consecuencia de las
menores
part pa rtic ició ión n
de
temperaturas, los lo s
permitiendo
foto fo tosi sint ntat atos os ha haci cia a
las la s
una
mayor
raíc ra íces es. .
Los Lo s
resultados estacionales obtenidos en estos ensayos son váli vá lido dos s
para pa ra
lati la titu tude des s
simi si mila lare res s
a
las la s
nues nu estr tras as; ;
en
Campinas, Estado de San Pablo, Brasil, los mejores meses para
el
enraizamiento
de 79
estacas
van
de
Mayo
a
Septiembre,
época
en
que
a
nuestras
latitudes
la
especie entra en reposo vegetativo (Machado de Carvalho y Zaidan, 1995). Asimismo, los resultados obtenidos por los autores son mucho menores a los nuestros (65% vs 31%).
En
las
estacas
apicales se
observan mejores
respuestas en las variables, longitud de raíces, peso de las mismas y relación peso de raíces/peso total (figuras 4, 5, 6, 7, 8, 13, 14 y 15 y tablas 5, 6, 7, 8, 9, 14, 15 y 16). La mejor aptitud para el enraizamiento de las estacas apicales, podría explicarse por la probabilidad de
mayores
concentraciones
de
sustancias
endógenas
promotoras del enraizamiento sintetizadas en las yemas apicales. Asimismo las estacas apicales son más jóvenes y
por
consiguiente existe
mayor
cantidad de
células
meristemáticas (Hartmann et al, 1992). Sin embargo en el porcentaje
de
enraizamiento
se
observó
mejores
resultados con las estacas subapicales (figuras 1, 2 y 3 y tablas 2, 3 y 4), en este caso al ser más pesadas podría
haberse
favorecido
la
acumulación
de
carbohidratos, promoviendo el enraizamiento. Machado de Carvalho y Zaidan (1995), rechazan el enraizamineto de estacas
subapicales,
pues
adecuadas.
80
no
logran
respuestas
Todas las variables relativas al enraizamiento se ven
favorecidas
con
la
inclusión
de
tratamiento
rizogénico (figuras 2, 3, 5, 6, 8, 9, 14 y 15 y tablas 3, 4, 6, 7, 9, 10, 15 y 16), por lo que podríamos afirmar que los mismos, no solo favorecen el porcentaje de enraizamiento (inducción de raíces), sino la calidad de las mismas, longitud (en número y tamaño), ya que el mismo, era mayor en los tratamientos con IBA (datos no presentados); desarrollo
de
además las
estos raíces
tratamientos formadas,
estimulan
el
favoreciendo
la
partición de carbohidratos hacia las mismas (relación peso de raíces/peso total, figuras 14 y 15 y tablas 15 y 16)
81
CONCLUSIONES Y CONSIDERACIONES FINALES
82
CONCLUSIONES
- Los mejores resultados cuantitativos de las distintas variables (longitud de raíces, pesos de raíces y parte aérea y relación peso de raíces/peso total) en el enraizamiento de estacas se observan con estacas apicales, pero asimismo se logran respuestas adecuadas con estacas subapicales.
- Los tratamientos rizogénicos afectan los porcentajes de enraizamiento, mejorando la calidad de las raíces formadas (número, largo y peso).
-
El enraizamiento es posible durante todo el ciclo vegetativo.
- El humus de lombriz y turba es un sustrato altamente conveniente para ser utilizado en la propagación.
- Las diferencias encontradas en los clones utilizados sugiere que la heterogeneidad de una población de Stevia rebaudiana Bert. permite la selección de distintos genotipos 83
para caracteres determinados.
CONSIDERACIONES FINALES
Stevia mundial,
como
rebaudiana muy
Bert.
promisoria,
se
para
presenta a la
nivel
producción de
edulcorantes naturales de bajo contenido calórico. Si un pequeño porcentaje del mercado de edulcorantes, pudiera ser
ocupado
por
el
esteviósido,
serían
necesarias
grandes cantidades de materia prima.
Debido a la heterogeneidad de las poblaciones en cuanto al contenido de esteviósido, es imprescindible partir
de
material seleccionado el
cual debería
ser
forzosamente propagado vegetativamente. Por lo tanto, es indispensable contar con métodos de enraizamiento que empleando técnicas sencillas y
económicas
puedan ser
utilizado a escala industrial.
Los resultados observados en esta experiencia contribuirán
al
mejoramiento
de
los
ya
existentes.
Podría sugerirse que la continuidad de estos ensayos, incluyan otros que estudien la posibilidad
de prolongar
el período de propagación inhibiendo de algún modo la
84
floración.
Asimismo,
sería
interesante
establecer
el
tiempo mínimo necesario para la formación de raíces.
Hemos observado, que utilizando humus de lombriz y turba, no solo se mejoran las variables concernientes a la calidad de las raíces, sino que además también se afecta la velocidad en que las mismas se forman. La etapa de enraizamiento se fijó en cuatro semanas porque las estacas de turba y arena solo comienzan a enraizar a partir de los 21 días. Mientras que las de turba y humus de lombriz, ya habían comenzado la formación de raíces a los 15 días. Acortamientos de esta etapa permitirían una mayor rotación y eficiencia en el uso de los recursos (ciclos, instalaciones, etc), factores que deben ser tenidos en cuenta al diseñar un sistema de propagación a escala industrial.
85
FIGURAS Y TABLAS
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
101
102
103
104
105
106
107
108
109
110
111
FOTOGRAFIA
112
FOTOGRAFIA: Planta de Stevia rebaudiana Bert. del Banco de Plantas Madres de la Facultad de Agronomía (UBA).
113
ANEXO
114
ANEXO
Medición de raíces. Método de Tennant:
En las fechas de evaluación correspondientes se cortaron las raíces a ras del tallo, se lavaron y se midieron siguiendo el siguiente método:
Se construyó una grilla cuadriculada (0,5 cm), plastificándose posteriormente. Las raíces de cada una de las plantas muestreadas se distribuyó sobre la grilla al azar y con ayuda de una lupa de mano (2,5 veces de aumento),
se
contabilizó
intersecciones
horizontales
el y
número
total
verticales
que
de cada
porción de raíz cruzaba.
El largo total de las raíces de cada una de las plantas se obtuvo utilizando la siguiente fórmula de transformación:
Largo de raíz= 11/14 * número de intersecciones * unidad de grilla (cm.).
Unidad de grilla correspondiente= 0,5 cm.
115
BIBLIOGRAFIA
116
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125
ÍNDICE Pág. - Resumen ...........................................1 - Introducción ......................................4 1 - Propiedades de un edulcorante ideal ...........7 2 - Características de los edulcorantes de uso extensivo .....................................9 2.1 - Sacarina ...................................9 2.2 - Ciclamato .................................10 2.3 - Aspartame .................................11 2.4 - Acesulfame-K ..............................12 3 - Características edulcorantes del esteviósido .12 3.1 - Introducción ..............................12 3.2 - Propiedades físico-químicas de interés en el procesado de alimentos ..............14 3.3 - Propiedades edulcorantes ..................15 3.3.1 - Calidad del sabor dulce ................16 4 - Inocuidad del esteviósido ....................17 5 - Utilización actual del esteviósido ...........19 6 - Formas de comercialización ...................20 7 - Otros campos de aplicación ...................21 8 - Mercado mundial de edulcorantes ..............21 8.1 - Sacarina ..................................22 8.2 - Ciclamato .................................22 8.2 - Aspartame .................................23 8.4 - Esteviósido ...............................23 126
Pág. 9 - Perspectivas del esteviósido .................24 9.1 - Mercado mundial ...........................24 10 - Evolución histórica ..........................25 11 - Caracterización de la Stevia rebaudiana Bert..37 11.1 - Origen y distribución .....................37 11.2 - Descripción botánica ......................39 11.3 - Ecotipos ..................................41 11.4 - Citología .................................42 11.5 - Clima .....................................43 11.6 - Suelos ....................................44 12 - Características agronómicas ..................45 12.1 - Propagación
sexual de Stevia rebaudiana
Bert. .....................................46 12.2 - Propagación vegetativa de Stevia rebaudiana Bert. .....................................47 13 - Propagación vegetativa .......................48 13.1 - Bases fisiológicas de la iniciación de raíces adventicia..........................51 13.1.1 - Efecto de las hojas sobre el enraizamiento ..........................51 13.1.2 - Fotosíntesis de las estacas ............52 13.2 - Factores que afectan la multiplicación por estacas ...................................53 13.2.1 - Diferencias entre plantas individuales procedentes de semilla .................53 127
Pág. 13.2.2 - Diferencias entre las zonas apicales y basales de la rama .....................53 13.2.3 - Estado reproductivo o vegetativo .......54 13.3 - Sustratos para el enraizamineto ...........55 13.3.1 - Arena ..................................57 13.3.2 - Turba ..................................57 13.3.3 - Humus de lombriz .......................58 13.4 - Mezclas de suelo para cultivo en maceta ...59 - Justificación, Objetivo e Hipótesis ..............61 - Materiales y métodos .............................64 - Resultados y discusión ...........................69 - Figuras y tablas .................................87 - Fotografía ......................................113 - Anexo. Método de Tennant ........................115 - Bibliografía ....................................117
128
ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS Figura
Pág.
1- Porcentaje de enraizamiento, de 3 fechas (F 1F2-F3),para los distintos factores (fecha, clon, estaca y sustrato) .......................88 2- Porcentaje de enraizamiento, de la tercer fecha (F3), para los distintos factores (clon, estaca, sustrato y hormona) .............89 3- Porcentaje de enraizamiento, del clon A, para 2 fechas (F 2-F3), de los distintos factores (fecha, estaca, sustrato y hormona) ............90 4- Longitud de raíces, de 3 fechas(F 1-F2-F3),para los distintos factores (fecha, clon, estaca y sustrato) ......................................91 5- Longitud de raíces, de la tercer fecha (F 3), para los distintos factores (clon, estaca, sustrato y hormona) ............................92 6- Longitud de raíces, del clon A, para 2 fechas (F2-F3), de los distintos factores (fecha, estaca,sustrato y hormona) .....................93 7- Peso de raíces, de 3 fechas (F 1-F2-F3), para los distintos factores (fecha, clon, estaca y sustrato) ......................................94 8- Peso de raíces, de la tercer fecha (F 3), para los distintos factores (clon, estaca, sustrato y hormona) .....................................95 129
Pág. 9- Peso de raíces, del clon A, para 2 fechas (F2-F3), de los distintos factores (fecha, estaca, sustrato y hormona) .....................96 10- Peso de la parte aérea, de 3 fechas (F 1-F2-F3), para los distintos factores (fecha, clon, estaca y sustrato) ..............................97 11- Peso de la parte aérea, de la tercer fecha (F3), para los distintos factores (clon, estaca, sustrato y hormona) ...................98 12- Peso de la parte aérea, del clon A, para 2 fechas (F 2-F3), de los distintos factores (fecha, estaca, sustrato y hormona) ............99 13- Relación Peso de raíces/Peso total, de 3 fechas (F 1-F2-F3), para los distintos factores (fecha, clon, estaca y sustrato) .....100 14- Relación Peso de raíces/Peso total, de la tercer fecha (F 3), para los distintos factores (clon, estaca, sustrato y hormona) ............101 15- Relación Peso de raíces/Peso total, del clon A, para 2 fechas (F 2-F3), de los distintos factores (fecha, estaca, sustrato y hormona) ..102
130
Tabla
Pág.
1- Resumen de los factores ensayados .............103 2- Porcentaje de enraizamiento, de 3 fechas (F 1F2-F3),para los distintos factores (fecha, clon, estaca y sustrato) ......................104 3- Porcentaje de enraizamiento, de la tercer fecha (F3), para los distintos factores (clon, estaca, sustrato y hormona) ............104 4- Porcentaje de enraizamiento,
del clon A, para
2 fechas (F 2-F3), de los distintos factores (fecha, estaca, sustrato y hormona) ...........104 5- Longitud de raíces, de 3 fechas(F 1-F2-F3),para los distintos factores (fecha, clon, estaca y sustrato) .....................................105 5.1- Longitud de raíces, de 3 fechas(F 1-F2-F3), interación Fecha x Estaca (F 1-F2-F3 x Ap-Sap) ......................................106 5.2- Longitud de raíces, de 3 fechas(F 1-F2-F3), interación Clon x Estaca (A-B-C x Ap-Sap) ....106 5.3- Longitud de raíces, de 3 fechas(F 1-F2-F3), interación Fecha x Clon (F 1-F2-F3 x A-B-C) ...106 6- Longitud de raíces, de la tercer fecha (F 3), para los distintos factores (clon, estaca, sustrato y hormona) ...........................105
131
Pág. 6.1- Longitud de raíces, de la tercer fecha (F 3), interación Sustrato x Hormona (Tl-Ta x IBA-noIBA) ...................................107 7- Longitud de raíces, del clon A, para 2 fechas (F2-F3), de los distintos factores (fecha, estaca, sustrato y hormona) ...................105 8- Peso de raíces, de 3 fechas (F 1-F2-F3), para los distintos factores (fecha, clon, estaca y sustrato) .....................................108 9- Peso de raíces, de la tercer fecha (F 3), para los distintos factores (clon, estaca, sustrato y hormona) ....................................108 9.1- Peso de raíces, de la tercer fecha (F 3), interación Sustrato x Hormona (Tl-Ta x IBA-noIBA) ...................................109 10- Peso de raíces, del clon A, para 2 fechas (F2-F3), de los distintos factores (fecha, estaca, sustrato y hormona) ...................108 11- Peso de la parte aérea, de 3 fechas (F 1-F2-F3), para los distintos factores (fecha, clon, estaca y sustrato) ............................110 11.1- Peso de la parte aérea, de 3 fechas (F 1-F2-F3), interación Fecha x Clon (F 1-F2-F3 x A-B-C) ..111
132
Pág. 12- Peso de la parte aérea, de la tercer fecha (F 3), para los distintos factores (clon, estaca, sustrato y hormona) ...........................110 13- Peso de la parte aérea, del clon A, para 2 fechas (F 2-F3), de los distintos factores (fecha, estaca, sustrato y hormona) ...........110 14- Relación Peso de raíces/Peso total, de 3 fechas (F1-F2-F3), para los distintos factores (fecha, clon, estaca y sustrato) ......................112 15- Relación Peso de raíces/Peso total, de la tercer fecha (F3), para los distintos factores (clon, estaca, sustrato y hormona) ...................112 16- Relación Peso de raíces/Peso total, del clon A, para 2 fechas (F 2-F3), de los distintos factores (fecha, estaca, sustrato y hormona) ..112
133
AGRADECIMIENTOS
- Al Ing. Agr. Manuel C. Marcavillaca, que cedió el material
inicial
realización
de
de
este
propagación, trabajo
de
que
posibilitó
intensificación
y
la me
permitió el acceso a su bibliografía personal.
- A la Ing. Agr. Marta Divo de Sesar, por dedicarme su tiempo
y
conocimientos,
por
inculcarme
orden
y
prolijidad, tanto en el trabajo como en la escritura y presentación de este trabajo de intensificación.
- A los Ing. Agr. Fernando Vilella, Pablo Pristupa y al Técnico Agrícola Emilio Mirabelli, por los consejos y aportes brindados durante este trabajo.
- A los responsables del Laboratorio de Semillas, por brindarme las instalaciones y equipos del mismo.
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A mis padres
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