TEMA 8: CINÉTICA ENZIMÁTICA.
La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. No hace referencia a la espontaneidad de la reacción, si no a lo rápido que transcurre la reacción y los factores que influyen.
Factores que afectan a la velocidad enzimática
pH: Cada enzima tiene un valor de pH óptimo. El pH influye porque la enzima es una proteína y debemos de tener en cuenta el ambiente para que no se desnaturalice, ya que cambiando el pH cambian sus grupos ionizables y con ello su estructura primaria y su función. Variando también su fijación con el sustrato.
Temperatura: Si aumentamos la temperatura aumenta la velocidad de reacción, ya que se aporta mayor energía y se llega antes a formar el ET y pasando más moléculas. No obstante la enzima también tiene una temperatura óptima, y si la temperatura es muy alta se puede llegar a la desnaturalización de esta como proteína que es.
Concentración iónica: La concentración de sales del medio es importante para la actividad enzimática óptima, ya que las interacciones iónicas estabilizan la estructura terciaria. Esta es la que se encarga de la estabilidad, por lo tanto depende de la concentración iónica la estabilidad y por consiguiente de la velocidad.
Concentración de sustrato: Si la concentración de sustrato es baja la velocidad de los productos es proporcional a [S]. Si la concentración de [S] es alta la velocidad de formación del producto es independiente de [S]. Esto se debe a que las enzimas se saturan. La saturación y la dependencia de [S] hacen que determinar la velocidad de una reacción enzimática sea complejo.
Modelo Cinético de Michaelis-Menten
Intentan explicar matemáticamente el comportamiento cinético de las enzimas. La cinética enzimática tiene una característica que no se observa en las no enzimáticas: la saturación de la enzima por el sustrato, yendo a su Vmax. Otras características son su dependencia de [S] y la naturaleza.
La saturación enzimática les hizo pensar que las reacciones enzimáticas ocurren en dos etapas:
Fase de afinidad (primera etapa): Unión de S al centro activo de la E y la formación del complejo Enzima - Sustrato. Es rápida y reversible.
Fase de catálisis (segunda etapa): Transformación de S en P y la liberación de la enzima. Es lenta e irreversible.
Una reacción catalizada por enzimas evoluciona de manera que la concentración de [S] disminuye, aumentando la de [P] y la de [E] disminuye, aumentando la de [ES].
La concentración de S es mayor a la de E por lo tanto la enzima es el factor limitante.
Para que esto no varíe a lo largo del tiempo, se determina la velocidad en el estado estacionario, donde se establece un equilibrio. En el estado estacionario la velocidad será máxima. La [ES] es pequeña y constante. La velocidad de formación de ES es igual a la descomposición.
[ES]=ET[S]KM+[S]KM=k2+k3k1Las diferentes k se han sustituido por KM que es la constante de Michaelis- Menten.
[ES]=ET[S]KM+[S]
KM=k2+k3k1
v=v3=k3ES=k3ET[S]KM+[S]La velocidad de reacción es igual a la velocidad de formación de producto.
v=v3=k3ES=k3ET[S]KM+[S]
v0=vmax[S]KM+[S]La velocidad máxima se obtendrá cuando la enzima esté saturada por el S.
v0=vmax[S]KM+[S]
vmax=k3[ET]
Ecuación de Michaelis-Menten:
La representación gráfica de esta ecuación es v frente a [S] y es una hipérbola.
Km Concentración de S para la cual la velocidad de reacción es ½ de la Vmax. La Km nos da una idea sobre la afinidad de E y S. A mayor Km menor afinidad y viceversa. Las unidades de Km son de concentración.
La Km es específica para cada enzima y puede variar con la temperatura, el pH y la fuerza iónica.
La Vmax se alcanza cuando todos los centros activos están ocupados con sustrato. Esta revela el número de recambio de la enzima (número de moléculas de sustrato convertidos en producto por unidad de tiempo y por molécula de enzima en condiciones de saturación).
Representación de Lineweaver-Burk
Se trata de una representación doble recíproca (1/v frente a 1/[S]). Nos permite representar gráficamente los valores de Km y los de Vmax.
Inhibición Enzimática
Inhibidor: Sustancias que disminuyen la actividad enzimática mediante interacciones con el centro activo y otros centros específicos. No son inhibidores los que desnaturalizan la enzima.
Tipos de inhibidores
Inhibidor reversible: Establecen un equilibrio con la E libre, con el complejo ES o con ambos. Pueden ser:
Competitivos: El inhibidor se fija a centro activo de la E.
Acompetitivos: El inhibidor se fija al complejo ES una vez formado, impidiendo la acción catalítica.
No competitivos: El inhibidor se une a la enzima independientemente de que lo haga o no el sustrato. Se une a un sitio diferente del centro activo, por lo que no impide la unión del sustrato pero si la acción catalítica.
Inhibidor irreversible: Modifican químicamente a la E mediante uniones covalentes.
Inhibición Reversible
Inhibición Competitiva
El inhibidor se fija al centro activo de la enzima libre impidiendo la unión del sustrato. El inhibidor es muy parecido en tamaño, estructura…etc, al sustrato.
Constante de equilibrio del inhibidor:
Características:
La unión de sustrato e inhibidor son excluyentes.
A mayor [S] se reduce la inhibición.
Vmax=Vmax I Km I > KmEl inhibidor competitivo es un análogo químico del sustrato.
Vmax=Vmax I
Km I > Km
El inhibidor es tan específico como el centro activo.
Inhibición No Competitiva
El inhibidor se une a la enzima independientemente de que lo haga o no el sustrato. Se une a un sitio diferente del centro activo, por lo que no impide la unión del sustrato pero si la acción catalítica.
Características:
El inhibidor se fija indistintamente a la enzima libre (E) y al complejo ES.
Vmax> Vmax I Km= Km INi el complejo EI ni el complejo ESI son productivos.
Vmax> Vmax I
Km= Km I
Inhibición Acompetitiva
El inhibidor se fija al complejo ES una vez formado, impidiendo la acción catalítica.
Km> km I Vmax> Vmax I
Km> km I
Vmax> Vmax I
Características:
El I se une al complejo ES en un sitio distinto al que se fija el S en el centro activo.
Ocurre en reacciones multisustrato.
Resumen:
Inhibición Irreversible
Se unen de manera covalente (de manera permanente) al centro activo de la enzima modificada.
Son altamente tóxicos. Una clase son los inhibidores suicidas.
Algunos ejemplos son: reactivos de grupos –SH, organofosforados, ligandos de metal, metales pesados.
Compuestos organofosforados: Actúan sobre enzimas serínicas (tripsina, elastasa, acetil colinesterasa), uniéndose covalentemente a través del grupo fosfato.
Ejemplos: Insecticidas: DFP, Parathion, Malathion. Gases de guerra: Sarín, gas mostaza.
Ion cianuro, CN-: Se fija con gran afinidad a la sexta posición de coordinación del Fe hemínico del complejo citocromo oxidasa.
Penicilinas: Inhiben enzimas serínicas que participan en la formación de la pared bacteriana.
Inhibidor Suicida: Son inhibidores activados enzimáticamente. Son muy poco reactivos, pero se unen al centro activo de manera específica igual que el sustrato o los inhibidores competitivos. Tienen la misma especificidad del inhibidor competitivo y la potencia del inhibidor irreversible. El inhibidor se fija a la enzima y forma el complejo EI. El inhibidor se activa con la acción catalíticamente la enzima y forma un complejo muy estable y reactivo que se une con la enzima irreversiblemente (enlace covalente).
Ej: sistema de la β-lactasa bacteriana. Los antibióticos se usan masivamente y se crea resistencia, produciendo las bacterias β-lactamasa. El ácido calvalánico se une a la enzima, que primero lo hace reactivo y luego se une covalentemente. Con ello se consigue que la enzima no transporte las penicilinas.
Regulación Enzimática
En cada ruta metabólica hay enzimas con capacidad reguladora, es decir, que controlan la activación o inactivación de una ruta metabólica para coordinar el metabolismo y evitar que rutas con actividad opuesta estén activas a la vez.
Las enzimas reguladoras cambian su actividad catalítica con una señal, y adopta la ruta metabólica que se adapte a las necesidades fisiológicas.
Distinguimos la regulación a largo plazo y a corto plazo.
Regulación a largo plazo
Regulamos la cantidad de enzima y con ello la actividad enzimática. Es muy lenta y sule deberse a cambios nutricionales.
Distinguimos:
Regulación a nivel de sustrato: El producto de una reacción actúa como inhibidor competitivo de la enzima que lo produce. Ej: hexoquinasa por glucosa-6-fosfato.Glucólisis.
*Cuando el producto está en el centro activo, la enzima está inhibida porque no puede entrar el sustrato.
Regulación por modificaciones covalentes reversibles.
Retrohibibición (Feed back negativo): El producto final de una ruta inhibe enzimas del principio de la ruta, es decir, el producto actúa como modulador negativo de la ruta ya que es el inhibidor de la primera enzima de la ruta para controlar así la cantidad de productos.*Alosterismo.
Alosterismo
Es la modulación de la actividad enzimática que se desarrolla fuera del centro activo.
La regulación se da en un sitio diferente al centro activo, se da en el centro alostérico, donde se unen los moduladores o efectores alostéricos de manera reversible. Al unirse el modulador se modifica el centro activo: activando o desactivando la enzima.
Distinguimos dos tipos de alosterismo:
Alosterismo homotrópico: Se da entre centros equivalentes. Existe una cooperatividad. El sustrato actúa como efector, la unión de uno favorece la unión de los demás.
Alosterismo heterotrópico: Efecto de centros reguladores sobre centros activos. El efector es diferente al sustrato.
Enzimas alostéricas
Son proteínas oligoméricas (formada por varios protómeros). Son simétricas, ya que cada protómero está formado por un sustrato, un modulador positivo (aumenta) y un modulador negativo (disminuye).
Las enzimas tienen sitios específicos para el sustrato y otro para los moduladores( si los moduladores son positivos aumentan la actividad y los negativos la disminuyen). Si tienen en cada subunidad un centro activo y una subunidad por modulador son homopoliméricas. Si el centro alostérico y el catalítico están en diferentes subunidades son heteropoliméricas.
Pueden existir en diferentes conformación: R y T.
Conformación R: Activa. Tiene mayor actividad catalítica. Está estabilizado por un activador alostérico.
Conformación T: Inactiva. Poca actividad catalítica. Está estabilizado por un inhibidor alostérico.
L=[R][T]
L=[R][T]
La constante alostérica es:
Cada estado representa una capacidad catalítica diferente.
Las enzimas alostéricas no siguen la cinética de Michaelis-Menden, sino una cinética sigmoidal (implica cooperatividad).
El efecto heterotrópico es el efecto que producen los efectores alostéricos heterotópicos. Distinguimos:
Efectores + : Aumentan la afinidad enzimática por el sustrato. Estabilizan el estado R.
Efectores - : Disminuyen la afinidad de la enzima por el sustrato. Estabilizan el estado T.
Regulación alostérica de la Treonina desaminasa
La Treonina desaminasa es una enzima implicada en la síntesis de Isoleucina.
Regulación alostérica de la Aspartato transcarbamilasa (ATcasa)
La ATcasa es la primera enzima de la síntesis de pirimidinas.
El ATP y CTP son moléculas fosforadas que incluyen una base nitrogenada y una molécula de monosacárido.
Las bases púricas estimulan la formación de pirimidínicas. Mantienen el equilibrio entre bases.
Tiene subunidades catalíticas y reguladoras. Las catalíticas para el sustrato y las reguladoras para modular el ATP y el CTP.
La forma T es menos activa, por lo que el producto la estabiliza. Por ello en presencia de CTP se desplaza hacia el estado T y en presencia de ATP se desplaza hacia la forma R.
Modelos Alostéricos
Hay dos modelos matemáticos que intentan explicar la modulación alostérica. Lo hacen teniendo en cuenta la existencia de los estados R y T. Estos modelos son:
Modelo concertado o MWC: La unión del sustrato a un centro favorece el paso de la forma T a R en todas las subunidades de la proteína.
Modelo secuencial o KNF: La unión del sustrato a un centro favorece el paso de la forma T a la R en las subunidades vecinas sin inducir necesariamente una transición que afecte al enzima completo.
Modificaciones Covalentes Reversibles
Es típico en fosforilación oxidativa. No todas las enzimas se fosforilan. La fosforilación activa o inactiva la proteína, y la desfosforialción hace el proceso contrario.
El grupo fosfato suele unirse con un grupo OH (serina, tirosina). La proteína que cataliza la transferencia de un grupo fosfato de un donador a un aceptor se llama quinasa.
También puede modificarse por una adenina (adeninación), por una uridina, por ADPribosa, o por metilación en un grupo de glutamato. Esto se añade o se quita a posteriori de la formación de la enzima. Todas estas modificaciones están catalizadas por una enzima.
Tipos de Regulación Enzimática
Regulación a corto plazo: Regula la actividad de la enzima. Puede ser:
Regulación a nivel de sustrato.
Retroinhibición. Mecanismos alostéricos por uniones no covalentes.
Regulación por modificaciones covalentes reversibles.
Regulación a largo plazo: Regula la cantidad de la enzima. Puede ser:
Regulación de la síntesis y degradación.
Regulación por modificaciones covalentes irreversibles.
Isoenzimas.
Modificaciones Covalentes Irreversibles
Consiste en la activación de zimógenos por ruptura proteolítica.
Zimógenos o proenzimas: Proteínas inactivas que se activan cuando pierden una parte de la estructura peptídica por ruptura proteolítica.
La activación secuencial de proenzimas permite dar respuestas.
Un ejemplo de ellas son las enzimas digestivas.
Las pancreáticas se activan en el intestino delgado, pero se almacenan y sintetizan en el pánceas.
Isoenzimas
Son las diferentes formas moleculares de una enzima que catalizan la misma reacción. Tienen distinto comportamiento cinético y diferentes propiedades físicas y bioquímicas
Esto ocurre en distintos tejidos, durante diferentes etapas de desarrollo y en diferentes compartimentos celulares.
Reacciones Químicas
Reacción elemental: Es aquella que ocurre en un solo paso, sin reacciones intermedias.
Reacciones no elementales: Ocurre en varios pasos, con reacciones intermedias.
