Segundo taller de Bioquímica: Enzimas y ácidos nucleícos 1. El ADN y el ARN se encuentran formados por bases nitrogenadas y las proteínas por aminoácidos. La producción de estas tres sustancias se encuentra relacionada entre sí, de tal forma que para la producción de proteínas es necesaria la presencia previa de ADN y/o ARN. El siguiente cuadro indica con signo (-) las sustancias que se les suprimen a cuatro cultivos de células
Al analizar los resultados después de un tiempo se espera que probablemente: a. b. c. d.
Ocurra producción de proteína en los cultivos 3 y 4 y de ARN en 2 y 4. Se produzcan ADN y proteínas en 2 y 4 pero ARN sólo en el cultivo 4. En el cultivo 3 se produzca proteína, ADN y ARN. Se produzca ARN en 2 y 4 y proteína únicamente en 4.
2. Suponga que el color rojo de los tomates está determinado por una proteína formada por los siguientes aminoácidos: Ala – Cis – Val. En la siguiente tabla se muestra la secuencia de ARN mensajero (ARNm) que codifica el respectivo aminoácido.
Al cosechar los tomates se observa que algunos presentan manchas blancas en su superficie. Estas manchas se deben a una mutación en sólo uno de los nucleótidos del ADN que forma la proteína. ¿Cuál de las siguientes secuencias de ADN presenta esa mutación? a. b. c. d.
TAT CAT CAA. CAT ACG CAA. CAT ACG GAA. CAT TAT CAA.
3. La cadena complementaria de ARN de la secuencia de DNA, AGTTCGCAATGC es: a. TCAAGCGTTACG b. TCUUGCGTTUCG c. UCAAGCGUUACG d. TCUUCGCTTUCG 4. La duplicación del ADN es un proceso que conlleva a la formación de más ADN, mientras que en la transcripción se forma ARN a partir de ADN. Se tiene la cadena de
ADN ATGCGT. De acuerdo con esto, las cadenas resultantes de para éstos dos procesos son (la duplicación y/o la transcripción):
5. ¿Cuántas secuencias de nucleótidos distintas son posibles para un fragmento de DNA de longitud N si es: (a) de hebra sencilla; (b) de doble hebra? 6. ¿Cuánto pesa el DNA de una célula humana? ¿Y el del cuerpo humano completo? (Datos: La longitud del genoma haploide es de 3.3·109 pb. El peso de un par de nucleótidos es de 10-21 gramos. El cuerpo humano tiene alrededor de 2 billones de células). 7. En el DNA de ciertas células bacterianas, el 13% de los nucleósidos son adenosina. ¿Cuáles son los porcentajes de los otros nucleósidos? 8. Los pares G-C son estructuralmente más estables que los A-T. ¿Correcto? 9. ¿Qué significa que las secuencias de dos cadenas de DNA sean complementarias? 10. En el siguiente experimento con la enzima fosfatasa ácida de semillas de trigo germinadas se varió la concentración de la enzima en cubeta a dos concentraciones de sustrato y se obtuvieron los resultados siguientes: [Enz] (ml) [FP] 0.1 mM
[FP] 10 mM
V (nmol/min) V (nmol/min) 5
1.920
6.307
10
4.059
13.169
15
5.956
19.145
20
7.766
25.694
25
9.479
32.282
30
11.844
37.882
a) ¿Como varia la velocidad de la reacción en función de la cantidad de enzima añadida? b) ¿Qué pasa si dividimos la velocidad registrada por la cantidad de enzima añadida al ensayo? c) ¿Utilizando la ecuación de Michelis-Menten explique sus respuestas a las preguntas anteriores?
11. La actividad de la Acetil-CoA carboxilasa, medida con tres diferentes concentraciones de enzima y a diferentes concentraciones de sustrato fué la siguiente: [Enz] (mg de proteína) 0.1 [AcetilCoA] (mM)
0.2
0.5
Vel (mmol/ min)
0.05
0.275
0.546
1.373
0.14
0.482
1.001
2.502
0.23
0.580
1.185
2.891
0.32
0.642
1.385
3.463
0.50
0.755
1.494
3.656
0.59
0.766
1.497
3.810
a) Calcular para cada experimento el valor de Km y el valor de Vmax. b) ¿Son los valores de Km y Vmax iguales o diferentes? c) Explique si lo que observó es lo que esperaba obtener d) Sabiendo que la enzima pesa 220 000 g/mol, haga una gráfica de Vmax vs mmol de enzima. e) ¿Qué representa la pendiente de esta gráfica? f) ¿En qué se parece el valor anterior a la Actividad específica = Vmax/mg de proteína en mmolxmin-1 x mg de enzima-1? g) ¿Qué pasa con la medida de actividad específica cuando la enzima no está pura? 12. Considere a la enzima Invertasa, que cataliza la hidrólisis de Sacarosa a fructosa y glucosa. Esta enzima posee una Km para sacarosa de 0.5 mM y una constante catalítica de 175 min-1. Si se mide su actividad en presencia de 0.25 mM de sacarosa con 25 pmol de enzima en la cubeta: a. ¿Qué velocidad de catálisis se observará? b. ¿Qué fracción representa esto de la Vmax que se podría calcular en esta reacción si se variase la cantidad de sacarosa? c. ¿Cuánto sustrato habría que añadir para que la velocidad observada alcanzase 0.95% de la Vmax? d. ¿Qué importancia podría tener esto para la posible aplicación industrial de la enzima? e. Explique sus respuestas. 13. La enzima Aspartato transaminasa, que cataliza la reacción: Aspartato + Oxoglutarato ----> Glutamato + Oxaloacetato se realizaron los siguientes tres experimentos:
[Asp] =1 mM
[OxG] =0.02 mM
[OxG] =0.5 mM
[OxG] (mM)
Vel (mmol/min)
[Asp] (mM)
Vel (mmol/min)
[Asp] (mM)
Vel (mmol/min)
0.002
0.444
0.007
0.411
0.007
0.468
0.018
2.031
0.048
1.268
0.048
2.017
0.037
2.781
0.171
1.722
0.171
3.317
0.063
3.336
0.335
1.850
0.335
3.866
0.094
3.756
0.547
1.983
0.547
4.123
0.493
4.324
1.016
2.031
1.016
4.324
a) Calcule Km y Vmax para cada sustrato. b) ¿Cambian las Vmax? Explique su respuesta c) Explique que pasó en el segundo experimento, con respecto al tercero. d) ¿Cúantos y cuáles valores de Km debo considerar para describir la afinidad de la enzima por sus substratos? e) ¿Qué conclusión se podría sacar de esos datos? 14. Para la enzima catalasa se realizó un experimento en el que se determinó la velocidad de descomposición del peróxido de hidrógeno en ausencia ó en presencia de 10 nM de enzima en el ensayo. Suponiendo que la concentración de peróxido de hidrógeno fue suficiente para garantizar la saturación de la enzima, calcular la energía de activación de la reacción con o sin enzima y discuta sus resultados. (R=1.987 cal/mol/ºK) T
Vo (sin catalasa) Vo (con catalasa)
(ºC)
(mol/s)
(mol/s)
4
0.40E-08
0.0410
10
7.74E-09
0.0464
15
1.31E-08
0.0476
20
2.09E-08
0.0497
25
3.52E-08
0.0530
30
5.74E-08
0.0598
15. Los valores de Km y Vmax siguientes se determinaron midiendo la hidrólisis de bromuro de acetilcolina catalizada por la esterasa bovina a diferentes temperaturas: T (ºC) KM (mM) kcat (mmolxmin-1 /pmol_[E]t-1)
20
0.403
0.307
25
0.375
0.322
30
0.335
0.340
35
0.305
0.362
45
1.500
0.013
a) ¿Qué intervalo de termperaturas deberían emplearse como datos para calcular la energía de activación de la reacción catalizada por la enzima?. c) Para ralizar el cálculo anterior: ¿debería emplearse los valores de Km o de kcat. b)-¿Por qué varía Km con la temperatura? (sugerencia: vea la deficinción de KM). 16. Los siguientes valores de velócidad inicial de enzimas fueron obtenidos para la aQuimotripsina actúando sobre un sustrato artificial (ester etílico de acetil-L-triptofano): pH
V (ui)
pH
V (ui)
5.4
10
6.8
192
5.6
19
7.2
260
5.8
32
7.4
280
6.4
99
7.8
300
6.5
112
8.0
328
6.6
141
8.4
331
9.0
327
Ui = unidades internacionales a) Determine los valores de pKa(s) del (los) grupo(s) involucrado(s) en este comportamiento. b) Diga que residuos de aminoácido podrían responsables de esta respuesta. c) Si el experimento se extendiera hacia la región más alcalina de la escala de pH que cabría esperar (explique su respuesta). 17. Se realizaron estudios de inhibición para dos enzimas diferentes presentes en el suero bovino. Se varió la concentración de sustrato en ausencia y en presencia de tres concentraciones diferentes de inhibidores de cada enzima. En cada caso encontrar: a) El tipo de inhibición. b) El valor de Km y Vmax. c) El valor de Ki para el inhibidor. Enzima: Fosfatasa alcalina de suero bovino, inhibidor: Oxalato de Bromolevamisol
[Bromolevamisol] (mM) 0 [Sustrato] [FP](mM)
8
16
40
Velocidades iniciales (mmolxmin1 / mgProt.-1)
0.1
0.231
0.210
0.191
0.158
0.3
0.431
0.369
0.309
0.239
0.7
0.607
0.488
0.425
0.277
1.3
0.751
0.599
0.467
0.304
1.8
0.811
0.657
0.530
0.319
2.6
0.912
0.657
0.546
0.328
4.1
0.957
0.688
0.561
0.351
5.8
0.981
0.741
0.558
0.344
Enzima: Transaminasa Glutámico Pirúvica. [2hidroxisuccínico] (mM) [Sustrato] [Glu](mM)
0.0
1.0
2.0
5.1
Velocidades iniciales (mmol / min /mgProt)
0.6
0.59
0.48
0.38
0.24
1.4
1.12
0.91
0.78
0.51
2.9
1.63
1.43
1.19
0.87
5.2
1.94
1.70
1.64
1.19
8.0
2.19
1.94
1.94
1.56
10.3
2.28
2.06
1.99
1.74
16.0
2.32
2.33
2.24
1.89
25.1
2.62
2.53
2.25
2.09
18. El siguiente experimento fué realizado con la fosfoenolpyruvato:pyruvil tranferasa de streptococcus sp. Este enzima participa en la síntesis de la pared celular de las bacterias y cataliza la transferencia de un grupo piruvilo a un precursor del péptidoglicano, liberando fosfato. La fosfomicina (FSM) es un antibiótico sintetizado por ciertas bacterias del grupo streptomyces que inhibe a esta enzima. Usando el fosfoenolpiruvato (PEP) como sustrato a dos diferentes niveles de concentración, se estudió la inhibición de esta enzima por fosfomicina.
[PEP] (mM) [FSM] (mM)
75
200 -1
V (nmolxmin xmgProt-1)
0
0.73
2.49
5
0.53
2.29
10
0.42
2.15
25
0.26
1.78
50
0.16
1.4
100
0.09
0.98
a) Identifique el tipo de inhibición que se presenta b) Calcule el valor de la I50 para este inhibidor a la concentraciones más baja y más alta de sustrato empleadas en el experimento. b) ¿Qué diferencias observa entre este parámetro calculado con diferentes concentraciones de sustrato? 19. Explique en términos termodinámicos porque una enzima que pueda estabilizar el complejo de Michaelis ES tanto como el estado de trasición ES#, no cataliza la reacción. 20. ¿Cuáles son los principales factores que alteran la velocidad de las reacciones enzimáticas? 21. ¿Cómo afecta la concentración del sustrato a la velocidad de las reacciones enzimáticas? 22. ¿Cuál es la relación entre el enfriamiento de órganos y tejidos para trasplantes médicos y el efecto de la temperatura sobre las reacciones enzimáticas? 23. ¿Qué son los cofactores enzimáticos? 24. ¿Cuál es la relación entre las vitaminas y los cofactores enzimáticos? 25. En una reacción enzimática, ¿cuál es el efecto de una sustancia con la misma conformación espacial que el sustrato enzimático? ¿Cómo se reconoce este tipo de sustancia? 26. ¿Qué son las enzimas alostéricas? 27. Con la siguiente actividad enzimática los resultados determinan: a. Vmax b. ¿Por qué la velocidad v es constante en [S] mayor que 2 x 10-3 M? c. ¿Cuál es el [E] libre en [S] = 2 x 10-2 M?
28. Los resultados para el análisis de la actividad enzimática se pueden encontrar a continuación. Sin utilizar un gráfico, determinar: a. b. c. d.
Vmax; Km; Velocidad inicial en [S] = 1 x 10-1 M; La cantidad de producto formada durante los primeros 5 minutos a [S] = 2 x 10-3 M. A [S] de 2 x 10-6 M? e. ¿Cual es Km y Vmax si el [E] libre se incrementa en un factor de 4?
29. Se estudia el efecto del pH sobre la actividad enzimática de la 6-fosfogluconato deshidrogenasa. Esta enzima cataliza la reacción: 6-phosphogluconate + NADP ---! 6- phosphogluconic acid + NADPH2 NADPH2 absorbe luz a 340 nm. La actividad de la deshidrogenasa se mide espectrofotométricamente controlando la absorbancia (A) a 340 nm, que es proporcional a la concentración de NADPH2. ¿A qué pH la enzima tiene más afinidad por el sustrato?
30. Los siguientes resultados describen el efecto de un inhibidor sobre la actividad enzimática de una enzima. Determinar: a. b. c. d.
Vmax en presencia y ausencia de un inhibidor Km en presencia y ausencia de un inhibidor Ki Tipo de inhibición
31. Un bioquímico estudia las propiedades de una enzima metabólica que acaba de aislar. Obtiene datos cinéticos en presencia y en ausencia de dos inhibidores diferentes (A y B). La identidad de los inhibidores es desconocida, pero sabemos que uno de ellos es un análogo de sustrato mientras que el otro es un agente alquilante. Determinar: a. b. c. d.
Km y Vmax de la enzima; ¿Cuál inhibidor es el análogo de sustrato? ¿Cuál es el agente alquilante? Ki para ambos inhibidores; Cuál sería la Vo para esta reacción enzimática en [S] = 3 x 10-4 M y en presencia de la Inhibidor [A] = 2 x 10 -5 M ?
32. Se estudian las propiedades cinéticas de dos enzimas (A y B). A partir de los resultados que se muestran a continuación, determine si constituyen una enzima ordinaria o una enzima alostérica. Explicar la forma de las curvas que representan la velocidad, v, en relación a la concentración de sustrato, [S].
Para los siguientes ejercicios necesita la siguiente tabla
33. La secuencia de aminoácidos de una parte de lisozima aislada de un tipo salvaje y un bacteriófago mutante T4 se da a continuación: Tipo salvaje: -Tyr - Lys - Ser - Pro - Ser - Leu - Asn - Ala - Ala - Lys Mutante: -Tyr - Lys - Val - His - His - Leu - Met - Ala - Ala – Lys a. Este mutante puede ser el resultado de un cambio en un único par de bases en el ADN del fago T4? Si no, ¿cómo se produjo este mutante? b. ¿Cuál es la secuencia base del ARNm que codifica los cinco aminoácidos del tipo salvaje que son diferentes de los del tipo mutante? 34. Una hebra de ADN tiene la siguiente secuencia: 5 'TCGTTTACGATCCCCATTTCGTACTCGA 3' a. b. c. d.
¿Cuál es la secuencia de su hebra complementaria? ¿Cuál es la secuencia base del ARNm transcrito de la primera cadena? ¿Cuál es la secuencia de aminoácidos codificada? ¿Cuál es la secuencia de aminoácidos codificada si se suprime el segundo T del extremo 3 'del ADN?
