Página Índice Prólogo
2
Material de Laboratorio
3
Preparación de soluciones
7
Ósmosis
11
Obtención de muestras de sangre
14
Proteínas totales y albúmina séricas
18
Emulsificación de aceite
24
Amilasa sérica
27
Fosfatasa alcalina sérica
31
Glucosa plasmática
36
Lactato plasmático
40
Triacilgliceroles séricos
44
Colesterol sérico
48
Colesteroi-LBD y Colesteroi-LAD séricos
53
Transaminasas séricas
60
Urea sérica
67
Capacidad amortiguadora del plasma sanguíneo
72
Cuantificación de Hemoglobina glicada
78
Examen general de orina
83
Creatinina sérica y depuración
93
Hematocrito, hemoglobina y concentración media de hemoglobina celular
99
Identificación de grupos sanguíneos
104
Recuento plaquetario
109
Bilirrubinas séricas
115
Ácido úrico sérico
120
Fosfatasa ácida sérica
125
PRÓLOGO
La Bioquímica es una ciencia que explica la naturaleza química de muchos y muy diversos procesos que forman parte esencial de lo que determina la vida de una célula y del organismo en su conjunto. Para el estudiante de Medicina, la Bioquímica es una disciplina fundamental de apoyo para la comprensión de los fenómenos fisiológicos cuyas alteraciones presentan relación directa con las manifestaciones clínicas de las patologías. El conocimiento bioquímico, igual que ocurre con otras disciplinas, avanza gradualmente conforme se desarrolla la investigación. Esto ha permitido entender los fundamentos bioquímicos relacionados con las manifestaciones clínicas de múltiples patologías, pudiendo interpretar la presentación de signos y síntomas desde la perspectiva bioquímica. Sin embargo, existen todavía casos en los cuáles la
información es
insuficiente para establecer dichas relaciones y en ellos las asociaciones de las patologías con sus expresiones clínicas se catalogan como empíricas. Los programas de Bioquímica de las escuelas y facultades de Medicina de las universidades mexicanas deberían estar orientados fundamentalmente a que los conocimientos que construyan los alumnos vinculen cada vez más los contextos básico y clínico. Este es el camino que hemos seguido en nuestro programa durante muchos años. En este contexto se enmarca el presente Manual de Prácticas de Bioquímica, cuyos propósitos fundamentales son que el alumno reafirme los conocimientos adquiridos con el programa teórico 1
relacionándolos con aspectos fisiológicos y patológicos relevantes, que aprenda el manejo básico del laboratorio de Bioquímica Clínica, y de manera muy especial, que aprenda la pertinencia de las pruebas de laboratorio para la obtención de datos que le permitan fundamentar diagnósticos con un criterio científico. Aunque se ha realizado un esfuerzo serio para que tanto los contenidos como la presentación de este trabajo sean congruentes con las necesidades académicas de gran competitividad que prevalecen en la actualidad en el mundo de la Medicina, sin duda es una obra perfectible y será bienvenida toda sugerencia que permita mejorarlo.
Los autores
2
MATERIAL DE LABORATORIO
OBJETIVO El alumno identificará y explicará la utilidad del equipo y de los distintos materiales comúnmente utilizados en el laboratorio de Bioquímica.
GENERALIDADES La tecnología del laboratorio de análisis clínicos se emplea para realizar con la mayor exactitud las diversas pruebas químicas a fin de que los resultados generados sean correctos, dada la importancia que esto tiene para que la interpretación que haga el médico permita un diagnóstico confiable. Para lograr este propósito, el alumno debe seguir cuidadosamente el método de cada práctica, utilizando los materiales y equipo apropiados. Por otra parte, es muy importante que el alumno preste mucha atención en lo que esté realizando a fin de evitar accidentes que podrían ser graves. Debe tener presente en todo momento las posibles causas de accidentes para poder evitarlos oportunamente y disminuir así la probabilidad de sufrir daños en su integridad física. Peligros a los que se encuentra expuesto el alumno al trabajar en el laboratorio:
l.
Quemaduras y escaldaduras (quemaduras producidas por líquidos o por vapor)
2.
Laceraciones por vidriería rota
3.
Infecciones diversas
4.
Intoxicación por reactivos venenosos o cáusticos
CLASIFICACIÓN Y USO DE MATERIAL Y EQUIPO DE LABORATORIO Medición de masa (peso)
Balanza granataria. Se utiliza para medir cantidades de masa relativamente grandes (> 0.5 g) de sustancias generalmente sólidas
Balanza analítica. Se utiliza para medir con exactitud cantidades de masa relativamente pequeñas (aproximadamente 5 a 500 mg), aunque también pueden medirse masas mayores.
3
Medición de volumen
Pipetas graduadas. Son tubos con diámetro interno uniforme, de diferentes capacidades y calibradas. Son muy utilizadas debido a que con una misma pipeta se pueden medir diferentes volúmenes. Debe utilizarse la pipeta que sea más adecuada al volumen por medir. Per ejemplo, para medir 2.5 ml se utiliza una pipeta de 5 ml, para medir 0.5 ml, una de 1 ml, etc. Deben cargarse mediante dispositivos especiales que eviten pipetear con la boca (propipetas), evitando así el riesgo de contacto de la solución con la boca.
Pipetas Pasteur. Son tubos de vidrio con una punta delgada y larga. No tienen graduación y se utilizan fundamentalmente para transferir a un tubo limpio el suero o el plasma de una muestra de sangre después de centrifugada, y para llenar con sangre completa los tubos de Wintrobe para la determinación del hematocrito.
Micropipetas. Son instrumentos muy útiles para la medición de volúmenes pequeños con un alto grado de exactitud. Existen micropipetas con diferentes capacidades, siendo las más comunes las que miden 1-10 ¡.tl, 10-250 ¡.tl y 100-1000 ¡.tl.
Probetas. Son contenedores cilíndricos de vidrio, graduados y de diferentes capacidades. Se utilizan para medir volúmenes aproximados ya que son materiales de baja exactitud.
Matraces aforados o volumétricas. Son contenedores de vidrio que tienen un tallo relativamente delgado que presenta una marca denominada afore, la cual indica el nivel al que debe llevarse el líquido para que el volumen medido corresponda al indicado en el matraz. Se utiliza para la preparación de soluciones con concentración porcentual(% p/v), molar, osmolar o normal.
Matraces Erlenmeyer. Son contenedores de vidrio de forma cónica y fondo plano que se utilizan para medir volúmenes aproximados de líquidos y si es necesario, para calentarlos con bajo grado de evaporación.
Vasos de precipitados. Son recipientes de vidrio utilizados para medir volúmenes de líquidos, con muy baja exactitud. También se utilizan para calentar o hervir líquidos cuando no importa que se evaporen en grado importante, o simplemente como contenedores de sustancias líquidas.
Tubos de ensayo. Son tubos de vidrio con diferentes dimensiones que se utilizan para llevar a cabo las reacciones químicas. Materiales varios
Mechero de Bunsen. Es un dispositivo que se utiliza para calentar líquidos, mediante la combustión de gas.
4
Gradillas. Dispositivos generalmente metálicos utilizados para mantener los tubos de ensayo en posición vertical
Espátulas. Dispositivos generalmente metálicos, planos, sin filo y con el extremo romo, utilizados para transferir sustancias sólidas, típicamente al medir determinadas masas de ellas.
Equipo
Centrífuga. Es un instrumento que contiene un rotor capaz de girar varios miles de revoluciones por minuto. Presenta espacios en los que se colocan los tubos que contienen el material que se desea centrifugar para lograr la separación de sus componentes. Típicamente se utiliza para separar el suero del coágulo o el plasma del paquete globular, en muestras de sangre.
Potenciómetro. Es un instrumento electrónico que cuenta con un electrodo sensible a la concentración de hidrogeniones de cualquier medio líquido. Antes de medir el pH de la solución que interese, debe calibrarse con un amortiguador de pH 7.0. Proporciona la lectura directamente como un valor de pH.
Espectrafotámetra. Es un aparato electrónico capaz de medir la cantidad de luz que pasa a través de una solución (transmitancia) o la que absorbe dicha solución (absorbancia, extinción o densidad óptica). La luz que incide en la solución tiene una longitud de onda específica que se selecciona con una perilla u otro dispositivo del aparato. Se utiliza para la determinación de la concentración de solutos generalmente coloridos, bajo el principio de que mientras más concentrado se encuentra el so luto, menor es la transmitancia de la solución y mayor su absorbancia si se utiliza luz con la longitud de onda adecuada. EJERCICIOS
1. Compare la exactitud de un matraz volumétrico de 100 ml y de una probeta de 100 ml, midiendo 100 ml de agua en la probeta y pasando el líquido al matraz. Anote sus observaciones. 2.
Mida los siguientes volúmenes de agua: 25 ¡.¡L, 40 ¡.¡L, 0.2 ml, 0.7 ml, 1.5 ml, 2.8 mL, 4.5 ml, 7.5 ml y 9.5 ml, indicando qué pipeta utilizó en cada caso.
3. Transforme los volúmenes que se mencionan en el punto 2, de manera que cada uno quede expresado en micro litros, mililitros y litros.
S
RESULTADOS, DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
6
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES OBJETIVO l.
El alumno preparará varias soluciones, para lo cual calculará previamente las cantidades de so luto y/o solvente necesarias.
2.
El alumno ejercitará la interconversión de unidades para expresar la concentración de soluciones.
GENERALIDADES
Las soluciones son mezclas homogéneas de dos o más sustancias. En una solución, el so luto es la sustancia disuelta y el solvente es la sustancia que disuelve. En el campo de la Biología, el solvente más común es el agua, la cual disuelve sustancias polares, es decir sustancias cuya estructura molecular presenta cargas formales (positivas, negativas o ambas), y/o dipolos. Por ejemplo, el cloruro de sodio (NaCI), consta de iones Na• y
cr;
los azúcares, como la glucosa, tienen gran
cantidad de grupos oxhidrilo (-OH), los cuales son estructuras dipolares (presentan ¡¡• y ¡¡-¡. En cualquier caso, el principio de disolución está dado por la capacidad de interacción eléctrica entre las moléculas de agua y las moléculas de soluto. Las sustancias hidrofóbicas, que carecen de grupos polares, no son solubles en agua. Entre ellas se encuentran el aceite, la gasolina, el éter, etc.
La concentración de las soluciones puede expresarse en diversas formas: porcentaje peso/
volumen (% p/v), que es el número de gramos de soluto disueltos en cada 100 mL de solución (100 mL = 1 dL); molaridad (M), que es el número de moles de soluto disueltos en cada litro de solución; osmolaridad (OsM), que es el número de osmoles de soluto disueltos en cada litro de solución; normalidad (N), que es el número de equivalentes químicos de soluto disueltos en cada litro de solución; molalidad (m), que es el número de moles de soluto disueltos en cada kilogramo de solvente; y osmolalidad (Osm), que es la cantidad de osmoles de soluto disueltos en cada kilogramo de solvente. IMPORTANCIA CLÍNICA
En su mayoría, los nutrientes se hacen llegar a los distintos tejidos disueltos en el plasma sanguíneo y por el mismo medio se canalizan los productos de desecho hacia las vías de excreción. Desde este punto de vista, el plasma sanguíneo es una solución que contiene muy diversos so lutos 7
a concentraciones variables. En muchos casos la determinación de la concentración de estos so lutos tiene gran importancia diagnóstica. En la clínica, la concentración de los so lutos se expresa en las unidades más convenientes de acuerdo con las concentraciones normales correspondientes. Así, la concentración de albúmina se expresa en % p/v o en g/l, con un intervalo normal de 3.6 a 4.7 g/dL o 36 a 47 g/L. En cambio, la concentración de glucosa, urea y otras sustancias, se expresa en mg/dl o en milimolaridad (mM ' número de milimoles de soluto por cada litro de solución) debido a que la concentración de estos solutos es relativamente baja en condiciones normales: 55 a 110 mg/dL (3.0 a 6.1 mM) y 20 a 45 mg/dL (3.3 a 7.5 mM) para glucosa y urea, respectivamente. En el plasma existen solutos con concentraciones normales aún menores, debiendo utilizarse para tales casos una unidad menor, como ¡.tg/dL (microgramos por decilitro) o ¡.tmoles/L (micromoles por litro o micromolaridad). Por ejemplo, la concentración normal de hierro en la sangre de hombres adultos es de 80 a 180 ¡.tg/dL o 14 a 32¡.tM. La concentración total de solutos en el plasma sanguíneo se expresa en unidades de miliosmolalidad (mOsm), la cual depende fundamentalmente del sodio y sus aniones, de la
glucosa y de la urea. Los límites normales de dicha concentración son de 280 a 300 mOsm aproximadamente.
MATERIAL
1. Balanza granataria
2. Espátulas 3. 1 matraz volumétrico de 50 mL 4. 3 matraces volumétricos de 100 mL 5. 1 matraz volumétrico de 250 mL 6. 1 vaso de precipitados de 100 mL 7. 1 vaso de precipitados de 250 mL 8. Glucosa, cloruro de sodio y sulfato de sodio
8
PROCEDIMIENTO
l. Calcular la cantidad de soluto (en gramos) y/o solvente (en mililitros) necesaria para
preparar cada una de las soluciones propuestas. 2.
Pesar el so luto con la mayor exactitud posible, utilizando una balanza granataria.
3. Transferir la masa de soluto al recipiente correspondiente. Si se trata de un matraz volumétrico, añadir un poco de agua destilada para disolver el soluto y aforar enseguida. En caso de que exista riesgo de que se tire el soluto al momento de pasarlo al matraz, es preferible poner el soluto en un vaso de precipitados, disolverlo ahí y posteriormente pasarlo al matraz. 4. Al preparar una solución con molalidad u osmolalidad definida, añadir al vaso de precipitados que contenga al so luto la cantidad total de solvente necesaria, medida con el recipiente graduado más adecuado y disolver agitando con una varilla de vidrio. PREPARE LAS SIGUIENTES SOLUCIONES:
l.
50 ml de solución de glucosa al 5% p/v
2.
100 ml de solución de cloruro de sodio al 0.9% p/v
3.
100 ml de solución de sulfato de sodio 0.05 M
4. 100 ml de solución de sulfato de sodio 0.1 N 5.
250 ml de solución de cloruro de sodio 0.1 OsM
6.
solución 0.2 m de glucosa, utilizando 2g de so luto
7.
solución 0.5 Osm de cloruro de sodio, utilizando 3g de soluto
EJERCICIOS
a)
Calcule la molaridad de las soluciones 1 y 2
b)
Calcule la osmolaridad de la solución 3
e)
Calcule la molaridad y la osmolaridad de la solución 4
d)
Calcule la molaridad y la normalidad de la solución 5
e)
Si en lugar de preparar la solución del punto 6 añadiera 100g de agua a la cantidad de soluto indicada, ¿qué molalidad produciría?
f)
Si la solución 7 se pasa integra a un matraz volumétrico de 1 litro y se afora, ¿qué concentración molar y osmolar tendría la solución resultante?
g)
Calcule la milimolaridad de las soluciones 1 a 5 y la miliosmolalidad de las soluciones 6 y 7 9
BIBLIOGRAFÍA
Mendoza-Medellín, A. Nociones de Química para las áreas médica y biológica, UAEM 2007 RESULTADOS, DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
10
ÓSMOSIS
OBJETIVOS
1.
El alumno demostrará el fenómeno de la ósmosis en un dispositivo experimental
2.
El alumno explicará la importancia de la ósmosis en la distribución de líquidos en los distintos compartimentos del organismo
GENERALIDADES
Los sistemas separados por membranas, en donde existen diferencias en la concentración de solutos no difusibles, tienden a equilibrar las concentraciones de soluto a ambos lados de la
membrana transfiriendo solvente del compartimiento más diluido al más concentrado. Este fenómeno se conoce como ósmosis y, se diferencia de los procesos de difusión en que en estos últimos es el soluto el que se transfiere a través de la membrana en el sentido en que las concentraciones de so luto tienden a igualarse en ambos compartimientos. La presión osmótica es una medida de la fuerza con que ocurre la ósmosis y depende del gradiente de concentración osmolal de los solutos no difusibles, de manera que a mayor gradiente corresponde mayor presión osmótica. La presión osmótica que ejercen los solutos coloidales, como son las proteínas, se conoce como presión oncótica.
IMPORTANCIA CLÍNICA
La distribución de los líquidos en los diversos compartimentos del organismo humano se regula por eventos de ósmosis que dependen de la concentración de los solutos no difusibles. En el espacio intravascular los principales solutos no difusibles son las proteínas, siendo por tanto responsables de la presión osmótica intravascular que actúa como contraparte de la presión hidrostática debida al impulso cardiaco, permitiendo el retorno del líquido al lecho vascular. La proteína plasmática que ejerce el principal efecto oncótico es la albúmina, la cual es sintetizada en el hígado a una tasa de aproximadamente 12 g diarios. De esta manera, dicha proteína se encuentra sujeta a un recambio elevado, presentando una vida promedio normal de 17 a 20 días en el plasma. Al parecer, el sitio donde se cataboliza la albúmina es el mismo hígado, tanto en los hepatocitos como en las células de Küpffer.
11
La manifestación clínica de la hipoalbuminemia (ver sus causas en la práctica de proteínas plasmáticas) es la extravasación de líquido o edema, lo cual ocurre como consecuencia directa de la disminución de la concentración del principal agente que ejerce presión osmótica intravascular. MATERIAL
1.
Un huevo de gallina
2.
Un popote
3.
Un vaso de precipitados de SO mL
4.
Cera de Campeche, plastilina o parafina
S.
Un baño de agua termo-regulado
PROCEDIMIENTO
1. Se remueve el cascarón en una zona aproximadamente circular del extremo más ancho de un huevo de gallina, cuidando de no romper la membrana subyacente. 2.
En el extremo más angosto del huevo se practica una abertura en el cascarón (incluyendo la membrana) apenas suficiente para que pase un popote a través de ella.
3.
Se introduce el popote y se fija al cascarón mediante cera de Campeche, plastilina o parafina, cuidando que no queden grietas y que el popote no toque la yema del huevo.
4.
El huevo así preparado se asienta sobre un vaso de precipitados de SO mL y todo el dispositivo se introduce en un baño de agua termo-regulado a 37
·e, de tal manera que el
nivel del agua sobrepase apenas el nivel del vaso de precipitados, asegurando así que la membrana expuesta quede en contacto con el agua. S.
Se deja el dispositivo en esas condiciones durante el tiempo necesario para observar la elevación del nivel de líquido en el interior del popote debido al efecto osmótico que propicia la transferencia de agua al interior del huevo.
NOTA: El proceso osmótico puede llevarse a cabo usando agua a temperatura ambiente, pero
puede ser algo más lento.
12
BIBLIOGRAFÍA Mendoza-Medellín, A. Nociones de Química para las áreas médica y biológica, UAEM 2007
RESULTADOS, DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
13
OBTENCIÓN DE MUESTRAS DE SANGRE OBJETIVO El alumno aprenderá la técnica precisa para la obtención de muestras de sangre venosa GENERALIDADES Las muestras de sangre generalmente se obtienen por punción venosa ya que se trata de un método sencillo que permite obtener un volumen suficiente de sangre para la determinación de los diversos parámetros de interés. Si se debe obtener suero, la muestra de sangre se deja coagular y posteriormente se centrifuga 5-10 minutos a 3500 r. p. m., lo cual permite que el suero quede como sobrenadante y el coágulo en el fondo del tubo (debido a que el coágulo se adhiere al vidrio, se debe separar de él cuidadosamente con un palillo antes de la centrifugación). Si se requiere sangre completa, se añade un anticoagulante al tubo en el que se va a verter la muestra obtenida y una vez con la sangre, se mezcla por inversión suavemente, tapando previamente el tubo con parafilm. Debe evitarse la agitación vigorosa y la formación de espuma ya que esto produce hemólisis. Si se requiere plasma sanguíneo, se añade anticoagulante al tubo y se mezcla como se ha indicado, centrifugando posteriormente.
MATERIAL 1.
Jeringa estéril de 5-10 mL o sistema vacutainer
2. Torundas de algodón con alcohol 3.
Tubos de ensayo limpios y secos o tubos vacutainer (con vacío)
4.
Ligadura
PROCEDIMIENTO 1.
El paciente debe estar sentado en una posición cómoda que le permita colocar el brazo sobre una superficie plana adecuada para mantenerlo extendido e inmóvil sin mayor esfuerzo.
2.
Se prepara el brazo frotando la región anterior del antebrazo con una torunda de algodón humedecida con alcohol etílico (96°).
3.
Se aplica un torniquete con la ligadura aproximadamente 7 cm por arriba del pliegue del codo. La punción suele hacerse en la vena mediana cefálica, la cual es fácilmente localizable en casi todas las personas. Si por alguna razón no se observa dicha vena, debe indicarse al paciente que abra y cierre su puño al tiempo que se aplica masaje en la cara
14
anterior del antebrazo, con lo cual frecuentemente se logra que resalte la vena. En ocasiones será necesario utilizar las venas del dorso de la mano, lo cual deberá hacerse con cuidados especiales ya que dichas venas son móviles por carecer de fijación. 4.
Se comprueba que el émbolo se deslice adecuadamente en la jeringa y se lleva hasta el fondo de esta para minimizar el contenido de aire. Se toma la jeringa de manera que el bisel de la aguja quede hacia arriba, se sujeta la parte posterior del brazo del paciente (a nivel del codo) con la otra mano y manteniendo la jeringa paralela al trayecto de la vena se perfora la piel, se introduce la aguja 0.5-1.0 cm en el tejido subcutáneo y se perfora entonces la pared de la vena. En este momento puede observarse que la sangre empieza a fluir hacia la jeringa. En caso contrario se retrae ligeramente el émbolo. Si no fluye la sangre a la jeringa significa que la aguja no se halla bien posicionada. Una vez que fluye la sangre, se retrae el émbolo lentamente hasta que se ha recolectado la cantidad requerida de sangre.
S.
El torniquete se suelta en cuanto se asegura la posición adecuada de la aguja si se tiene la destreza suficiente para evitar que se pierda la vena. Si no, se suelta hasta que se termine de obtener la muestra, siempre y cuando no sea demasiado tiempo.
6.
Una vez que se concluyó la sangría se coloca la torunda sobre el sitio de la punción y se retira la aguja. Se mantiene la torunda presionando el sitio de la punción unos segundos más y se coloca sobre dicho sitio un parche redondo tipo curita.
7.
Se separa la aguja de la jeringa y se vierte la sangre lentamente sobre la pared interna de un tubo de ensayo debidamente etiquetado.
8.
La jeringa y la aguja se depositan en recipientes especialmente destinados a ese uso.
ANTICOAGULANTES
Existe cierto número de anticoagulantes, Los cuales en general actúan impidiendo que el calcio desempeñe su función en el proceso de la coagulación. Por ejemplo, el oxalato de amonio o de potasio se combina químicamente con el calcio disuelto,
ca•', con lo cual se precipita. La ausencia
de calcio disuelto impide la activación de diversos factores de la coagulación. De manera similar actúan el citrato y la sal sódica o potásica del EDTA (etilendiaminotetracetato). El EDTA (secuestreno) permite además que los elementos formes de la sangre se mantengan en buenas condiciones hasta por 4 horas después de haber obtenido la muestra y evita que las plaquetas se adhieran a la superficie del tubo.
15
La heparina es un polisacárido natural que se une a la antitrombina 111, lo cual potencia el efecto anticoagulante de esta última sustancia.
SISTEMAS VACUTAINER El sistema vacutainer es un dispositivo alternativo para la toma de muestras de sangre, consistente en una pieza de plástico (adaptador) con forma de jeringa a la que se enrosca una aguja con doble punta. La parte larga de esta aguja queda por afuera del adaptador y es la que se utiliza para llevar a cabo la punción del vaso. El otro extremo de la aguja queda por adentro del adaptador. Una vez que se ha practicado la punción de la vena, se introduce en el adaptador un tubo vacutainer, que tiene un tapón de hule blando, fácilmente perforable por la aguja dentro del adaptador. Debido a que el tubo vacutainer se halla sellado con cierto grado de vacío, en cuanto la aguja perfora el tapón de hule empieza a fluir la sangre hacia el tubo. Al momento de perforar el tapón de hule debe mantenerse al adaptador tan inmóvil como sea posible para evitar que la aguja se salga de la vena o se introduzca más en ella. Después de tomada la muestra, se remueve el tubo del adaptador antes de sacar la aguja de la vena. Los tubos vacutainer pueden tener ciertos aditivos, como anticoagulantes (EDTA, heparina, citrato, oxalato, etc.), inhibidores enzimáticos (fluoruro) para evitar que disminuya la concentración de glucosa, etc. El color del tapón corresponde al aditivo que contiene. Por ejemplo, los tubos con tapón violeta contienen EDTA, los de tapón azul claro contienen citrato, etc. Los tubos con tapón color rojo no contienen ningún aditivo.
NOTA.- Se recomienda a los alumnos que se habitúen a extremar las precauciones en el manejo de la sangre, con el fin de evitar cualquier contacto con la misma. Deben utilizarse guantes quirúrgicos para hacer la toma de muestras y tener todos los cuidados para minimizar el riesgo de picaduras con agujas que han sido utilizadas y que por lo tanto pudieran estar contaminadas con agentes biológicos, como son los virus productores de hepatitis, el VIH, etc.
16
RESULTADOS, DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
17
PROTEÍNAS TOTALES Y ALBÚMINA SÉ RICAS OBJETIVOS
l.
El alumno determinará la concentración de proteínas en una muestra de plasma sanguíneo
2.
El alumno explicará la importancia de la concentración normal de las proteínas plasmáticas y las principales causas de su variación
GENERALIDADES
En el plasma sanguíneo existen más de 100 proteínas diferentes, además de los múltiples anticuerpos, generando una concentración total de 6 a 8 g/dL bajo condiciones normales. Mediante electroforesis en acetato de celulosa las proteínas plasmáticas se resuelven en 5 fracciones. Una de ellas se halla constituida exclusivamente por albúmina, y las restantes 4 se conocen como globulinas a 1, a2,
~
y y. Cada una de estas fracciones se halla constituida por un
conjunto de proteínas diferentes que presentan una movilidad electroforética similar. La albúmina es la más abundante de las proteínas plasmáticas y aunque solo representa alrededor del 52% de la masa total de dichas proteínas, ejerce aproximadamente del 80% de la presión oncótica intravascular debido a que su osmolaridad representa el 80% de la osmolaridad total de las proteínas plasmáticas. Además, la albúmina desempeña una función de transporte de sustancias hidrofóbicas que se encuentran normalmente en la sangre, como los ácidos grasos libres, la bilirrubina indirecta, el urato, etc., y cuando se ingieren, diversos medicamentos. Entre las globulinas a1 se hallan las lipoproteínas de alta densidad (LAD), involucradas en el transporte inverso de colesterol (de tejidos periféricos al hígado); la globulina fijadora de tiroxina (transporte de dicha hormona); globulina fijadora de corticosteroides, también llamada transcortina (transporte de cortisol) y la antitripsina a1 (hidrólisis de enzimas proteolíticas liberadas a partir de los leucocitos en los procesos de defensa que desarrollan estas células, particularmente en los pulmones, contra agentes biológicos infecciosos que penetran por esa vía). Entre las globulinas a2 se hallan la haptoglobina, que transporta hemoglobina liberada en el lecho vascular, al sistema reticuloendotelial; ceruloplasmina, que actúa como ferroxidasa, es decir oxida Fe+2 a Fe+ 3; las lipoproteínas de muy baja densidad (LMBD), involucradas en el transporte de triacilgliceroles y colesterol del hígado a otros tejidos; y la macroglobulina a2 (a pesar de que es la
18
proteína mayoritaria de esta fracción de proteínas plasmáticas no se ha definido su función, habiéndose encontrado solamente que presenta actividad inhibitoria de endopeptidasas). Entre las globulinas
!3
se hallan las lipoproteínas de baja densidad (LBD), las cuales se forman a
partir de las lipoproteínas de densidad intermedia (LDI) y llevan colesterol del hígado a otros tejidos; la transferrina (transporte plasmático de hierro), la hemopexina (transporte del hemo liberado en el lecho vascular al sistema reticuloendotelial); el fibrinógeno (precursor de la fibrina en el proceso de la coagulación sanguínea) y los factores del complemento. Las globulinas y corresponden a los anticuerpos, siendo su función unirse a antígenos en reacciones específicas como parte de la respuesta inmune. La gran mayoría de las proteínas plasmáticas que no son globulinas y se sintetizan en el hígado. Las globulinas y se forman en células especializadas del aparato inmunocompetente.
IMPORTANCIA CLÍNICA l.
Hiperproteinemia con cociente A/G (albúmina/ globulinas), normal. Solamente se presenta
en procesos que producen hemoconcentración, como son: choque, vómitos y diarreas intensas, quemaduras, coma diabético, etc. Se consideran hiperproteinemias falsas. 2.
Hipoalbuminemia. Se presenta en casos de patología hepática, particularmente cuando es
crónica (esto se relaciona con el hecho de que la vida promedio de la albúmina en la sangre es de aproximadamente 20 días) así como en casos de desnutrición. En la mayoría de las enfermedades renales se presenta proteinuria, pero sólo en el síndrome nefrótico disminuye significativamente la concentración plasmática de albúmina pues la pérdida de proteínas en esta enfermedad es superior a S g/ día. 3.
Transferrina.
Su función es el transporte de hierro en el plasma sanguíneo. Su
concentración aumenta en estados de deficiencia de hierro. En casos de hemocromatosis puede estar baja o normal. La ingestión de medicamentos puede alterar esas relaciones. Por ejemplo, el cloranfenicol produce disminución de la transferrina y las píldoras anticonceptivas producen su aumento por efectos metabólicos no bien definidos. Por lo tanto deben tenerse en cuenta estos factores para interpretar adecuadamente los resultados de la cuantificación de transferrina. 4.
Haptoglobina. Su función es el transporte de hemoglobina liberada a partir de los
eritrocitos en el lecho vascular. Se practica su determinación cuando se sospecha de anemia hemolítica en el paciente o para distinguirla de otros tipos de anemia. En el caso
19
de anemia hemolítica disminuye la concentración plasmática de haptoglobina. La anemia hemolítica se asocia también con el incremento del recuento de reticulocitos y disminución del número de eritrocitos, del hematocrito y de la hemoglobina en sangre. La concentración de haptoglobina disminuye en la enfermedad de Wilson (patología hereditaria que cursa con retención de cobre por el organismo. A través de los alimentos el intestino absorbe cobre pero el hígado no lo transfiere a la bilis como ocurre normalmente y su acumulación lesiona al hígado. Eventualmente el cobre hepático se libera a la circulación y se distribuye por todo el organismo, produciendo daño principalmente en riñones, cerebro y ojos. Si no se instituye el tratamiento adecuado puede presentarse daño cerebral severo, insuficiencia hepática y muerte. Su tratamiento es a largo plazo con penicilamina u otras sustancias que se combinan con el cobre, promoviendo su excreción, o bien con acetato de zinc, que impide la absorción de cobre por el intestino). En algunos casos la disminución de la haptoglobina en la enfermedad de Wilson se debe a que la patología se acompaña de una fase temprana de anemia hemolítica, pero en realidad esto no es común, por lo cual debe suponerse que en esta enfermedad se altera el metabolismo hepático y entre las manifestaciones de dichas alteraciones se encuentra la baja producción de haptoglobina. Esta proteína plasmática aumenta
durante
el
embarazo
y disminuye
en
mujeres
que
toman
píldoras
anticonceptivas, sin que se cuente con la explicación de dichos efectos. 5.
Macroglobulina a 2 • Aumenta notoriamente en pacientes con síndrome nefrótico y en algunos pacientes con cirrosis. Presenta actividad antifibrinolitica similar a la de la antiplasmina a 2, la cual se manifiesta solamente cuando la capacidad inhibitoria de esta se ha saturado.
6.
Globulinas y. También conocidas como anticuerpos, pueden hallarse disminuidas en patologías genéticamente determinadas (hipogammaglobulinemia) o adquiridas (leucemia linfática crónica y SIDA). Su incremento ocurre en infecciones agudas pero más notoriamente en las crónicas, en enfermedad hepática crónica, como la cirrosis, y en enfermedades
autoinmunes
como
el
lupus
eritematoso
(trastorno
autoinmune
inflamatorio y crónico que puede afectar la piel, las articulaciones, los riñones y otros órganos. Afecta más a las mujeres que a los hombres, en proporción de 9 a 1, y puede presentarse a cualquier edad) y la tiroiditis crónica. También ocurre incremento de la concentración de globulinas y en algunos procesos malignos como el mieloma múltiple
20
(proliferación de células plasmáticas y sus precursoras) y la macroglobulinemia de Waldenstr6m (proliferación de linfocitos más que de células plasmáticas, con gran producci6n de lgM, a tal grado que puede aumentar la viscosidad de la sangre).
PROCEDIMIENTO (Randox)
Fundamento: las proteínas en solución básica de sulfato cúprico y tartrato forman un complejo azul violeta cuya intensidad es proporcional a la concentración de proteínas. La albúmina se une cuantitativamente con el indicador 3, 3', 5, 5' tetrabromo-m-cresol sulfoneftaleína (verde de bromocresol, VBC). La intensidad del color del complejo albúmina-VBC es proporcional a la concentración de albúmina.
Proteínas totales Pipetear en tubos de ensayo:
Agua destilada
20 ¡.rL
Suero (o plasma) Patrón Reactivo de trabajo
1.0 mL
1.0 mL
1.0 mL
Mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos y medir la absorbancia (A) a 546 nm de la muestra y del patrón frente al blanco.
CÁLCULO
(A moesua/A patcool X 5.2- ___ g/dL Proteínas totales
VALORES DE REFERENCIA
Neonatos: 5.3-8.9 g/dL Niños (hasta 6 años): 5.6-8.5 g/dL Adultos: 6.6-8.7 g/dL
21
Albúmina Pipetear en tubos de ensayo:
Agua destilada
10 ¡.¡L
Suero (o plasma)
10 ¡.¡L
Patrón
10 ¡.¡L
Reactivo de trabajo Mezclar e incubar entre 20 y 25
3.0ml 2(
3.0 ml
3.0 ml
durante S minutos y medir la absorbancia (A) a 578
nm de la muestra y del patrón frente al blanco.
CÁLCULO (A m"'""/A ''"0,)
x 4.8 = ___ g/dl Albúmina
VALORES DE REFERENCIA Adultos: 3.4-4.8 g/dl
BIBLIOGRAFÍA Balcells, A. La Clínica y el Laboratorio. Ed. Marín, 1989 Gornall, A. G. Applied Biochemistry of Clinical Disorders. Harper & Row, 1980 Devlin, T. M. (Editor) Textbook of Biochemistry with c/inical correlations,
s'h
edition. Wiley-Liss,
2002 H. Lehr, M. Pauschinger, E. Pittke, E. Kurrle and H. Heimpel (1988). Haemolytic anaemia as initial manifestation of Wilson's disease. Annals of Hematology: 56 (1) http://digestive.niddk.nih.gov/ddiseases/pubs/wilson/ (enfermedad de Wilson) http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/000435.htm
22
RESULTADOS, DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
23
EMULSIFICACIÓN DE ACEITE OBJETIVOS
1.
El alumno comparará la capacidad de la bilis, de un detergente y del agua para emulsionar muestras de aceite de cocina
2.
El alumno explicará la relevancia fisiológica y clínica de la emulsificación de la grasa dietaria
GENERALIDADES
La emulsificación de la grasa dietaría es el proceso mediante el cual los componentes lipídicos de los alimentos sufren la acción del peristaltismo intestinal y de las sustancias antipáticas presentes en la bilis, resultando de ella la generación de partículas pequeñas de grasa dietaría que interaccionan can relativo grado de estabilidad con el medio acuoso. Los ácidos grasos y otros productos de la digestión estimulan la secreción de la hormona colecistocinina-pancreocimina, la cual provoca la contracción de la vesícula biliar, necesaria para que la bilis fluya hacia el duodeno. La bilis contiene, entre otras sustancias, sales biliares y fosfolípidos, que coadyuvan a emulsionar la grasa debido a su naturaleza antipática, en conjunción con el movimiento peristáltico del intestino, aunque este último factor es el fundamental para el proceso emulsificante. La grasa emulsionada consiste en partículas de 200-5000 nm de diámetro de materiallipídico, principalmente triacilgliceroles, colesterol esterificado y vitaminas liposolubles (A, D, E y K), que en su superficie interaccionan con las partes hidrofóbicas de las moléculas antipáticas, quedando las hidrofílicas interaccionando a su vez con el agua del ambiente. La emulsificación es un proceso importante debido a que permite una acción adecuada de las enzimas digestivas con actividad lipolítica, fundamentalmente la lipasa pancreática y la colesterol esterasa. Los productos de la digestión de los triacilgliceroles (ácidos grasos y monoacilgliceroles) y de los esteres de colesterol (ácidos grasos y colesterol libre), en asociación con las sales biliares y los fosfolípidos, configuran estructuras esferoidales de 3 a 10 nm de diámetro, denominadas micelas mixtas, las cuales contienen en su parte interna las regiones hidrofóbicas de sus componentes, y en la superficie las hidrofílicas. Las vitaminas liposolubles también se encuentran presentes en la parte interna de dichas m ice las. Las micelas mixtas se desplazan por el intestino y en el borde en cepillo liberan sus componentes de origen dietario, los cuales penetran a las células del epitelio intestinal. En el íleon se reabsorbe la mayor parte de las sales biliares y participan en la circulación enterohepática
24
IMPORTANCIA CLÍNICA
la ausencia de sales biliares y fosfolípidos en el intestino puede ocurrir debido a problemas obstructivos de las vías biliares. En estas condiciones los lípidos dietarios se emulsionan en grado importante por efecto de la peristalsis, lo cual permite la acción digestiva de las enzimas pancreáticas, pero la ausencia de materiales antipáticos impide la formación de micelas mixtas y por lo tanto no se absorben los productos de la digestión de los lípidos dietarios, ocasionando el síndrome de malabsorción de grasa, conocido también como esteatorrea. La permanencia de la grasa en el intestino tiene algunos efectos adicionales. Por ejemplo, la grasa puede interaccionar con otros componentes de la dieta, impidiendo la acción digestiva apropiada sobre ellos; y la absorción deficiente de grasa puede provocar que las vitaminas liposolubles tampoco se absorban apropiadamente.
MATERIAL
1. Bilis de pollo o de bovino
2 mL
2. Aceite vegetal
Sml
3. Detergente extrán
2 mL
4. Tubos con tapón de rosca
3
S. Pipeta graduada de 10 ml
1
6. Pipeta graduada de S ml
1
7. Pipeta graduada de 1.0 ml
2
8. Agua destilada
10ml
9. Agitador "vortex"
PROCEDIMIENTO
Control
3 ml
1 ml
Bilis
3 ml
1 mL
Extrán
3 mL
1 ml
1 mL 1 ml
Mezclar el contenido de cada tubo en el agitador vórtex durante 15 segundos y observar y anotar los resultados inmediatamente y
después de algunos minutos.
2S
BIBLIOGRAFÍA Mathews, C. K. & K. E. Van Holde. Bioquímica, 2a. ed. McGraw-Hili, 1998 Devlin, T. M. (Editor) Textbaok of Biochemistry with clinical correlations,
RESULTADOS, DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
26
s'h edition.
AMI LASA SÉRICA OBJETIVOS
1. El alumno determinará la actividad de amilasa en una muestra de suero sanguíneo 2. El alumno explicará la importancia clínica de la determinación de la amilasa sérica GENERALIDADES
La amilasa es una enzima que participa en la digestión del almidón y del glucógeno dietarios. Cata liza la hidrólisis de los enlaces glucosídicos al-4 que unen a las moléculas de glucosa entre sí en dichos polisacáridos. La amilasa se produce en las glándulas salivales, principalmente en las parótidas, y en el páncreas, nombrándose amilasa salival (ptialina) y amilasa pancreática, respectivamente. La actividad de la amilasa salival es limitada debido al corto periodo de tiempo que permanece el bolo alimenticio en la boca, ya que poco después de que este pasa al estómago se pierde la actividad amilásica debido al pH ácido del jugo gástrico. La función de la ami lasa salival es iniciar la hidrólisis del almidón y del glucógeno presentes en los alimentos, generando como productos fundamentalmente dextrinas y en menor proporción maltosa. Las dextrinas son oligosacáridos o polisacáridos de peso molecular variable que resultan de la hidrólisis al azar de los enlaces al-4 del almidón o del glucógeno. La amilasa pancreática se vierte a través del jugo pancreático al intestino, donde transforma los productos generados por la amilasa salival, en maltosa y dextrinas límite. Las dextrinas límite son oligosacáridos ramificados que contienen un enlace
a 1-6. Ninguna de las dos amilasas es capaz de
hidrolizar estos enlaces. Se han documentado casos de personas que carecen de amilasa salival y no presentan ninguna alteración en el proceso digestivo de los polisacáridos mencionados, lo cual indica que se trata de una enzima no indispensable. Evidentemente, la explicación de esto es que la amilasa pancreática actúa en la misma forma que la salival y puede por lo tanto digerir por sí misma al almidón y al glucógeno. En el suero de los lactantes no se detecta actividad amilásica sino hasta uno o dos meses de edad, alcanzándose el límite inferior del intervalo normal del adulto hasta el primer año de edad.
27
IMPORTANCIA CLÍNICA
SE PRESENTA AUMENTO DE LA AMILASEMIA EN LOS SIGUIENTES CASOS: l.
Pancreatitis aguda. Se registran elevaciones de hasta 5 veces los niveles normales. En caso
de que se mantengan los valores elevados por más de 5 días, puede pensarse en una necrosis continuada del páncreas o en la formación de un pseudoquiste (acumulación de tejido, líquido, residuos, enzimas pancreáticas y sangre, que se puede desarrollar después de una pancreatitis aguda. Con frecuencia ocurre cuando se rompen los conductos pancreáticos por efecto de la inflamación propia de la pancreatitis). En muchos casos la pancreatitis aguda se encuentra asociada con ingesta aguda de etanol.
2.
Pancreatitis secundaria a hepatitis viral.
3.
Afecciones tóxicas del páncreas, debidas a infecciones como la tifoidea, el paludismo, la
neumonía, el sarampión y la meningitis meningocócica. 4.
Úlcera gástrica penetrante de páncreas, en cuyo caso los aumentos son menores a los
registrados en la pancreatitis aguda. 5.
Padecimientos abdominales como úlcera duodenal perforada, gastritis, peritonitis y obstrucción abdominal. Son cuadros que cursan con incrementos discretos de la amilasemia.
6.
Parotiditis, particularmente cuando es bilateral. El aumento de la amilasemia se detecta al
5° o r día después de iniciado el padecimiento. 7.
Insuficiencia renal. El incremento de la amilasemia en estos casos se debe a la
disminución de la excreción de la amilasa, apareciendo negativa la amilasuria. Normalmente alrededor del 25% de la ami lasa plasmática se excreta por los riñones. 8.
Administración de fármacos como morfina, codeína y otros opiáceos. En estos casos la
hiperamilasemia es muy marcada, posiblemente por espasmo del esfínter de Oddi. PROCEDIMIENTO (Hycel)
Fundamento: Se mide la hidrólisis del almidón por la amilasa sérica mediante la formación de un complejo colorido (azul-verde) entre el almidón y el yodo, cuya intensidad es directamente proporcional a la cantidad de almidón. Mientras más se hidroliza el almidón (por mayor actividad amilásica), menos complejo colorido se forma con el yodo, por lo tanto la intensidad del color varía en proporción inversa con la concentración de ami lasa en la muestra.
28
Marcar 2 matraces volumétricos de 50 mL como "problema" y "blanco" l.
Transferir exactamente 5.0 ml de solución de sustrato de almidón a cada matraz.
2.
Incubar el matraz problema en un baño de agua a 37"C durante S minutos. No es necesario incubar el matraz blanco.
3.
Transferir exactamente 0.1 ml de suero al matraz problema, mezclar bien y regresarlo al baño de agua, donde deberá estar 7.5 minutos exactos.
4. Añadir 5.0 ml de solución de yodo N/100 a cada uno de los matraces e inmediatamente después atorarlo con agua destilada. Mezclar bien por inversión y agitar.
S.
Leer de inmediato la absorbancia a 660 nm del problema y del blanco contra agua destilada.
CÁLCULO
[(A bleoco- A pcoblem,)/A bleocol
X 800
=---unidades de amilasa/dL
NOTA: Una unidad de amilasa se define como la cantidad de enzima que hidroliza 10 mg de almidón en 30 minutos a un grado tal que el yodo no produzca ningún color.
VALORES DE REFERENCIA
60-160 unidades de amilasa/dL
BIBLIOGRAFÍA
Balcells, A. La Clínica y el Laboratorio. Ed. Marín, 1989 Mathews, C. K. & K. E. Van Holde. Bioquímica, 2a. ed. McGraw-Hill, 1998 Devlin, T. M. (Editor) Textbook of Biochemistry with c/inical correlations, 5th edition. Wiley-Liss, 2002
29
RESULTADOS, DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
30
FOSFATASA ALCALINA SÉRICA OBJETIVOS
l.
El alumno determinará la actividad de fosfatasa alcalina en una muestra de suero sanguíneo
2.
El alumno explicará la importancia clínica de la cuantificación de la actividad de fosfatasa alcalina en el suero
GENERALIDADES
Fosfatasa alcalina (FAL) es el nombre con que se conoce un grupo de enzimas que presentan actividad óptima para hidrolizar fosfoésteres en un intervalo de pH de 9.0 a 10.5. Como productos de las reacciones que catalizan se obtienen los alcoholes correspondientes y fosfato inorgánico, según indica la siguiente reacción general: R-0-PO,W + H20
R-OH
+
H2Po.-
La FAL se encuentra distribuida ampliamente en los tejidos del organismo. Durante el crecimiento se encuentra en mayor cantidad en los osteoblastos (células productoras de tejido óseo) y
condroblastos (células embrionarias que dan origen al cartílago) del tejido óseo. En el adulto, la mayor proporción se encuentra en la mucosa intestinal, el hígado, los pulmones y el bazo, aunque también se produce en el endotelio vascular, los tú bulos renales, el epitelio tiroideo, el epitelio del conducto biliar, placenta y células de la serie mieloide. Se localiza en el citosol, microsomas y lisosomas. Su función bioquímica precisa no se conoce aunque al parecer en el hígado y el hueso participa en el transporte de membrana pues en dichos tejidos la actividad de fosfatasa alcalina se halla asociada a la membrana celular. La FAL sérica es principalmente de origen hepático y óseo, y los incrementos se deben más al aumento de su síntesis que a incremento de su liberación por los tejidos lesionados o necróticos Las isoenzimas de la FAL son distinguibles por sus propiedades fisicoquímicas, según indica el siguiente cuadro: Propiedades de las isoenzimas de la fosfatasa alcalina PROPIEDAD
HIGADO 1
HUESO
INTESTINO
RAPIDEZ ELECTROFORÉTICA*
2
3
PLACENTA 2
DESACTIVACIÓN A 56 ºC
S0-70
90-100
S0-60
o
INHIBICIÓN CON FENILALANINA (%)
0-10
0-10
7S
75
*A MENOR NÚMERO, MAYOR RAPIDEZ
31
IMPORTANCIA CLÍNICA LA FAL AUMENTA EN LOS SIGUIENTES CASOS: l.
Padecimientos del hueso asociados con aumento de la actividad de los osteoblastos
2.
Enfermedad de Paget. También conocida como osteítis deformante, ataca primeramente los huesos del cráneo, con aumento bilateral y algo asimétrico del tamaño de la cabeza. Aparece osteoporosis y el síntoma más constante es el dolor reumatoide, especialmente en las tibias. Se presentan frecuentemente calambres musculares, incurvación de tibias y cifosis (desviación anormal de la columna vertebral), pudiendo presentar fracturas que consolidan rápidamente. No se altera la calcemia. Se atribuye a una alteración del metabolismo óseo, en especial en la pelvis, el cráneo y el fémur. Los huesos pueden ser tan blandos que pueden cortarse con un bisturí. Los pacientes registran disminución de estatura de hasta 20 cm y se presenta con mayor frecuencia en hombres de edad avanzada. En el suero de los pacientes se eleva en grado importante la FAL (10 a 100 veces mayores al límite superior normal) debido a un exceso de actividad de los osteoblastos. Se inicia con resorción ósea excesiva e incremento en el número de osteoclastos (elemento celular gigante multinucleado de la médula ósea cuya función es la resorción o destrucción del hueso). Simultáneamente a la resorción se produce hueso nuevo por activación de los osteoblastos, lo cual genera un patrón de depósitos óseos que constituye un mosaico característico de resorción y formación de hueso. Se trata de un padecimiento de causa no definida aunque algunos estudios sugieren que se inicia por una infección viral. Llega a afectar hasta el3% de la población de más de 40 años.
3.
Raquitismo y osteomalacia. Producidas por deficiencia de vitamina D, estas patologías se caracterizan por formar depósitos de matriz ósea no calcificada, lo que aumenta la actividad de los osteoblastos
4.
Tumores óseos primarios, como el sarcoma osteogénico, producen incrementos variables de la FAL sérica dependiendo del grado de afección. La actividad de la enzima se utiliza para vigilar la evolución de la enfermedad y su recurrencia.
S.
Metástasis óseas derivadas de neoplasias de próstata, pulmón y glándula mamaria. La presencia de actividad elevada de FAL es signo de afección ósea.
6.
Hiperparatiroidismo. En esta patología aumenta excesivamente la secreción de la hormona paratiroidea, lo cual altera el metabolismo del calcio y del fósforo y por lo tanto
32
la integridad ósea. Los incrementos de la actividad sérica de la FAL se registran solamente cuando el hueso se encuentra muy afectado. 7.
Reparación ósea por recuperación de fracturas. El aumento de la FAL se debe a la formación de hueso nuevo.
8.
Crecimiento. Durante el crecimiento es normal que la actividad sé rica de FAL se encuentre aumentada respecto a las cifras normales del adulto. Los incrementos son más notables en adolescentes de sexo masculino. Las y los jóvenes alcanzan los niveles del adulto a los 15 y 18 años, respectivamente.
9.
Embarazo. El incremento se registra en el segundo y tercer trimestres debido a que es entonces cuando se estimula el desarrollo óseo del producto. El incremento también se debe a la presencia de la isoenzima placentaria. Las cifras se normalizan aproximadamente a las seis semanas posparto.
10. Menopausia. El aumento significativo de la actividad de FAL se relaciona con la pérdida de hueso secundaria al descenso de los niveles de estrógenos. Las cifras de FAL en mujeres mayores aumentan hasta en un 40% respecto al intervalo normal 11. Enfermedades hepáticas. En la mayoría de estas enfermedades se registra un aumento de FAL, pero cuando el incremento es mayor al triple del límite superior normal es más probable que se trate de una patología obstructiva, ya que los padecimientos que cursan con necrosis de los hepatocitos por lo general no registran incrementos altos de FAL sérica, excepto si también ocurre necrosis en los canalículos o en los conductos biliares. Si un paciente ictérico presenta niveles normales de FAL se descarta la obstrucción biliar. 12. Tratamiento con corticosteroides. Se ha observado incremento generalmente pequeño de la actividad de FAL y de las transaminasas después del tratamiento con corticosteroides, revirtiendo luego de suspenderse el tratamiento. PROCEDIMIENTO (Randox) Fundamento: la hidrólisis del p-nitrofenilfosfato, catalizada por la FAL, produce fosfato y p-nitrofenol. Este último es un compuesto colorido. La intensidad del color es directamente proporcional a la actividad de FAL.
33
l.
Transferir 20 JlL de suero a una celdilla del espectrofotómetro
2.
Añadir 1.0 mL del reactivo de trabajo
3.
Mezclar y leer la absorbancia (A0 ) a 405 nm frente al aire (celdilla vacía)
4.
Sin sacar la celdilla leer nuevamente la absorbancia al cabo de 1 (A1 )
,
2 (A2 ) Y 3 (A3 )
minutos
CÁLCULO
Obtener los 3 valores de M de la muestra como sigue: A1 - A0, A2 - A1 y A3 - A2 y promediarlos.
M
pmmod;o
x 2760 = _ _ U/L Fosfatasa alcalina
Los sueros hemolíticos interfieren con la determinación.
VALORES DE REFERENCIA
Hombre/ Mujer: 73-207 U/L BILBLIOGRAFÍA
Balcells,A. La clínica y el Laboratorio. Ed. Marín González de Buitrago, J. M., E. Arillo Ferreiro, M. Rodríguez-Segade & A. Sánchez Pozo. Bioquímica
Clínica. McGraw-Hill, 1998 Devlin, T. M. (Editor) Textbook of Biochemistry with clinical correlations, 5th edition. Wiley-Liss, 2002 http://www.facmed.unam.mx/bmnd/plm 2k8/src/prods/34930.htm (efecto de corticosteroides)
34
RESULTADOS, DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
35
GLUCOSA PLASMÁTICA OBJETIVOS 1.
El alumno determinará la concentración de glucosa en una muestra de suero sanguíneo
2.
El alumno explicará la importancia clínica de la determinación de la glucemia
GENERALIDADES La glucosa es el monosacárido de mayor importancia que utilizan las células para la obtención de energía. El origen de la glucosa puede ser exógeno, cuando se obtiene a partir de los carbohidratos dietarios (almidón, glucógeno, sacarosa y lactosa), y endógeno, cuando se sintetiza en el organismo a través de la vía gluconeogénica. La glucemia (glucosa en sangre) se halla regulada fundamentalmente por dos hormonas, el glucagon y la insulina. La hipoglucemia es el efector para la secreción de glucagon, el cual estimula la glucogenólisis en el hígado. La glucosa liberada a partir del glucógeno pasa entonces a la sangre, restableciendo la normoglucemia. En la hiperglucemia en cambio, la insulina activa el mecanismo que permite la incorporación de la glucosa a los tejidos adiposo y muscular, reduciendo así la concentración de glucosa sanguínea hasta lograr la normoglucemia. Aunque la insulina se requiere para la incorporación de glucosa por los hepatocitos, sí interviene en forma importante estimulando la glucogénesis. La concentración normal de glucosa en la sangre o normoglucemia después de un ayuno de al menos 8 horas varía dentro de un intervalo de aproximadamente 75 a 115 mg/dL o 4.16 a 6.39 mmoi/L, pudiendo variar según el método utilizado. En condiciones normales la glucemia posprandial raramente supera los 140 mg/dL, recuperándose la normoglucemia antes de 2.5 horas. Si el grado de glucemia en ayuno supera el límite superior del intervalo normal o bien si la hiperglucemia posprandial se mantiene durante más tiempo del indicado, muy probablemente se trata de alguna patología que cursa con hiperglucemia. Se considera que en el ayuno los mínimos valores de glucemia tolerables por el organismo sin que se presente daño cerebral son de 40 a 50 mg/dL, sin embargo esto no es aplicable a todas las personas debido a que la sensibilidad es muy variable entre los distintos individuos, de tal manera que debe procurarse en todos los casos mantener normoglucémico al paciente para prevenir cualquier efecto de la hipoglucemia.
36
IMPORTANCIA CLÍNICA SE PRESENTA AUMENTO DE LA GLUCEMIA EN LOS SIGUIENTES CASOS:
l.
Hiperglucemia fisiológica. Se trata de un incremento discreto y transitorio que no se acompaña de glucosuria. Se presenta como resultado de la exposición a baños calientes, excitaciones psíquicas y ocasionalmente por efecto del periodo menstrual.
2.
Asfixia e intervenciones quirúrgicas, probablemente debido a descargas de adrenalina, con efectos pasajeros.
3.
Diabetes mellitus. Es la causa más común de hiperglucemia, debiéndose a la ausencia total o parcial de insulina, o bien a un efecto insuficiente de dicha hormona.
4.
Síndromes diabetoides extrainsulares, pudiendo ser hipofisiario, como en la enfermedad de Cushing (adenoma hipofisiario que cursa con hipercorticismo crónico), suprarrenal, por presencia de feocromocitoma (tumor de la médula adrenal) que provoca aumento de la secreción de adrenalina, y tiroideo, por hiperfunción de la glándula tiroides. En este caso la hiperglucemia es muy discreta.
S.
Traumatismo cerebral.
6.
Infarto al miocardio, registrándose la hiperglucemia sólo en los primeros dos días. En ocasiones se acompaña de glucosuria.
7.
Tratamiento con ciertas hormonas esteroides, debido a su efecto gluconeogénico.
SE PRESENTA DISMINUCIÓN DE LA GLUCEMIA EN LOS SIGUIENTES CASOS:
l.
Esfuerzos musculares agotadores
2.
Hiperinsulinismo, debido a insulinoma (neoplasia pancreática)
3.
Sobredosis de insulina, pudiendo presentarse coma hipoglucémico
4.
Insuficiencia hepática grave, por alteración del metabolismo del glucógeno
5.
Trastornos digestivos que cursan con malabsorción intestinal, como vómitos y diarrea
6.
Hipoglucemia de la lactancia, que afecta a las madres lactantes por alimentación insuficiente
7.
Alcoholismo agudo, por el efecto inhibidor del alcohol sobre la gluconeogénesis.
PROCEDIMIENTO (Randox) Fundamento: la glucosa reacciona con oxígeno y agua, transformándose en gluconato y peróxido de hidrógeno mediante la glucosa oxidasa. El peróxido de hidrógeno producido reacciona con fenal y 4-aminofenazona, formando quinoneimina y agua, por catálisis de la peroxidasa. La
37
quinoneimina es un compuesto colorido cuya concentración es proporcional a la de glucosa en la muestra. Pipetear en tubos de ensayo:
Plasma o suero
20 j.!L
Patrón Reactivo de trabajo
2.0 mL
2.0mL
2.0 mL
Mezclar e incubar a 3r e durante al menos 10 minutos y medir la absorbancia (A) de la muestra y del patrón frente al blanco a 500 nm. El color es estable durante 60 min.
CÁLCULO (A m"""'/ A pwón)
X
100 = _ _ _ mg/dL Glucosa
El método es lineal hasta valores de 500 mg/dl. Si la concentración de glucosa es superior a este valor, debe diluirse la muestra 1:2 con solución salina, multiplicando al final la concentración obtenida por el factor 2
VALORES DE REFERENCIA 75 a 115 mg/dL
BIBLIOGRAFÍA Balcells,A. La clínica y el Laboratorio. Ed. Marín González de Buitrago, J. M., E. Arillo Ferreiro, M. Rodríguez-Segade & A. Sánchez Pozo. Bioquímico
Clínica. McGraw-Hill, 1998 Scriver, C. R., A. L. Beaudet, W. S. Sly & D. Valle (Ed.) The Metabolic Bases of lnherited Disease,
7'h
ed. McGraw-Hill, 1995 Devlin, T. M. (Editor) Textbook of Biochemistry with clinical correlations, 51h edition. Wiley-Liss, 2002
38
RESULTADOS, DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
39
LACTATO PLASMÁTICO OBJETIVOS
1.
El alumno determinará la concentración de lactato en una muestra de plasma sanguíneo
2.
El alumno explicará los contextos teórico-clínicos en que es relevante la cuantificación del lactato en la sangre
GENERALIDADES La glucosa se cataboliza en todos los tejidos a través de la glucólisis, vía que transforma la glucosa en piruvato (glucosa ---+ 2 piruvato). Si ocurre en condiciones aeróbicas, el piruvato ingresa a las mitocondrias y ahí es catabolizado hasta C0 2 y H20, lo cual permite la liberación de cantidades importantes de energía útil para la formación de ATP y otras sustancias a través de las cuales se aporta energía a los procesos celulares que la requieren. En tipos celulares en los que la glucosa no se cataboliza aeróbica sino anaeróbicamente (eritrocitos, células de glía, células de la médula renal, etc.), o bien en aquellos otros que, teniendo normalmente un metabolismo aeróbico entran a una fase de limitación o ausencia de oxígeno (el común de los tipos celulares, de manera importante las células del músculo esquelético y los cardiomiocitos), el piruvato producido a partir de la glucosa se reduce a lactato de acuerdo con la siguiente reacción: Piruvato + NADH + H' ---+ Lactato+ NAD' Esta reacción es catalizada por la enzima denominada lactato deshidrogenasa, de amplísima distribución en el organismo humano. El lactato que se forma en las células pasa a la circulación por un transportador de la membrana celular que en realidad es un simportador de lactato e hidrogeniones, con lo cual se preserva la electroneutralidad. De esta manera, conforme se produce puede ir pasando a la circulación. Bajo las condiciones apropiadas, el hígado y en menor proporción el riñón, captan y metabolizan el lactato de la sangre, transformándolo en glucosa a través de una vía conocida como gluconeogénesis. En condiciones normales, la concentración de lactato se mantiene baja (menos de 20 mg/dL de plasma) gracias a este proceso metabólico.
40
IMPORTANCIA CLÍNICA
El incremento en la concentración de lactato puede ocurrir porque se produzca en cantidades mayores a lo normal o porque el hígado se halle insuficiente para metabolizarlo, especialmente si concurre una condición de sepsis o de etilismo. SE REGISTRA INCREMENTO DE LACTATO EN SANGRE EN LOS SIGUIENTES CASOS:
l. Insuficiencia cardiaca congestiva 2.
Choque de cualquier origen (hipovolémico, anafiláctico, etc.)
3.
Necrosis hepática aguda y cirrosis hepática
4.
Insuficiencia respiratoria avanzada
5. Íleo paralítico (pérdida de la actividad motora intestinal, con isquemia)
6. Algunos
tipos
de
tumores,
como
linfomas
(cáncer
del
sistema
linfático)
y
hemangioblastomas (neoplasias vasculares benignas localizadas principalmente en el cerebelo).
PROCEDIMIENTO (Randox)
Fundamento: el lactato se oxida a piruvato mediante la enzima lactato oxidasa, produciendo además peróxido de hidrógeno (H 20 2). El peróxido de hidrógeno reacciona con 4-clorofenol y 4aminoantipirina para producir quinoneimina, agua y ácido clorhídrico mediante una reacción que cataliza una enzima peroxidasa. La intensidad de la coloración producida es directamente proporcional a la concentración de quinoneimina y ésta a su vez es directamente proporcional a la concentración de lactato.
Pipetear en tubos de esnayo:
Plasma
10 ¡.tL
Patrón Reactivo de trabajo
10 ¡.tL
1.0 mL
1.0 mL
1.0 mL
Mezclar e incubar a 37, C durante 5 minutos y medir la absorbancia (A) de la muestra y del patrón frente al blanco a 550 nm. El color es estable durante 30 min.
41
CÁLCULO
(Amuestr,/Apotcóo)
X
40 = _ _ mg/dL Lactato
VALORES DE REFERENCIA
4.5-20 mg/dL BIBLIOGRAFÍA
Balcells, A. La Clínica y el Laboratorio. Ed. Marín, 1989 Devlin, T. M. (Editor) Textbook of Biochemistry with clinical correlotions, 5th edition. Wiley-Liss, 2002 http://www.ranc.com.ar/pdf/2003/Volumen 2/utilidades resonancia _magnetica. pdf ?PHPSESSID=42f6bba09d0b75fb6cc50891ea8fc5f1 (tumores asociados con incremento de lactato) http://www.neurocirugia.com/anatpat/hemangioblastoma/hemangioblastoma.htm (significado y localización de hemangioblastomas)
42
RESULTADOS, DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
43
TRIACILGLICEROLES SÉ RICOS OBJETIVOS
l.
El alumno determinará la concentración de triacilgliceroles en una muestra de suero sanguíneo.
2.
El alumno explicará el contexto clínico en que es relevante la determinación de triacilgliceroles séricos
GENERALIDADES
Los triacilgliceroles (triglicéridos) son lípidos formados por la esterificación de tres moléculas de ácidos grasos con una de glicerol. Se encuentran presentes en los aceites y las grasas que forman parte de las dietas comunes y en el tejido adiposo, donde constituyen la principal forma de almacenamiento energético. Los triacilgliceroles dietarios se digieren por acción de la lipasa pancreática, generando principalmente monoacilgliceroles y ácidos grasos, productos capaces de ser absorbidos por el intestino. En los enterocitos los monoacilgliceroles se reesterifican con los ácidos grasos, y los triacilgliceroles resultantes se asocian con otros componentes para estructurar las lipoproteínas conocidas como quilomicrones, los cuales son secretados hacia la linfa, a través de la cual son llevados a la circulación general. En los capilares sanguíneos de diversos tejidos, principalmente del adiposo y del muscular, la lipoproteína lipasa (LPL) hidro liza más del 80% de los triacilgliceroles de los quilomicrones, y la mayor parte de los ácidos grasos liberados penetran a las células del tejido correspondiente, mientras que el glicerol es captado y meta bol izado por el hígado. Después de que actúa la LPL sobre los quilomicrones, éstos quedan convertidos en lipoproteínas pequeñas de relativo alto contenido de colesterol, llamadas remanentes de quilomicrones, cuyo destino es ser endocitadas por los hepatocitos. El hígado forma triacilgliceroles a partir de los carbohidratos dietarios cuando éstos se hallan en exceso. Debido a que el hígado normalmente no almacena grasa, sus triacilgliceroles se asocian con otros componentes lipídicos y proteínicos para estructurar las lipoproteínas de muy baja densidad (LMBD), las cuales secreta a la sangre. De manera similar a lo que ocurre con los quilomicrones, la LPL hidroliza la mayor parte de los triacilgliceroles presentes en las LMBD, penetrando los ácidos grasos liberados, a las células del tejido correspondiente.
44
IMPORTANCIA CLÍNICA La elevación de la concentración plasmática de triacilgliceroles constituye un factor de riesgo aterogénico. La concentración normal es menor a 200 mg/dL, aunque se considera sospecha de hipertriacilglicerolemia entre 150 y 200 mg/dL. Aquellos países con dietas altas en grasas animales tienen elevada prevalencia de aterosclerosis y sus complicaciones. Por el contrario, en países con ingesta baja de grasa saturada, como es el caso de Japón y de algunos países mediterráneos, la prevalencia de aterosclerosis es baja. Se ha documentado que las campañas exitosas para disminuir la ingesta de grasa animal en países con alta prevalencia de aterosclerosis y cardiopatía isquémica, logran reducir la mortalidad por esta causa. El hombre primitivo requería el almacenamiento de grasa en su cuerpo debido a lo incierto de cuándo podría tomar su próximo alimento, sin embargo, en la mayoría de las sociedades actuales es innecesario el almacenamiento de grasa, dada la disponibilidad de alimentos a cualquier hora del día y a que el esfuerzo físico cada vez es menor. Las grasas insaturadas son de origen vegetal, aunque también existen en proporciones importantes en los alimentos de origen animal. La ingestión de grasas de origen vegetal no se halla asociada por sí misma a la ingesta de colesterol. Además, dicha fuente proporciona los ácidos grasos esenciales, que no pueden sintetizarse en el organismo humano. La hipertriacilglicerolemia endógena primaria es una patología genéticamente determinada que se presenta aproximadamente en 1 de cada 100 individuos en la población adulta y se hereda como rasgo autosómico dominante. El defecto molecular es desconocido aunque al parecer determina una sobreproducción hepática de triacilgliceroles. PROCEDIMIENTO (Randox) Fundamento: la hidrólisis de los triacilgliceroles produce ácidos grasos y glicerol por acción de la lipasa. El glicerol formado reacciona con ATP, produciendo glicerol-fosfato y ADP por catálisis de la glicerolcinasa. El glicerol-fosfato a su vez reacciona con oxígeno y produce dihidroxiacetonafosfato y peróxido de hidrógeno, en una reacción catalizada por la glicerol-fosfato oxidasa. El peróxido de hidrógeno reacciona con 4-aminofenazona y 4-clorofenol, generando quinoneimina (compuesto colorido), ácido clorhídrico y agua. La concentración del compuesto colorido es proporcional a la concentración de triacilgliceroles.
45
Pipetear en tubos de ensayo:
Patrón Reactivo de trabajo
1.0mL
1.0 mL
1.0 mL
Mezclar e incubar a 37" C durante S min. y medir la absorbancia (A) de la muestra y del patrón frente al blanco a 500 nm. El color es estable durante 60 min.
CÁLCULO
(A muestcafA '"'ó")
X 200 = _ _
mg/dL Triacilgliceroles
VALORES DE REFERENCIA
Sospecha de hipertriacilglicerolemia:
a partir de 150 mg/dL
Hipertriacilglicerolemia:
a partir de 200 mg/dL
BIBLIOGRAFÍA
Balcells, A. La Clínica y el Laboratorio. Ed. Marín, 1989 González de Buitrago, J. M., E. Arillo Ferreiro, M. Rodríguez-Segad e & A. Sánchez Pozo. Bioquímica
Clínica. McGraw-Hill, 1998 Devlin, T. M. (Editor) Textbook of Biochemistry with clinical correlations,
2002
46
s'h edition. Wiley-Liss,
RESULTADOS, DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
47
COLESTEROL SÉRICO OBJETIVOS
1. El alumno determinará la concentración de colesterol total en una muestra de suero sanguíneo tomada después de ayuno de 12 horas. 2.
El alumno explicará el contexto clínico relevante para la determinación de la colesterolemia
GENERALIDADES
El colesterol es un derivado del ciclopentanoperhidrofenantreno. Es una molécula insoluble en agua que se encuentra en todos los tejidos corporales, especialmente en cerebro, hígado, médula ósea y piel. CONTENIDO DE COLESTEROL DE ALGUNOS ALIMENTOS COMUNES
ALIMENTO (100 g)
COLESTEROL (mg)
RIÑÓN DE RES
700
HÍGADO DE RES
440
CARNE DE RES O CEROO
8S
CARNE DE BORREGO
9S
POLLO O PAVO
80
CAMARONES
1SO
ALMEJAS
6S
PESCADO MAGRO*
43
OSTIONES*
40
QUESO O CREMA
111 19
REQUESÓN
S40
YEMAS DE HUEVO (2)
o
ClARA DE HUEVO
LECHE ENTERA (1 TA2A))
33
o
VEGETALES
* alimentos cocidos En el hígado se produce la mayor parte del colesterol endógeno. Este órgano también participa en la excreción de colesterol transformándolo en sales biliares, las cuales son llevadas por la bilis hacia el intestino, donde funcionan como agentes emulsionantes de la grasa dietaría, en conjunción con el movimiento peristáltico. En el íleon una gran parte de las sales biliares se reabsorbe, participando en la circulación enterohepática. La pequeña fracción que no se reabsorbe sufre la acción de la flora bacteriana, dando como resultado coprostanol y colestanol,
48
que son eliminados en las heces fecales. La dieta promedio suministra alrededor de 0.3 g de colesterol diariamente. El colesterol se encuentra en todas las células animales formando parte de las membranas. También se encuentra formando parte de los distintos tipos de lipoproteínas, siendo precursor de las sales biliares, de la vitamina O y de toda la familia de hormonas esteroides.
IMPORTANCIA CLÍNICA SE PUEDE ENCONTRAR HIPERCOLESTEROLEMIA EN LOS SIGUIENTES CASOS Y SITUACIONES: l.
Dietas ricas en colesterol. El consumo de alimentos ricos en colesterol propicia una hiperconcentración de colesterol en los hepatocitos, lo cual inhibe la exposición de los receptores para las LBD en su superficie celular. Esto ocasiona que cantidades importantes y crecientes del colesterol circulante (de origen dietario o endógeno) no tengan acceso a dicho tejido.
2.
Ictericia obstructiva. En este padecimiento se obstruyen los canalículos biliares o el colédoco, dificultándose por tanto la eliminación del colesterol. En estos casos los niveles de colesterol sanguíneo pueden aumentar al doble o al triple de lo normal.
3.
Cirrosis biliar. Este padecimiento cursa con deterioro crónico de la excreción de bilis. Se observan datos morfológicos de destrucción progresiva de Jos conductos biliares intrahepáticos. La enfermedad puede deberse a colestasis crónica intrahepática o a la obstrucción del colédoco.
4.
Síndrome
nefrótico.
Padecimiento
renal
que
se
caracteriza
por
proteinuria,
hipoalbuminemia, edema e hiperlipidemia. Puede cursar con eliminación urinaria de colesterol y otros lípidos. Este síndrome es ocasionado por lesión de Jos glomérulos. El efecto hiperlipidémico aparentemente se debe a la mayor producción de lipoproteínas para compensar la pérdida de albúmina por la vía urinaria, reduciendo así la alteración de la presión oncótica intravascular. 5.
Mixedema (hipotiroidismo). En este caso hay insuficiencia de la glándula tiroides y el efecto se atribuye a la disminución de receptores hepáticos para las LBD.
6.
Diabetes sacarina (Diabetes mellitus). La hipercolesterolemia se presenta frecuentemente en
esta
enfermedad.
Al
disminuir
hipercolesterolemia.
49
la
hiperglucemia
también
disminuye
la
7.
Hipercolesterolemia familiar. Padecimiento genéticamente determinado, causado por
falta de receptores hepáticos para LBD, lo que ocasiona que los niveles de colesterol circulante se incrementen.
8. Enfermedad cardiovascular y aterosclerosis. Epidemiológicamente esta patología es la más importante que se asocia con hipercolesterolemia, siendo la causa fundamental de la presentación de infarto agudo al miocardio. Existen datos que indican que las concentraciones de colesterol plasmático superiores a 200 mg/dl se asocian con una mayor frecuencia de aterosclerosis, de manera tal que a mayor concentración, la aterosclerosis aparece a una edad menor. Par tanto, como medida preventiva debe tenerse cuidado de que las cifras de colesterol se mantengan por debajo de dicho límite.
PROCEDIMIENTO (Randox)
Fundamento: Para determinar el colesterol total, primeramente se hidrolizan sus esteres mediante colesterol esterasa, liberando colesterol y ácidos grasos. Enseguida se oxida el colesterol mediante colesterol oxidasa, generándose como productos colesten-3-ona y peróxido de hidrógeno. Este último reacciona con fenal y 4-aminoantipirina por catálisis de la peroxidasa, produciendo quinoneimina (compuesto colorido). La concentración de quinoneimina es proporcional a la concentración de colesterol total.
Pipetear en tubos de ensayo:
Agua destilada
10 Jll
Patrón Suero o plasma Reactivo de trabajo
1.0 ml
1.0 ml
1.0 ml
Mezclar e incubar a 3r C durante S min. y medir la absorbancia (A) de la muestra y del patrón frente al blanco a 546 nm. El color es estable durante 60 min.
50
CÁLCULO (A m""'"/A potcó,)
X
200 = _ _ mg/dL Colesterol
VALORES DE REFERENCIA Deseable: Límite alto:
< 200 mg/dL 200-239 mg/dl
Hipercolesterolemia: ~ 240 mg/dl
BIBLIOGRAFÍA González de Buitrago, J. M., E. Arillo Ferreiro, M. Rodríguez-Segade & A. Sánchez Pozo. Bioquímica Clínica. McGraw-Hill, 1998 Guadalajara, J. F. Cardiología. 5'. Ed., Méndez Editores, 1990 Devlin, T. M. (Editor) Textbook of Biochemistry with clinical correlations, 2002
51
s'"
edition. Wiley-Liss,
RESULTADOS, DISCUSION Y CONCLUSIONES
52
COLESTEROL-LBD Y COLESTEROL-LAD SÉ RICOS OBJETIVOS
1.
El alumno determinará la concentración de colesteroi-LBD y colesteroi-LAD en una muestra de suero sanguíneo después de ayuno de 12 horas.
2.
El alumno explicará la relevancia clínica del colesterol asociado a LBD y a LAD
GENERALIDADES
LBD. Las lipoproteínas de baja densidad transportan en la sangre la mayor cantidad del colesterol liberado por el hígado y lo llevan hacia los tejidos periféricos, aunque después su mayor parte regresa al tejido hepático. Las células que captan LBD poseen receptores membranales capaces de reconocer a dichas lipoproteínas siempre y cuando éstas contengan apoproteína B-
100. Una vez incorporadas las LBD por endocitosis, el colesterol queda libre y se integra al metabolismo celular, pudiendo almacenarse previa esterificación catalizada por la enzima acil CoA colesterol aciltransferasa {ACAT).
El hígado segrega normalmente lipoproteínas de muy baja densidad (LMBD), las cuales se convierten en lipoproteínas de densidad intermedia (LDI) al perder una buena parte de sus triacilgliceroles por efecto de la enzima lipoproteína lipasa {LPL) en los capilares de los tejidos periféricos. Aproximadamente la mitad de las LDI del plasma son captadas por el hígado, y las que no, se convierten en LBD por acción de la lipasa hepática. Los individuos que padecen hipercolesterolemia familiar tienen receptores para LBD con alteraciones estructurales y funcionales genéticamente determinadas. Los individuos normales que ingieren dietas con alto contenido de colesterol tienen en su hígado un exceso de colesterol, lo cual hace que disminuya el número de receptores para LBD en la superficie celular, con el consecuente aumento de la concentración plasmática del colesterol LBD. La regulación del metabolismo de las LBD y por tanto del colesterol, depende de su concentración plasmática, ya que si se presenta una reducción de las LBD del plasma y por tanto del colesterol hepático, se activa la HMGCoA reductasa, enzima reguladora de la síntesis hepática de colesterol. Con la mayor producción de colesterol se restituye la concentración plasmática de LBD y colesterol. Por el contrario, si aumenta la concentración plasmática de las LBD se incrementa la captación hepática del colesterol y este inhibe a la HMGCoA reductasa con la consiguiente disminución de la síntesis de colesterol hepático. Adicionalmente, disminuye la síntesis de receptores para LBD, lo cual se traduce en menor número de receptores en la superficie celular, lo
53
que a su vez reduce la captación hepática de las LBD plasmáticas. En las personas sanas este mecanismo mantiene dentro de los intervalos normales la concentración de LBD circulantes y su colesterol. El aumento de la concentración plasmática de colesteroi-LBD es uno de los factores de riesgo más importantes para generar aterosclerosis.
Por el
contrario,
la terapia
que reduce sus
concentraciones sanguíneas reduce también la probabilidad de aparición de afecciones coronarias. Se consideran cifras normales por debajo de 160 mg/dL, aunque son deseables cifras menores a 130 mg/dl.
LAD. Las lipoproteínas de alta densidad se forman en el hígado y en el intestino. Recién secretadas se les denomina LAD nacientes y son una especie de vesículas planas. En la circulación adquieren apoproteína A y apoproteína C provenientes de las LMBD y de los quilomicrones. Las LAD reciben fosfolípidos y colesterol no esterificado a partir de la superficie celular en los tejidos periféricos y a partir de otras lipoproteínas. En dichas lipoproteínas ocurre la esterificación del colesterol ya que contienen la enzima lecitina colesterol acil transferasa (LCAT). A esto se debe que normalmente 2/3 del colesterol sanguíneo se encuentre esterificado. Las LAD llevan al hígado el colesterol esterificado, lo cual constituye en su conjunto un proceso que se conoce como transporte inverso de colesterol, el cual es un mecanismo importante para evitar la hipercolesterolemia y la aterosclerosis. Todos aquellos factores que disminuyen las LAD (tabaquismo, obesidad, vida sedentaria, andrógenos, beta-bloqueadores, hipertriacilglicerolemia, anabólicos esteroides, diabetes mellitus, etc.) son promotores de la aterosclerosis. Se considera conveniente una concentración de colesteroi-LAD mayor a 55 y 65 mg/dL para hombres y mujeres, respectivamente y como factor de riesgo aterogénico elevado, una concentración menor a 35 y a 45 mg/dL en hombres y mujeres, respectivamente. El colesterol, las LBD Y LAD deben cuantificarse en sujetos sanos después de los 20 años de edad, por lo menos cada 5 años y con mucha mayor razón si presentan uno o más factores de riesgo aterogénico.
54
IMPORTANCIA CLÍNICA
SE REGISTRA INCREMENTO DE LA CONCENTRACIÓN DE LBD EN LAS SIGUIENTES SITUACIONES O PATOLOGÍAS: Dietas ricas en colesterol. El consumo rutinario de alimentos como huevo, leche entera, queso, vísceras, camarones y carnes rojas, estimula el aumento de estas lipoproteínas en la sangre. En el caso del huevo, ciertos estudios sugieren que su ingesta no influye significativamente sobre la colesterolemia, supuestamente por la presencia de un inhibidor (lecitina) de la absorción intestinal del colesterol, presente en dicho producto. Hipercolesterolemia familiar. Es un padecimiento de origen genético causado por disminución o falta de receptores hepáticos para las LBD o mutaciones de la apoproteína B-100 Dietas ricas en carbohidratos. En el hígado el exceso de carbohidratos de la dieta se transforma en grasa y colesterol, los cuales se envían a la circulación en forma de LMBD, dando lugar parcialmente a la formación de LBD por intermedio de las LDI. Tabaquismo. El efecto se observa en sujetos que fuman más de 20 cigarrillos al día y se atribuye a una acción oxidante de algunos componentes del humo del tabaco sobre las LBD, alterando el metabolismo de éstas. Aterosclerosis. Se llama ateroesclerosis a la presencia de placas en la íntima arterial en vasos como la aorta, las coronarias, la cerebral, la carótida interna, la ilíaca, la femoral y las mesentéricas. Aquellas con un diámetro menor a 300 ¡.tm no son afectadas. No se trata de una enfermedad sistémica, sino que afecta ciertos sitios con gran predilección. En estos sitios el endotelio vascular presenta mayor permeabilidad a diversos componentes del plasma, entre los cuales destacan las LBD y los monocitos, que tienden a acumularse en el espacio subendotelial. En este espacio los monocitos se transforman en macrófagos, los cuales, al igual que las células endoteliales y las del músculo liso, forman radicales libres. Estos propician la peroxidación de los ácidos grasos insaturados de las LBD. Los macrófagos fagocitan a las LBD oxidadas y se transforman en células espumosas. La necrosis de las células espumosas provoca un proceso inflamatorio que promueve la síntesis de colágena y la proliferación de células de músculo liso, las cuales migran hacia el espacio subendotelial y dan lugar a la formación de una placa en el endotelio vascular que es llamada estría grasa. Si la hipercolesterolemia persiste, el proceso mencionado se perpetúa y la placa sigue creciendo. Con frecuencia, en etapas tardías la placa arterial se fisura, con lo que se activa la generación de un trombo sobre la placa, precipitándose así la oclusión vascular.
55
VARIACIONES DE LA CONCENTRACIÓN DE LAD Comida grasa. Después de ingerir comidas ricas en grasa su concentración puede disminuir entre
lO y 20%. Ejercicio. El ejercicio físico rutinario produce su aumento
PROCEDIMIENTO PARA CUANTIFICAR COLESTEROL-LBD (Randox) Fundamento: consta de 2 fases, aclaramiento y reacción FASE DE ACLARAMIENTO Los quilomicrones, las LMBD y las LAD se destruyen mediante detergentes específicos, liberando sus ésteres de colesterol y su colesterol libre. Las LBD quedan intactas con este tratamiento. Los ésteres de colesterol se hidrolizan enzimáticamente, produciendo colesterol y ácidos grasos libres. Posteriormente el colesterol libre se oxida enzimáticamente para producir colestanona y peróxido de hidrógeno y finalmente este último se reduce, produciendo agua y liberando oxígeno.
COLESTEROL ESTERASA
Ésteres de colesterol - - • colesterol+ ácido graso COLESTEROL OXIDASA
Colesterol+ 0 2 ---+colestenona + H20 2 CATAlASA
2 H20 + 0 2
H20 2 FASE DE REACCIÓN
El propósito de la fase de aclaramiento es eliminar todo el colesterol asociado a las lipoproteínas antes mencionadas. Una vez cubierto esto, se repite el procedimiento hasta la producción de peróxido de hidrógeno para posteriormente hacer que reaccione enzimáticamente con ciertas sustancias para generar quinoneimina, que tiene color. La intensidad del color producido es proporcional a la concentración de colesteroi-LBD PEROXIDASA
H20 2 + 4-AA + HDAOS ---.quinoneimina +4 H2 0 2
56
Pipetear en tubos de ensayo:
Patrón
10 11L
Suero Reactivo 1
750 11L
750 11L
Mezclar e incubar S minutos a 37" e y medir la absorbancia A1 de la muestra y del patrón a 578 nm frente a agua destilada Después agregar:
Reactivo R2
0.25 mL
0.25 mL
Mezclar e incubar S minutos a 37 2C y medir la absorbancia (A 2 ) de la muestra y del patrón a 578 nm frente a agua destilada
CÁLCULO [(Az- Adm"'""/(A,- A,)pwóol x concentración del patrón = ___ mg/dL colesteroi-LBD
VALORES DE REFERENCIA
ADULTOS
SIN RIESGO
RIESGO MODERADO
RIESGO AlTO
< 130 mg/dL
130-1S9 mg/dl
2160 mg/dl
PROCEDIMIENTO PARA CUANTIFICAR COLESTEROL-LAD (Randox) El fundamento y la técnica son iguales a los del colesteroi-LBD, excepto que en la fase de aclaramiento se utiliza un detergente adecuado para destruir quilomicrones, LMBD y LBD.
CÁLCULO
[(A 2 - A1 )m"""'/(A2 - A1 )p,,ó,l x concentración del patrón = _ _ _ mg/dL colesteroi-LAD
57
VALORES DE REFERENCIA
SIN RIESGO
RIESGO MODERADO
RIESGO ALTO
HOMBRES
>55 mg/dl
35-55 mg/dl
<35 mg/dl
MUJERES
>65 mg/dl
35-55 mg/dl
<45 mg/dl
BIBLIOGRAFÍA Balcells, A.
La Clínica y el Laboratorio. Ed. Marín, 1989
González de Buitrago, J. M., E. Arillo Ferreiro, M. Rodríguez-Segad e & A. Sánchez Pozo.
Bioquímica
Clínica. McGraw-Hill, 1998 Devlin, T. M. (Editor)
Textbook of Biochemistry with clinical correlations, s'h edition. Wiley-liss,
2002 Scriver, C. R., A. L. Beaudet, W. S. Sly & D. Valle (Ed.) ed. McGraw-Hill, 1995
58
The Metobolic Bases of lnherited Disease, 7'h
RESULTADOS, DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
59
TRANSAMINASAS SÉRICAS OBJETIVOS
1.
El alumno determinará la actividad de las enzimas TGO y TGP en una muestra de suero sanguíneo
2.
El alumno explicará los contextos clínicos en que es relevante la cuantificación de transaminasas sé ricas
GENERALIDADES
Las transaminasas o aminotransferasas son enzimas que participan en el metabolismo de los aminoácidos, tanto en su degradación como en su biosíntesis, con un requerimiento estricto por fosfato de piridoxal, coenzima derivada de la vitamina B6 . Cuando los aminoácidos se catabolizan para liberar energía o se transforman en sustancias utilizables energética mente, como la glucosa o los cuerpos cetónicos, la primera reacción que sufren es la pérdida de su grupo amino, lo cual ocurre principalmente mediante reacciones de transaminación. La transaminación es una reacción reversible en la que un aminoácido y un cetoácido intercambian recíprocamente sus grupos amino y ceto, produciendo, a partir del aminoácido, un cetoácido y a partir del cetoácido, un aminoácido, como lo indica la siguiente reacción general: Aminoácido A + Cetoácido A
""' Aminoácido B + Cetoácido B
Una vez que los aminoácidos pierden su grupo amino, se integran a las vías que los catabolizan o que los transforman en glucosa y/o cuerpos cetónicos. El cetoácido que participa de manera preponderante para que los aminoácidos pierdan su grupo amino es el a-cetoglutarato, el cual se transforma en glutamato en la reacción transaminante al perder su grupo ceto y adquirir el amino, de tal manera que este aminoácido porta el grupo amino que perteneció a otros aminoácidos. A fin de que este proceso pueda seguir ocurriendo se hace necesario que el glutamato se reconvierta en su cetoácido por una reacción no transaminante. La regeneración de acetoglutarato a partir de glutamato es catalizada por la glutamato deshidrogenasa y se trata de un proceso de desaminación oxidativa que libera el grupo amino del glutamato como amonio, al tiempo que reduce NAO+ como lo indica la siguiente reacción: Glutamato + NAO+ + H2 0
""' a-cetoglutarato + NADH + H+ + NH;
Debido a que las tranasaminasas catalizan reacciones reversibles, pueden sintetizar los distintos aminoácidos no esenciales a partir de sus respectivos cetoácidos y glutamato.
60
IMPORTANCIA CLÍNICA En el plasma sanguíneo se encuentran dos transaminasas de relevancia diagnóstica, la transaminasa glutámico-oxalacética (TGO), también conocida como aspartato aminotransferasa (AST), y la transaminasa glutámico-piruvica (TGP) o alanina aminotransferasa (ALT). La TGO abunda en hígado, corazón y músculo esquelético, encontrándose tanto en el citosol como en las mitocondrias de las células en dichos tejidos. La TGP presenta una distribución más restringida, encontrándose casi exclusivamente en el citosol de los hepatocitos. Las reacciones que catalizan estas enzimas son las siguientes: AST(TGO) Aspartato + a.-cetoglutarato ,: Oxalacetato + Glutamato ALT (TGP) Alanina + a.-cetoglutarato ,: Piruvato + Glutamato SE PRESENTA INCREMENTO OE LAS TRANSAMINASAS EN LOS SIGUIENTES CASOS:
1.
Infarto al miocardio. Se detecta elevación de la TGO en el suero sanguíneo 6 a 12 horas
después del infarto y aumenta rápidamente hasta un máximo entre 24 y 48 horas posteriores al inicio de los síntomas. En casos sin complicaciones la actividad de TGO empieza a disminuir al poco tiempo, regresando a los valores de referencia hacia el quinto día o incluso antes. La actividad máxima es del orden de 4 a 8 veces el límite superior del intervalo normal, pero esto depende de algunos factores como el tamaño del infarto y el grado del choque. En casos muy severos puede detectarse en el suero la isoenzima mitocondrial de la TGO, lo cual puede contribuir a definir un pronóstico. En los casos típicos sin complicaciones, la TGP no se eleva o sólo lo hace moderadamente. Sin embargo, si se presenta insuficiencia cardiaca o choque severo, la TGP generalmente aumenta y puede hacerlo incluso por arriba de la TGO, lo cual se atribuye al daño hepático secundario a la anoxia tisular generalizada. Oe esta manera, la determinación de TGP tiene poco valor diagnóstico en casos de infarto al miocardio, pero puede ser muy útil para la detección de sus complicaciones. 2.
Enfermedad hepatobiliar. De manera característica ambas transaminasas se elevan en el
suero de pacientes con hepatitis viral, registrándose máximos de 10 a 30 veces los valores normales cuando aparece la ictericia. Sin embargo, la elevación se registra desde la fase prodrómica, incluso 10 días antes de que se evidencie la ictericia. La elevación de las
61
transaminasas se presenta en casi todos los tipos de enfermedad hepatobiliar pues el aumento correlaciona tanto con la regurgitación biliar como con la necrosis hepatocelular, de manera que con excepción de los casos de hiperbilirrubinemia prehepática, los pacientes ictéricos manifestaran incremento de ambas enzimas en el suero. La cirrosis biliar primaria o secundaria produce incrementos iguales y moderadamente marcados en ambas transaminasas, aproximadamente 4 veces los valores normales máximos.
La
obstrucción hepatobiliar cursa en casi todos los pacientes con elevación de ambas transaminasas, con un intervalo de 2 a 8 veces la actividad superior normal. 3.
Embolia. Si se presenta con infarto y necrosis tisular de cualquier localización (excepto el
cerebro) produce incrementos discretos, inconstantes y de corta duración de las transaminasas séricas. 4. Afecciones musculares. Se produce incremento de las transaminasas séricas en casos de distrofia muscular, traumatismos musculares extensos, triquinosis, etc. S.
Kwashiorkor. Forma grave de desnutrición por carencia de nutrientes vitales básicos y deficiencia importante de proteínas. El trastorno se inicia comúnmente cuando el niño es destetado y no recibe una dieta apropiada, sino cantidades importantes de carbohidratos. En estas condiciones los niños son más vulnerables a padecer procesos infecciosos, ofreciendo poca resistencia frente a ellos pues de hecho se trata de pacientes inmunodeficientes que fallecen frecuentemente víctimas de infecciones generalizadas. A primera vista los niños con kwashiorkor no parecen enfermos pues tienen cara redonda con grosor de miembros aparentemente adecuado, aunque con abdomen prominente. Estas características se deben a la presencia de edema por la baja concentración de proteínas plasmáticas. Los músculos sin embargo se hallan debilitados al no disponer de aminoácidos para soportar el recambio natural de sus proteínas. La prominencia abdominal es el resultado del edema, la ascitis y la hepatomegalia que acompañan a la patología. Los niños afectados pueden mostrar cifras relativamente altas de la TGP sé rica (aproximadamente el 40% de los pacientes afectados alcanzan actividades de hasta 10 veces los valores normales), las cuales se mantienen hasta dos semanas después de empezar a tomar una alimentación normal.
62
PROCEDIMIENTO PARA CUANTIFICAR ACTIVIDAD DE AST (Randox)
Fundamento: se pone la muestra en contacto con aspartato y a-cetoglutarato para que reaccionen transaminando y produzcan glutamato y oxalacetato. El oxalacetato producido reacciona con 2, 4-dinitro-fenihidracina y produce oxalacetato hidrazona, que es un compuesto que tiene color. la intensidad del color es proporcional a la actividad de la AST.
Pipetear en tubos de ensayo:
Suero
0.1 ml
Tampón (R1-AST)
0.5 ml
Mezclar e incubar a 3r Después agregar:
0.5 ml
e durante exactamente 30 minutos.
2, 4-DNP (R2)
0.5 ml
Suero
0.1 ml
0.5 ml
Mezclar, dejar reposar durante exactamente 20 minutos entre 20 ºC. Después agregar:
Hidróxido sódico (R3)
5.0ml
y 25
5.0ml
Mezclar y después de S minutos leer la absorbancia (A) a 546 nm de la muestra frente al blanco
CÁLCULO
Obtener la actividad de la ASTa partir de la siguiente tabla: ABSORBANCIA
AST{U/L)
ABSORBANC!A
AST(U/L)
0.020 O.D30
7 10 13 16 19 23 27 31
0.100 0.110 0.120 0.130 0.140 0.150 0.160
36 41 47 52 59 67 76 89
0.040
0.050 0.060 0.070 0.080 0.090
0.170
63
VALORES DE REFERENCIA
Hasta 12 U/L AST
PROCEDIMIENTO PARA CUANTIFICAR ACTIVIDAD DE ALT (Randox)
Fundamento: se pone la muestra en contacto con alanina y a-cetoglutarato para que reaccionen transaminando y produzcan glutamato y piruvato. El piruvato producido reacciona con 2, 4dinitro-fenihidracina y produce piruvato hidrazona, que es un compuesto que tiene color. La intensidad del color es proporcional a la actividad de la ALT.
Pipetear en tubos de ensayo:
Suero Tampón (R1-ALT)
0.1 mL 0.5 mL
0.5 mL
Mezclar e incubar a 37° C durante exactamente 30 minutos. Después agregar:
2, 4-DNP (R2)
0.5 mL
Suero
0.1 mL
0.5 mL
Mezclar, dejar reposar durante exactamente 20 minutos entre 20 y 25 !!C. Después agregar:
Hidróxido sódico (R3)
5.0 mL
5.0mL
Mezclar y después de S minutos leer la absorbancia (A) a 546 nm de la
muestra frente al blanco
64
CÁLCULO Obtener la actividad de la ALTa partir de la siguiente tabla: ABSORBANCIA
ALT (U/L)
ABSORBANCIA
ALT (U/l)
0.025 0.050
4 8 12 17 21 25 29 34 39 43
0.275 0.300 0.325 0.350 0.375 0.400 0.425 0.450 0.475
48 52 57 62 67 72
0.075
0.100 0.125
0.150 0.175 0.200 0.225 0.250
o.soo
77
83 88 94
VALORES DE REFERENCIA Hasta 12 U/L ALT
BIBLIOGRAFÍA González de Buitrago, J. M., E. Arillo Ferreiro, M. Rodríguez-Segad e & A. Sánchez Pozo. Bioquímica Clínica. McG raw-Hill, 1998 Devlin, T. M. (Editor) Textbaok of Biochemistry with clinical correlations, 5th edition. Wiley-Liss, 2002 http ://www .m o nografias.com/tra bajos 15/desn utricion-c1ases/ desnutricionclases.shtm 1 (kwashiorkor)
65
RESULTADOS, DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
66
UREA SÉ RICA OBJETIVOS
1.
El alumno determinará la concentración de urea en una muestra de suero sanguíneo
2.
El alumno explicará el contexto clínico relevante de la cuantificación de urea sérica
GENERALIDADES
El catabolismo de las proteínas es un proceso que ocurre de continuo por el recambio normal a que se encuentran sometidas la proteínas y por el recambio celular en los tejidos con capacidad de división celular. También ocurre en forma importante durante el ayuno, para activar la síntesis de glucosa, sustancia fundamental para el cerebro y otros tejidos o tipos celulares. Los productos del catabolismo de las proteínas son los aminoácidos libres, los cuales mediante el proceso conocido como transdesaminación se transforman en los cetoácidos correspondientes, con la liberación concomitante del nitrógeno aminoacídico en forma de ion amonio. El amonio es una sustancia tóxica para el organismo, especialmente para el sistema nervioso
central, por lo que, luego de liberarse en los diversos tejidos, llega al hígado formando parte de diversas moléculas, fundamentalmente alanina y glutamina, las cuales se descomponen para liberar un nitrógeno como amonio. En el hígado el amonio se transforma en urea a través del ciclo de la urea o ciclo de KrebsHenseleit. La urea es una sustancia de muy bajo peso molecular, sin carga eléctrica formal y capaz
de permear fácilmente las membranas. Es un producto de desecho que se elimina principalmente por la vía renal y es notoriamente menos tóxico que el amonio. La insuficiencia hepática limita la transformación de amonio en urea, de lo cual puede resultar hiperamonemia, condición bajo la cual el cerebro sufre desarreglos metabólicos que se traducen
en alteraciones neurológicas potencialmente severas. En condiciones normales, la concentración de urea en la sangre se halla influenciada por la magnitud del aporte dietario de proteínas y por el estado de hidratación general. En este último caso, la deshidratación se asocia con hemoconcentración y consecuentemente se registra incremento aparente de la concentración de urea. El exceso de líquidos, por el contrario, se asocia con hemodilución y baja en la concentración de urea. El término azoemia o azotemia se utiliza en ocasiones para referirse a la presencia de nitrógeno de origen proteínico en la sangre, es decir a la urea.
67
IMPORTANCIA CLÍNICA EL AUMENTO DE LA CONCENTRACIÓN DE UREA EN LA SANGRE PUEDE OCURRIR DEBIDO A CAUSAS COMO LAS SIGUIENTES: PRERRENALES, las cuales se deben a un descenso en la perfusión renal por diferentes factores, entre los cuales se encuentran:
1.
Deshidratación, causada por quemaduras, hemorragia digestiva, diarrea, vómito, lavado gástrico y terapia a base de diuréticos.
2.
Secuestro de líquidos, como ocurre en la pancreatitis y la peritonitis
3.
Insuficiencia circulatoria, la cual se puede presentar en la insuficiencia cardiaca congestiva, vasodilatación periférica, síndrome hepatorrenal (condición clínica que ocurre en pacientes con patología hepática avanzada, caracterizada por el deterioro de la función renal, apareciendo una notoria vasoconstricción que da lugar a reducción importante de la filtración glomerular) y en el estado de choque.
4.
Infecciones, debido al aumento de la proteólisis, como ocurre en la neumonía, la difteria y la escarlatina.
RENALES O NEFROPÁTICAS, las cuales incluyen patologías y condiciones que cursan con insuficiencia renal aguda o crónica. Entre ellas se encuentran las siguientes:
1.
Uremia y glomerulonefritis agudas. Grupo de enfermedades que cursan con inflamación de las estructuras internas del riñón, en particular de los glomérulos. Frecuentemente su causa es una respuesta inmunitaria desencadenada por infecciones. Cursa con hematuria micro o macroscópica, proteinuria en grado variable, hipertensión, insuficiencia renal aguda
y
edema
hipervolémico.
Un
buen
ejemplo
es
la
glomerulonefritis
postestreptocócica, que se presenta en niños después de que sufrieron un episodio de faringitis por estreptococo (3-hemolítico. Los antígenos de la bacteria se depositan en los glomérulos durante la infección y posteriormente la respuesta inmunológica produce anticuerpos que generan complejos con los antígenos, alterando la permeabilidad de la membrana basal glomerular. 2.
Nefropatía anúrica. Insuficiencia renal en que se pierde la capacidad de producir orina. Puede deberse a traumatismos, anoxia u otras causas. Por ejemplo puede presentase en pacientes con hiperuricemia extrema (> 15 mg/dL) por precipitación de cristales de ácido úrico en los tú bulos colectores, favorecida por un pH urinario bajo.
68
3.
Uremia crónica, debida a lesiones renales avanzadas, glomerulonefritis crónica, esclerosis
renal, tuberculosis renal, pielonefritis y síndrome nefrótico (combinación de alteraciones clínicas y de laboratorio caracterizadas por proteinuria severa e hipoalbuminemia. En forma variable aparecen edema, hiperlipidemias y lipiduria). 4.
Administración
de
fármacos
nefrotóxicos,
tales
como
furosemida,
rifampicina,
antiinflamatorios no esteroides, etc. POSTRENALES, las cuales dificultan la excreción de urea debido a obstrucción de vías como ocurre en los siguientes casos:
1. Cáncer de próstata 2.
Anuria obstructiva, debido a la presencia de cálculos ureterales, en particular si la
obstrucción es bilateral o si no existe el riñón contra-lateral 3.
Accidentes quirúrgicos, por ejemplo ligadura ureteral
PROCEDIMIENTO (Randox)
Fundamento: la hidrólisis de la urea produce amoniaco y dióxido de carbono por catálisis de la ureasa. El amoniaco generado reacciona con salicilato e hipoclorito, produciendo 2, 2dicarboxilindofenol, que tiene color verde. La intensidad del color obtenido es directamente proporcional a la concentración de urea.
Pipetear en tubos de ensayo:
10 ¡.tl
Patrón
10 ¡.tl
Suero o plasma Reactivo de trabajo
1.0ml
1.0 ml
1.0 ml
Mezclar e incubar durante 3 minutos a 37 ºC. Después, añadir:
Hipoclorito sódico
200 ¡.tl
200 ¡.tl
200 ¡.tl
Mezclar e incubar a 37° C durante 5 min. y medir la absorbancia (A) a 600 nm de la
muestra y del patrón frente al blanco. El color es estable durante 2 horas
69
CÁLCULO
(A muew,/A ,,,;,)X 50= _ _ mg/dl Urea VALORES DE REFERENCIA
15-45 mg/dl
BIBLIOGRAFÍA
Balcells, A. La Clínica y el Laboratorio. Ed. Marín, 1989 González de Buitrago, J. M., E. Arillo Ferreiro, M. Rodríguez-Segade & A. Sánchez Pozo. Bioquímica
Clínica. McGraw-Hill, 1998 Devlin, T. M. (Editor) Textbook of Biochemistry with clinical correlations, 5th edition. Wiley-Liss, 2002 Borrego, J. Nefrología, Corporación para investigaciones biológicas, 2003, p. 442 http://www.sepeap.org/imagenes/secciones/lmage/ USER /Giomerulonefritis aguda(1)pdf http://www.bago.com/BagoArg/Biblio/urolog148web.htm
70
RESULTADOS, DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
71
CAPACIDAD AMORTIGUADORA DEL PLASMA SANGUÍNEO OBJETIVOS
1.
El alumno comparará una muestra de plasma sanguíneo con una muestra de solución salina fisiológica en cuanto a su capacidad de amortiguamiento
2.
El alumno explicará el contexto fisiológico y clínico relevante del amortiguamiento del pH en el organismo humano
GENERALIDADES
Los cambios en la concentración de hidrogeniones afectan la estructura de las proteínas. Si se trata de enzimas, es posible que pierdan o disminuyan significativamente su actividad catalítica. Si se trata de proteínas membranales, pueden sufrir alteraciones severas en su estructura, con potencial impacto en la actividad de diversos sistemas de transporte y señalización que actúan en la membrana. El amortiguamiento del pH es la propiedad que tienen ciertas soluciones de no modificar significativamente su pH al recibir cantidades moderadas de ácido o de álcali, cantidades que, añadidas a muestras equivalentes de agua o soluciones no amortiguadas, producirían cambios significativos de pH. El pH sanguíneo normal es de 7.4 (intervalo 7.35-7.45). La importancia de que no varíe de manera significativa se aprecia al considerar la información empírica de que virtualmente nadie sobrevive a valores de pH sanguíneo menores a 7.0 ni mayores a 7.8. El mantenimiento del pH normal depende de la presencia de sistemas amortiguadores, de los cuales los más importantes en la sangre son el de bicarbonato/C0 2 y el de hemoglobinato/ hemoglobina. IMPORTANCIA CLÍNICA
Las alteraciones del pH sanguíneo pueden ser las siguientes: Acidosis metabólica. Consiste en la disminución del pH por aumento en la producción de ácidos
no carbónicos. Por ejemplo, en la Diabetes mellitus tipo
1
puede producirse acidosis por la
producción incrementada de cuerpos cetónicos, de los cuales los principales son el ácido acetoacético y el ácido ~ -hidroxibutírico. En pacientes con hipoxemia intensa se producen cantidades excesivas de ácido láctico, lo cual también puede producir acidosis metabólica
72
La acidosis metabólica puede resultar de las diarreas graves debido a que el líquido de los intestinos delgado y grueso posee cantidades importantes de bicarbonato. En la uremia debida a casi todas las formas de enfermedad renal crónica se produce acidosis metabólica debido a que la secreción renal de hidrogeniones y de amoniaco es deficiente. El amoníaco (NH 3 ) que se produce en los riñones se combina con hidrogeniones del medio y se convierte en amonio (NH;), de manera tal que cada ion amonio que se excreta por la orina equivale a la eliminación de un hidrogenión. Alcalosis metabólica. Consiste en el incremento de pH debido generalmente a la pérdida de ácido no carbónico, como ocurre en los casos de vómito prolongado o intenso, y en casos en los que se practica aspiración gástrica. En ambas condiciones se pierde el ácido clorhídrico presente en el jugo gástrico y se pierde el equilibrio ácido-básico a favor de la alcalosis. En los casos en los que el riñón retiene Na• y HC0 3·, como ocurre con el uso terapéutico excesivo de hormonas esteroides suprarrenales o en enfermedades que cursan con hiperproducción de dichas hormonas, puede presentarse alcalosis metabólica debido al exceso de concentración de bicarbonato. El riñón deja pasar con cierta facilidad al potasio (K•), y aunque con dietas normales es improbable una deficiencia de este elemento, en pacientes alimentados con sonda nasogástrica o por vía intravenosa durante tiempos prolongados, puede presentarse déficit si no se incorpora en esas formas de alimentación. Debido a que el potasio se encuentra fundamentalmente en el medio intracelular, su pérdida por el intestino y/o por el riñón, produce su depleción intracelular. La respuesta a esto es el ingreso de hidrogeniones y sodio a las células. Si a la depleción de potasio acompaña una disminución del volumen extra celular, el riñón retiene sodio y empieza a excretar abundante e inadecuadamente iones hidrógeno para neutralizar las cargas negativas de iones poco reabsorbibles, como son fosfato, sulfato y aniones de ácidos orgánicos. Dicha excreción de hidrogeniones explica la alcalosis metabólica que puede asociarse con la depleción de potasio. Acidosis respiratoria. Consiste en la disminución del pH debida a la incapacidad de la ventilación alveolar para excretar C0 2 a una velocidad apropiada, produciéndose en consecuencia un exceso de ácido carbónico. La hipoventilación se puede producir si el centro respiratorio se halla deprimido por agentes anestésicos, sedantes o hipoxia y en alteraciones del sistema nervioso central de diversos tipos, como traumatismo, isquemia o presión elevada del líquido cefalorraquídeo.
73
La hipoventilación alveolar también puede producirse en las enfermedades de los músculos respiratorios así como en las afecciones que limitan significativamente los movimientos del tórax, como artritis, deformidades torácicas y obesidad. El movimiento de los pulmones puede verse restringido por acumulación intratorácica de líquido pleural o de sangre, y por neumotórax (acumulación de aire o gas en la cavidad pleural). Las enfermedades pulmonares, como bronquitis crónica, enfisema, asma, insuficiencia cardiaca congestiva, tumores infiltrativos y obstrucciones de vías respiratorias altas par estenosis traqueal, cuerpo extraño o tumor, también se asocian con hipoventilación alveolar. Alcalosis respiratoria. Consiste en el aumento del pH debido a una ventilación alveolar excesiva
con relación a los requerimientos de eliminación de C0 2• La hiperventilación se produce, entre otras causas, por sobredosis de medicamentos como los salicilatos, 2,4-dinitrofenol y paraldehído. La ventilación pulmonar también puede aumentar por efecto de lesiones del SNC como meningitis, encefalitis, hemorragia cerebral o traumatismos. La fiebre, el choque, la bacteriemia por gram negativos y el hipertiroidismo también se acompañan por hiperventilación. Asimismo, la hiperconcentración de hormonas como la adrenalina y la progesterona puede producir hiperventilación, presumiblemente por acción sobre el sistema nervioso central. Otra causa de la alcalosis respiratoria es la hiperventilación histérica.
MATERIAL
1.
Vasos de precipitados de 50 mL (2)
2.
Plasma sanguíneo (40 mL)
3.
Solución salina fisiológica (20 ml)
4.
Solución de HCI 0.1 N
5.
Solución de Na OH 0.1 N
6.
Solución amortiguadora con pH 7.0
7.
Pipetas de 1 mL (2)
8.
Potenciómetro
9.
Agitador magnético
10. Regla geométrica
74
PROCEDIMIENTO
1. Transfiera 20 mL de plasma sanguíneo a un vaso de precipitados de 50 mL 2.
Transfiera 20 mL de solución salina fisiológica a otro vaso de 50 mL
3.
Registre el pH basal de ambas muestras con el potenciómetro debidamente calibrado
4.
Añada a cada muestra 1.0 mL de solución 0.1 N de HCI en fracciones de 0.2 mL, mezclando bien después de cada adición mediante el agitador magnético. Registre cada vez el pH.
5.
Grafique el pH en función del volumen añadido de la solución de ácido
6.
Repita el experimento con otra muestra de plasma añadiendo 1.0 mL de solución 0,1 N de Na OH en fracciones de 0.2 mL, como en el primer experimento, y grafique los resultados
BIBLIOGRAFÍA Krupp, M. A, L. M. Tierney, E. Jawetz, R. L. Roe & C. A Ca margo. Manual de Diagnóstica Clínica y de
Laboratorio, 8'. Ed. El Manual Moderno, 1986 Masora, E. J. & P. D. Siegel. Equilibrio Ácido-Base. Ed. Panamericana, 1973 1
Devlin, T. M. (Editor) Textbook of Biochemistry with clinical corre/ations, 5 h edition. Wiley-Liss, 2002
75
12
11
10
9
8
pH
7
6
S
4
3
2
o
0.2
0.4
0.6
Volumen de solución 0.1 N de HCI o NaOH (ml)
0.8
l. O
RESULTADOS, DISCUSION Y CONCLUSIONES:
77
CUANTIFICACIÓN DE HEMOGLOBINA GLICADA OBJETIVOS
1. El alumno explicará qué es la hemoglobina glicada y de qué depende su formación 2.
El alumno explicará el contexto clínico en que es relevante la cuantificación de hemoglobina glicada
GENERALIDADES
La glucosa es una sustancia fundamental para el metabolismo del organismo humano. Los distintos tipos celulares se hallan dotados de transportadores para este importante combustible biológico, teniendo acceso por lo tanto al ambiente intracelular en todos los tejidos. En el caso particular de los eritrocitos el transportador de la glucosa es el GluTl, que, como todos estos transportadores para glucosa, actúa con un mecanismo de difusión facilitada. La glucosa es una sustancia reactiva, capaz de combinarse químicamente con grupos amino. En el caso particular de la hemoglobina A1 1a glucosa se combina con el grupo amino libre de las cadenas ~ de la proteína, formando la
hemoglobina glicada conocida como HbA1c (también llamada
glicohemoglobina o hemoglobina glucosilada), sustancia totalmente estable que no desaparece sino hasta que los eritrocitos son captados por el sistema retículoendotelial como parte del proceso de recambio celular. La reacción entre la glucosa y la hemoglobina ocurre en mayor medida mientras mayor es la concentración de glucosa circulante, por lo cual se utiliza como medio de monitorizar el nivel de glucemia en las últimas semanas previas a la toma de muestra. Aunque existe correlación entre la proporción de hemoglobina glicada y la glucemia que ha tenido el paciente 1 a 3 meses antes del análisis, la mejor correlación se tiene con la glucemia de 2 a 4 semanas previas a la toma de muestra. IMPORTANCIA CLÍNICA
La utilidad de la cuantificación de hemoglobina glicada se tiene principalmente en el marco de la diabetes mellitus tipos 1 y 2. La diabetes mellitus tipo 2 es una patología de amplísima distribución mundial en la actualidad. En México la Encuesta Nacional de Salud 2006 reveló que en promedio 7% de las personas adultas (20 o más años de edad) eran diabéticas con diagnóstico previamente
78
establecido, siendo mayor la prevalencia al aumentar la edad, de manera que en el grupo de edad de 50 a 59 años era de 13.5% y en el de 60 a 69 años era de 19.2%, observándose en general una tendencia mayor en el sexo femenino. La diabetes mellitus es una patología que en función de tiempo impacta en la funcionalidad de la micro y vasculatura, lo cual produce patologías derivadas de gran relevancia como son la insuficiencia renal, las retinopatías y las neuropatías, así como la insuficiencia cardiaca y el infarto al miocardio. La presencia de 9-9.5% o más de hemoglobina glicada se asocia con una progresión muy rápida de las complicaciones microvasculares que produce la hiperglucemia, habiéndose encontrado en estudios de alto nivel que disminuyendo la proporción de hemoglobina glicada, disminuye el desarrollo y progreso de alteraciones en ojos, riñones y nervios, tanto en la diabetes tipo 1 como en la tipo 2. Se ha establecido que en los pacientes diabéticos el riesgo de sufrir las complicaciones microvasculares se reduce en 10% por cada punto porcentual que disminuya la concentración de hemoglobina glicada, de manera que si un paciente con un valor de 10% lo reduce a 8, tendrá un 20% menos riesgo de sufrir las complicaciones, debiendo disminuir la hemoglobina glicada por debajo de 7% para prevenir la patología microvascular. Recientemente la hemoglobina glicada ha sido integrada como criterio diagnóstico de la diabetes mellitus por la Asociación Americana para la Diabetes (AAD). Una concentración de 6.5 %o más de hemoglobina glicada es diagnóstica de dicha patología, como lo son otros criterios de la AAD entre los cuales se encuentran la concentración de glucosa de 126 mg/dL o más en plasma después de ayuno de al menos 8 horas o el registro de 200 mg/dL o más a las 2 horas en prueba de tolerancia a la glucosa. La cuantificación periódica de hemoglobina glicada permite saber el grado de control de la glucemia en los últimas semanas antes de realizarse la prueba, permitiendo al profesional de la salud darse cuenta con un criterio fidedigno del apego que ha tenido el paciente a las prescripciones dietéticas y medicamentosas que recibió. La AAD recomienda la cuantificación de HBA1c al menos 2 veces al año.
79
PROCEDIMIENTO (NycoCard) Fundamento: los eritrocitos se lisan al ponerse en contacto con una solución amortiguada de glicinamida que contiene también un detergente y ácido bórico conjugado con un colorante. La solución produce que la hemoglobina liberada se precipite y en esas condiciones la hemoglobina glicada HbA1c une al conjugado de ácido bórico en forma específica. Posteriormente se transfiere una alícuota de la solución a una membrana porosa que retiene la hemoglobina libre o conjugada y filtra el conjugado de ácido bórico, se lava el precipitado pare eliminar el conjugado de ácido bórico residual que no se unió y se cuantifica con un lector especial la hemoglobina glicada.
1.- Añadir S ¡.tL de sangre al tubo de prueba con reactivo (R1) 2.- Mezclar bien 3.- Incubar por 2 minutos 4.- Mezclar otra vez 5.- Aplicar 25¡.tL de combinación de reacción al centro de la placa de membrana 6.- Esperar de 15-20 segundos a que filtre 7.- Añadir 25uL de solución de lavado (R2) 8.- Esperar 10 segundos a que filtre 9.- Leer el resultado usando el lector de NycoCard Reader 11, colocando el lápiz sobre la membrana y bajando el capuchón del mismo.
VALORES DE REFERENCIA
4.5-6.3%
80
BIBLIOGRAFÍA
Bunn, HF, Haney, DN, Gabbay, KH and Gallop, PM. (1975). Further identification of the nature and linkage ofthe carbohydrate in Hemoglobin A1c Biochem Biophys Res Commun 67: 103-109 Encuesta Nacional de Salud y Nutrición 2006, Instituto Nacional de Salud Pública y Secretaría de Salud Executive summary: standards of medical ca re in diabetes-2010. Diabetes Ca re 2010; 33: 54-60 Hermoglobin A1 Fact Sheet, Michigan Diabetes Research and Training Center. University of Michigan Health System 2011: http:flwww.med.umich.edu/mdrtc/cores/ChemCore/hemoalc.htm Mathur, R. (2009) Hemoglobin A1 test. http:flwww.medicinenet.com/hemoglobin ale test/index.htm
81
RESULTADOS, DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
82
EXAMEN GENERAL DE ORINA
OBJETIVOS 1.
El alumno realizará el análisis general de una muestra de orina
2.
El alumno explicará la relevancia clínica del examen general de orina
GENERALIDADES El examen general de orina (EGO) se ha practicado con fines diagnósticos durante siglos y probablemente es el más antiguo de los procedimientos de laboratorio utilizados en Medicina. El estado nutricional del paciente, el estado de sus procesos metabólicos y la capacidad renal para manejar selectivamente las sustancias que recibe, constituyen los tres factores principales que determinan la composición de la orina Con la introducción de técnicas sencillas en las que se utilizan tiras impregnadas con ciertos reactivos, se ha facilitado la realización del EGO.
MATERIAL
1. Tubos de 13 X 100 mm 2. Probeta 3. Porta y cubreobjetos 4. Densímetro S. Microscopio 6. Pipeta graduada de 10 mL 7. Tiras reactivas 8. Muestra reciente de orina 9. centrífuga clínica
Obtención de la muestra. En condiciones ideales la obtención de la muestra de orina debe hacerse como sigue: en el hombre se limpia el glande y el meato urinario con un algodón humedecido con agua tibia. La mujer debe separar los labios vaginales para limpiar adecuadamente con el mismo material la región del orificio uretral con movimientos de adelante hacia atrás.
83
Una vez realizada la limpieza, se colecta la primera orina de la mañana en un recipiente limpio, seco y de ser posible estéril. Por el grado de concentración de esa orina es más probable detectar alguna anormalidad en su composición. En caso de que no se tenga disponible la primera orina de la mañana, conviene concentrar el sedimento por centrifugación secuencial de unas 3 alícuotas de 5 ml en el mismo tubo. De esta manera se aumenta la probabilidad de detectar alguna anomalfa que presente la muestra. Es necesario revisar la historia clínica del paciente a fin de constatar si recientemente ha ingerido medicamentos que pudieran afectar los resultados del análisis. Características macroscópicas normales de la orina y determinación de la densidad. las características macroscópicas normales de la orina son las siguientes:
Color
pajizo
Olor
sui generis
Aspecto
cristalino
Para determinar su densidad se transfieren 20 ml de orina a la probeta especial para medir dicho parámetro. Posteriormente se introduce cuidadosamente el densímetro y al tiempo que se suelta se hace girar con un movimiento rápido, con lo que se logra que flote libremente sin adherirse a las paredes de la probeta. Una vez que se estabiliza el densímetro, se toma la lectura registrando directamente el valor marcado por el nivel de la superficie de la orina en la escala localizada en el tallo del densímetro. Tiras reactivas. Diversos parámetros de importancia pueden analizarse a través de las tiras reactivas {Combur 10 test), para lo cual solo se introduce la tira reactiva en una muestra de orina fresca del paciente. la tira reactiva presenta varias zonas impregnadas con reactivos específicos para la detección de dichos parámetros. la lectura se hace por comparación de la tira humedecida con la orina, con un patrón de colores que aparece en el envase de las tiras.
84
Parámetros que se analizan mediante tiras reactivas y su resultado normal
Densidad
1.003 -1.030
pH
4.5-8.0
Leucocitos
O- 4 por campo
Nitritos
negativo
Proteínas
negativo
Glucosa
negativo
Cuerpos cetónicos
negativo
Urbilinógeno
negativo
Bilirrubina
negativo
Sangre oculta
negativo
Examen microscópico del sedimento urinario. El sedimento se obtiene por centrifugación de 5 ml de orina en un tubo de 13 x 100 mm, a 1800 r. p. m. durante 5-10 minutos. Se decanta la orina y se resuspende el sedimento en la gota residual que queda en el tubo. Posteriormente se transfiere una alícuota de la suspensión así preparada a un portaobjetos, colocando sobre ella un cubreobjetos. Enseguida se observa el sedimento al microscopio. Los elementos que pueden observarse en el sedimento son los siguientes:
1.
Eritrocitos.
2.
Neutrófilos.
3.
Células de los tú bulos renales.
4.
Epitelio vesical.
5.
Células escamosas.
6.
Cilindros hialinos.
85
7.
Cilindros granulados.
8.
Cilindros leucocitarios.
9.
Cilindros epiteliales tubulares.
10. Cilindros céreos. 11. Cilindros de eritrocitos. 12. Cristales de oxalato de calcio 13. Cristales de uratos 14. Cristales de fosfatos
Fotografías de algunos elementos que pueden encontrarse en el sedimento urinario:
Eritrocitos en la orina (tipo estrella por pérdida de LIC)
Cristales de oxalato de calcio
86
Cilindro leucocitario
Células escamosas
Cristales de fosfato triple
87
Cilindro granuloso
Cristales de ácido úrico IMPORTANCIA CLÍNICA
Color. Los cambios de color pueden ser consecuencia de la dieta, de fármacos o de diversos
trastornos metabólicos o infecciosos. Olor. En la diabetes sacarina (diabetes mellitus), la inanición y la deshidratación, la orina puede
presentar un olor frutal característico debido a la presencia de cuerpos cetónicos. En la infección de vías urinarias es común un olor fétido, especialmente si el agente etiológico es E. coli. Aspecto. La turbidez de la orina puede deberse a la presencia de cantidades anormales de
leucocitos, eritrocitos, bacterias, grasa o células de descamación, pudiendo denotar infección renal. Densidad. La disminución de la densidad (hipostenuria), esto es de 1.001 a 1.003, constituye un
signo que puede estar asociado con diabetes insípida central o nefrogénica, glomerulonefritis,
88
pielonefritis, insuficiencia renal, o ingestión excesiva de agua. El incremento de la densidad acompaña a los trastornas hepáticos, insuficiencia cardiaca congestiva, deshidratación y síndrome nefrótico (nefrosis). pH. Entre otras causas, el pH alcalino de la orina puede deberse a infección de las vías urinarias por Proteus (hidroliza la urea, con liberación de amoníaco), alcalosis metabólica, alcalosis respiratoria, etc. El pH ácido se observa en casos de tuberculosis renal, pirexia, fenilcetonuria, infección de vías urinarias por E. coli y en todas las formas de acidosis. Proteínas. Normalmente la orina no contiene cantidades demostrables de proteínas. En las enfermedades del riñón se pierden por la orina proteínas plasmáticas, particularmente albúmina. Por Jo tanto, la proteinuria sugiere la presencia de nefropatías como glomerulonefritis aguda o crónica, glomeruloesclerosis, nefrolitiasis, riñón poliquístico e insuficiencia renal aguda o crónica. También se presenta proteinuria en el mieloma múltiple, si bien en este caso no se trata de albúmina sino de una proteína de bajo peso molecular capaz de atravesar el filtro glomerular normal, conocida como proteína de Bence-Jones, que corresponde a las cadenas ligeras de las globulinas y, mismas que se sobreproducen en dicha patología. Azúcares. La glucosuria suele denotar la presencia de diabetes mellitus, pero también suele ser una consecuencia de la presencia de feocromocitoma, síndrome de Cushing o hipertensión intracraneal. La fructosuria, la galactosuria y la pentosuria denotan trastornos metabólicos hereditarios poco frecuentes. Sin embargo, después de la ingestión de pentosas (cerezas, uvas, ciruelas, etc.) o fructosa (diversas frutas y productos dulces industrializados), puede presentarse pentosuria o fructosuria de origen alimentario, debido a que el hígado no tiene la suficiente capacidad para metabolizar rápidamente estos azúcares. Los túbulos renales no reabsorben dichos monosacáridos, razón por la cual pueden excretarse por la orina. Cuerpos cetónicos. La aparición de estas sustancias en la orina constituye un signo característico de la diabetes mel/itus tipo 1, en la cual el aporte insuficiente de insulina permite la activación de la lipólisis en el tejido adiposo, el cual libera cantidades muy importantes de ácidos grasos de cadena larga que en buena medida convierte el hígado en cuerpos cetónicos. Los cuerpos cetónicos también pueden aparecer en la orina en la diabetes mellitus tipo 2, en la inanición y en situaciones que aumentan extraordinariamente las necesidades metabólicas, como es el caso de ejercicio intenso de larga duración, desnutrición, diarrea y vómito.
89
Nitritos. La mayoría de los gérmenes patógenos que pueden encontrarse en la orina reducen el
nitrato a nitrito, pudiendo determinarse de esta manera indirecta la presencia de gérmenes como
E. coli, Proteus, Klebsiella, Aerobacter, Salmonellas y Citrobacter. Bilirrubina. La bilirrubina libre o no conjugada es incapaz de atravesar la barrera glomerular del
riñón puesto que no se encuentra libre sino asociada con albúmina. Cuando la bilirrubina libre se conjuga en el hígado con glucuronato, se hace soluble en agua y entonces sí es capaz de atravesar el glomérulo puesto que se desplaza por sí misma en la sangre. La bilirrubina conjugada normalmente se excreta por la bilis, de manera que la orina normal no contiene bilirrubina. La bilirrubina conjugada se elimina por la orina en cuadros de ictericia obstructiva o hepatocelular, produciendo el signo de coluria (orina oscura). Por efecto de toxinas y ciertos fármacos también se encuentra bilirrubina en la orina debido al aumento de la presión intracanalicular por inflamación periportal o fibrosis y a causa de la inflamación de los hepatocitos. La bilirrubina puede aparecer en la orina en la hepatitis antes de que se manifieste ictericia. La positividad de bilirrubina en orina puede ser un indicio precoz de afección hepática. Urobilinógeno. La bilirrubina se reduce a mesobilirrubina, estercobilinógeno y urobilinógeno por
acción de las bacterias intestinales. Normalmente el urobilinógeno absorbido por el intestino se excreta por el hígado (circulación entero hepática), apareciendo únicamente 4 mg en la orina de 24 horas. La concentración aumentada de urobilinógeno en la orina puede deberse al deterioro de la función hepática como ocurre en la hepatitis viral, la cirrosis, la hepatitis tóxica, etc. o a la sobrecarga del hígado con bilirrubina indirecta, como ocurre en los síndromes hemolíticos (lcterus
neonatorum, ictericia transfusional, policitemia, paludismo, etc.). Sangre oculta. También conocida como hematuria microscópica, se trata de la presencia de
cantidades pequeñas de sangre en la orina, que pueden estar asociadas con afecciones renales o de vías urinarias. Por ejemplo puede tratarse de tuberculosis renal, glomerulonefritis o procesos inflamatorios de vías urinarias como la cistitis. La sangre oculta también puede ser expresión de procesos sistémicos como el dengue hemorrágico o la púrpura trombocitopénica, ya que en ambas condiciones se reduce el número de plaquetas y se facilita la hemorragia. Existen condiciones no patológicas en que se presenta sangre oculta en la orina, como puede ser el caso de las mujeres menstruantes, o después de realizar ejercicio físico intenso o incluso el baile intenso y prolongado.
90
Eritrocitos. Por alteraciones osmóticas, en la orina concentrada se observan dentados y en la
diluida se encuentran aumentados de volumen. Si existen en grandes cantidades se obtendrán pruebas positivas para proteína. Los eritrocitos se cuentan por campo microscópico de gran aumento o con hemocitómetro. La hematuria macro o microscópica puede ser ocasionada por ejercicio exhaustivo, glomerulonefritis, síndrome nefrótico, infecciones, cálculos, tumores de riñón, vejiga o uretra, etc. Es normal encontrar 0-3 eritrocitos por campo. Leucocitos (piocitos): estas células se encogen en la orina muy ácida; en la alcalina se observan
aumentados de volumen y adheridos unos con otros. Los leucocitos se cuentan por campo de gran aumento o colocando una pequeña gota de orina directamente en el hemocitómetro; se observan en grandes cantidades en presencia de cualquier infección urogenital. Es normal encontrar 0-4 leucocitos por campo Cilindros. Se originan por la precipitación de !as mucoproteínas en las paredes de los túbulos y
generalmente se encuentran en las nefropatías; se pueden identificar distintas clases de elementos y su significado se valorara de acuerdo con los probables sitios de origen: la enfermedad glomerular activa origina la formación de cilindros eritrocitarios en el extremo proximal de la nefrona; la inflamación tubular asociada con las enfermedades degenerativas pueden originar cilindros grasos, cilindros céreos, cilindros hialinos y granulosos de menor trascendencia; los túbulos colectores producen cilindros céreos o granulares anchos cuando el flujo urinario a través de ellos está reducido. Los cilindros se disuelven en la orina diluida o alcalina; se cuentan por campo de baja resolución. Otros componentes. Las levaduras y los parásitos en el sedimento urinario denotan infección de
las vías genitourinarias. El parásito más común en el sedimento es Trichomonas vagina/is, un protozoo flagelado que suele ocasionar vaginitis, uretritis y prostatovesiculitis (inflamación de la próstata y vesículas seminales). BIBLIOGRAFÍA
Balcells, A. La Clínico y el Laboratorio. Ed. Marín, 1989 González de Buitrago, J. M., E. Arillo Ferreiro, M. Rodríguez-Segade & A. Sánchez Pozo. Bioquímica Clínica. McGraw-Hill, 1998
91
RESULTADOS, DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
92
CREATI NI NA SÉRICA Y DEPURACIÓN OBJETIVOS
l.
El alumno cuantificará la depuración de creatinina en una persona sana.
2.
El alumno explicará la relevancia clínica de la cuantificación de creatinina plasmática y de la depuración de dicha sustancia
GENERALIDADES la creatinina es una sustancia de bajo peso molecular que filtra libremente por el glomérulo. Se forma en el músculo a partir de la fosfocreatina, la cual reacciona con ADP para formar ATP en el microambiente de las sarcómeras. Entre 1 y 2% de la fosfocreatina se transforma cada día en creatinina +fosfato sin que en ello participe ninguna enzima. la creatinina, que es un producto de desecho, pasa a la sangre y se excreta por la vía renal. la cantidad de creatinina que se produce cada día, y por lo tanto su concentración sanguínea, es muy constante y depende de la masa muscular de cada persona. En la práctica, la determinación de la concentración plasmática de creatinina es la prueba simple más utilizada para valorar la función glomerular. Como se mencionó antes, la concentración de creatinina en el plasma se encuentra relacionada con la masa muscular, por Jo cual, un mismo valor puede tener significados diferentes en cuanto a la función glomerular en personas con diferente masa muscular. Debe tenerse cuidado al interpretar los valores encontrados de creatinina plasmática pues la velocidad de filtración glomerular puede estar muy disminuida sin que la creatinina plasmática salga del intervalo normal. De esta manera, una concentración de creatinina plasmática dentro del intervalo normal no significa necesariamente una función glomerular normal. Sin embargo, un valor por arriba del intervalo normal generalmente indica alteración de la función renal. Si un paciente registra un incremento de la concentración sérica de creatinina respecto a determinaciones previas de él mismo, puede significar alteración de la VFG, aunque ninguno de los valores se halle fuera del intervalo normal. En general, en los pacientes en los que se ha documentado la enfermedad renal, es suficiente la determinación de la creatinina sérica para su seguimiento, sin necesidad de cuantificar su depuración. la velocidad de filtración glomerular (VFG) es un importante parámetro de la función renal y consiste en el volumen de plasma que pasa en determinado tiempo a través de los glomérulos renales. la VFG depende de tres factores: l. la presión neta que se ejerce sobre la membrana 93
glomerular, 2. el estado físico de la membrana, y 3. el área de la membrana glomerular, que a su vez depende del número de glomérulos funcionales. Así, en ausencia de alteraciones significativas en la presión sanguínea y en la estructura de la membrana glomerular, la VFG es proporcional al número de glomérulos funcionales. Para valorar la VFG se utiliza el procedimiento conocido como depuración. La depuración de una sustancia presente en el plasma sanguíneo es una medida de la eficiencia con la que los riñones la excretan y suele definirse como el volumen plasmático que se depura por completo de tal sustancia cada minuto por efecto de la actividad renal. Evidentemente, la depuración es un dato calculado, ya que la función renal disminuye gradualmente la concentración de los so lutos en la totalidad del volumen plasmático. Por ejemplo, si una sustancia se encuentra en el plasma a una concentración de 7 mg/mL y en la orina producida durante un minuto aparecen 14 mg, la depuración será de 2 mL/min. La depuración renal de una sustancia es directamente proporcional a la concentración de dicha sustancia en la orina (mientras mayor concentración tenga la orina significa que más se depura) e inversamente proporcional a su concentración en la sangre (mientras más concentración plasmática, menos se depura). La depuración se plantea matemáticamente mediante la siguiente fórmula:
e, Donde
e, es
= U,V/P,
la depuración de la sustancia X (se acostumbra utilizar la letra
e
debido a que el
término depuración corresponde en inglés a clearance), U, es la concentración de X en la orina colectada (U por urine, orina en inglés), P, es la concentración de X en el plasma y V es el volumen de orina que se produce por minuto (mL/min). Aplicando a U, y P, las mismas unidades (mg/dL, g/L, etc.), la depuración adquiere las unidades de V, es decir mL/min. Por ejemplo, si U, es 70 mg/dL, P, es 1 mg/dL y V es 1.4 mL/min, la depuración renal seria igual a 98 mL/min. La creatinina satisface en general las condiciones necesarias para medir la depuración renal, ofreciendo una buena aproximación de la VFG. A pesar de las ventajas que en principio tiene la depuración de creatinina sobre su sola determinación sérica, se trata de un procedimiento que, por requerir la recolección de orina de 24 hrs, no es fácil de llevar a cabo con toda confiabilidad pues los pacientes no siempre recolectan todas las emisiones de orina. Por otra parte, como en cualquier otra determinación analítica, existe un margen de error. De hecho, la variabilidad que se obtiene en la depuración de creatinina
94
en pacientes bajo condiciones ideales puede ser de hasta el 10%, considerándose que en condiciones ordinarias puede ser de hasta 30%. Por lo anterior, la depuración solo se practica en casos en que se encuentre claramente indicada, incluyendo la valoración de donadores potenciales de riñón, el estudio de pacientes con alteraciones menores de la función renal, y para el cálculo de las dosis de medicamentos potencialmente tóxicos que se eliminan por vía renal, como ocurre con los aminoglucósidos (antibióticos) y la digoxina (glucósido cardiotónico).
IMPORTANCIA CLÍNICA
El incremento de la concentración sérica de creatinina o la disminución de su depuración se presentan en una amplia serie de patologías que afectan al funcionamiento renal. Entre otros, se encuentran las siguientes: Perfusión renal insuficiente. Esta condición puede ser secundaria a disminución de la
presión sanguínea, pérdida de líquido o estenosis de la arteria renal. Patologías renales. Alteraciones en las cuales va disminuyendo el número de nefronas
funcionales, particularmente los procesos crónicos. Incremento de presión tubular. Se trata de patologías de carácter obstructivo que provocan el
aumento de la presión intratubular, como es el caso de la obstrucción de vías urinarias secundaria a hiperplasia prostática.
Durante el embarazo aumenta la VFG, lo cual comúnmente supera al incremento en la producción de creatinina que también ocurre en dicha situación, por lo cual disminuye la concentración sérica de creatinina. PROCEDIMIENTO (Randox) Cuantificación de creatinina
Fundamento: al reaccionar la creatinina con picrato alcalino se produce un complejo de color anaranjado, en cantidad directamente proporcional a la de creatinina. Adaptando la reacción a un procedimiento cinético se logra un mayor grado de especificidad debido a que la creatinina reacciona con el picrato alcalino con mayor rapidez que otras sustancias que también son reactivas.
95
De esta manera, midiendo el incremento de color (absorbancia) en un período breve de tiempo al iniciar la reacción, se estará valorando principalmente la creatinina, con poca influencia de los demás cromógenos inespecíficos.
Pipetear en cubetas:
Patrón
100 llL
Suero
100 llL
Reactivo de trabajo
1.0 mL
1.0 mL
Se trabaja la muestra y el patrón uno a la vez. Mezclar y a los 30 segundos medir la absorbancia A 1 de la muestra y del patrón a 492 nm frente al aire. Exactamente 2 minutos después leer la absorbancia A2 de
la muestra y del patrón. Para la cuantificación de creatinina en orina,
debe diluirse ésta 1 a 50 con agua bidestilada.
CÁLCULO Suero /lA
m""'"
M
''"ó"
(/lA
Orina =A,- A1 de la muestra = A2 - A1 del patrón
m,.,,,/!lA '"'óo) x 2 = _
mg/dL Creatinina
/lA
m""'"
/lA
'"'ó"
=A,- A, de la muestra = A2 - A, del patrón
(/lA m,.,,,/!lA
pwóo) x 100 = _
VALORES DE REFERENCIA
SUERO
ORINA
HOMBRES
0.6-1.1 mg/dl
1 ~1.5 g/24 Hrs.
MUJERES
O. S -0.9 mg/dl
1-1.5 g/24 Hrs.
96
mg/dL creatinina
Depuración de creatinina
1.
Recolectar orina de 24 horas de acuerdo con lo siguiente: vaciar la vejiga al levantarse por la mañana (p. ej. 8:00AM) y desechar la orina. Recolectar en un recipiente apropiado toda la orina que se produzca durante el día y la noche. A la misma hora del siguiente día, volver a vaciar la vejiga pero esta vez añadiéndola al recipiente. Llevar la orina al laboratorio lo más pronto posible.
2.
Tomar una muestra de sangre del paciente al entregar la orina. Dejar coagular y separar el suero
3.
Medir con la mayor exactitud el volumen de orina de 24 hrs.
4.
Cuantificar la creatinina en la muestra de suero y en la orina
S.
Aplicar la fórmula para calcular la depuración
VALORES DE REFERENCIA
80-130 ml/minuto BIBLIOGRAFÍA
Braunwald, E., A. S. Fauci, D. L. Kasper, S. L. Hauser, D. L. Langa and J. L. Jameson (Editors). Harrison's Principies of Interna/ Medicine, 15th edition, McGraw Hill,2001
Devlin, T. M. (Editor) Textbook of Biochemistry with clinical correlations, 5th edition. Wiley-Liss, 2002 Guyton, A. C. and J. E. Hall. Textbook of Medica/ Physio/ogy, 10th edition, W. B. Saunders Company, 2000 Marshall, W. C. and S. K. Bangert. Clinical Chemistry. 5th edition, Mosby, 2004 Gaw, A., R. A. Cowan, D.St..J. O'Reilly, M. J. Stewart and J. Shepherd. C/inical Biochemistry, an illustrated colar text, 2"' edition, Churchill Livingston, 1999.
97
RESULTADOS, DISCUCIÓN Y CONCLUSIONES
98
HEMATOCRITO, HEMOGLOBINA Y CONCENTRACIÓN CELULAR MEDIA DE HEMOGLOBINA
OBJETIVOS
1.
El alumno determinará el hematocrito, la concentración de hemoglobina y la concentración celular media de hemoglobina en una muestra de sangre.
2.
El alumno explicará la relevancia clínica del hematocrito, de la concentración de hemoglobina en sangre y de la concentración celular media de hemoglobina
GENERALIDADES
El hematocrito es un parámetro hematológico fundamental que corresponde al volumen porcentual que representa el paquete eritrocítico en la sangre completa. En el hombre y la mujer adultos los valores de referencia son 40 a 54% y 34 a 47%, respectivamente. En los recién nacidos el hematocrito es relativamente muy alto (aproximadamente 56%), decreciendo gradualmente hasta un valor cercano a 35% al primer año de vida. Posteriormente se eleva paulatinamente durante la infancia hasta los valores señalados para el adulto. Debe tomarse en cuenta que el hematocrito es un parámetro que varía en función de la altitud del lugar donde reside la persona, de tal manera que a mayor altitud se registra mayor valor del hematocrito. La hemoglobina es una proteína intraeritrocitaria cuya principal función es el transporte de oxígeno de los pulmones a los tejidos. La liberación de oxígeno a partir de la oxihemoglobina es un proceso influido por varios factores, como son la concentración eritrocítica de 2, 3bisfosfoglicerato, el pH y la concentración de dióxido de carbono del ambiente tisular.
La hemoglobina se sintetiza en las células precursoras de los eritrocitos, iniciándose en los normoblastos basófilos y terminando en los reticulocitos. La síntesis del grupo hemo ocurre en
dichas células a partir de succiniiCoA (intermediario del ciclo de Krebs) y de glicina, generándose sucesivamente 6-aminolevulinato, porfobilinógeno, uroporfirinogéno 111, coproporfirinógono 111, protoporfirinógeno IX, protoporfirina IX y hemo. Este último es un tetrapirrol asociado con un 2
átomo de hierro 11 (Fe+ ) central. Cada grupo hemo se une a una cadena proteínica u o
p formándose
luego la hemoglobina por la
asociación de 4 cadenas, 2 de cada tipo, de tal manera que la molécula de hemoglobina contiene 4 grupos hemo y es capaz de portar 4 moléculas de oxígeno simultáneamente.
99
La oxihemoglobina aporta oxígeno suficiente a los tejidos para que se lleve a cabo la oxidación de los combustibles biológicos, proceso normalmente acoplado a la producción de moléculas de alta energía, fundamentalmente el ATP. La concentración celular media de hemoglobina (CCMH) se calcula dividiendo la concentración de hemoglobina (en g/dL) entre el hematocrito y multiplicando el resultado por 100. Como puede apreciarse, este cálculo corresponde al % de hemoglobina en el paquete celular rojo, es decir el número de gramos de hemoglobina que estarían presentes en 100 mL de paquete eritrocitario y equivale al% de hemoglobina dentro de cada eritrocito. La CCMH normal es de aproximadamente 35%. Se consideran hipocromas las anemias cuya CCMH es inferior a 30%.
IMPORTANCIA CLÍNICA Las anemias constituyen la manifestación clínica de diversas alteraciones, las cuales pueden agruparse como sigue: Insuficiencia de la médula ósea. Se producen cantidades bajas de eritrocitos debido a deficiencias de la eritropoyesis, alteraciones endocrinas, factores nutricio na les, etc. Por ejemplo, la deficiencia de hierro produce anemia hipocrómica (CCMH disminuida) y microcítica (tamaño eritrocítico menor al normal); la deficiencia de vitamina B12 y/o de folato, produce anemia megaloblástica (abundancia de células grandes precursoras de los eritrocitos). Insuficiencia renal crónica. En la fase terminal de esta patología el riñón deja de producir eritropoyetina y en consecuencia se presenta anemia normocítica y normocrómica. Hemólisis aumentada.
La anemia
hemolítica puede deberse a factores genéticamente
determinados, como ocurre en la anemia de células falciformes, patología en la que se sintetiza una hemoglobina alterada en su estructura (cambio de un residuo de glutamato por uno de valina en cierta posición de las cadenas
p,
alteración que produce precipitación de la hemoglobina
cuando la presión parcial de oxígeno es baja, lo cual provoca que los eritrocitos adquieran una rigidez tal que se rompen con facilidad al transitar por capilares muy estrechos. La hemólisis aumentada puede deberse también a la presencia de anticuerpos contra los eritrocitos, como ocurre en la eritroblastosis fetal, enfermedad en la cual la madre Rh- produce anticuerpos contra los eritrocitos del feto Rh +. La anemia hemolítica puede deberse también a infecciones como el paludismo, proceso en el que el agente infeccioso, Plasmodium, lleva a cabo su ciclo vital en el interior de los eritrocitos, lisándolos al cabo del mismo.
100
Policitemia. Es el aumento de la cantidad de eritrocitos. Ocurre naturalmente cuando la
disponibilidad de oxígeno es limitada, como mecanismo compensatorio. En adultos mayores puede presentarse como resultado de la pérdida del control sobre la médula ósea. La policitemia puede ser secundaria a otros procesos que cursan con hipoxia tisular, como la insuficiencia respiratoria y las cardiopatías congénitas. La llamada policitemia vera consiste en el incremento de células sanguíneas, principalmente eritrocitos, debida a una producción excesiva de células por la médula ósea. Su causa no se conoce pero se sabe que afecta principalmente a hombres con edad superior a los 40 años
PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR EL HEMATOCRITO
Para determinar el hematocrito se requiere un tubo graduado especial conocido como tubo de Wintrobe, el cual está hecho de vidrio grueso que soporta bien la centrifugación. El tubo se carga hasta la graduación superior (10) con sangre tratada con anticoagulante, utilizando una pipeta Pasteur de punta larga, la cual, una vez cargada con sangre se introduce hasta el fonda del tubo de Wintrobe y entonces se descarga gradualmente conforme se va sacando del tubo, minimizando el riesgo de formar burbujas. En caso de que se haya formado una burbuja, debe sacarse con golpes suaves dados al tubo con un dedo. Una vez cargado debidamente el tubo de Wintrobe, se centrifuga durante 30 minutos a 3000 r. p. m. y se toma la lectura directamente de la graduación del tubo. a nivel de la línea que separa el paquete rojo del blanco . PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR LA CONCENTRACIÓN DE HEMOGLOBINA (Randox).
Fundamento: la oxidación de fa hemoglobina con ferricianuro de potasio en solución alcalina forma metahemoglobina. Ésta reacciona con cianuro de potasio y forma cianometahemoglobina, que es un compuesto colorido cuya intensidad es directamente proporcional a la concentración de hemoglobina. 1.
Transferir 5 mL de solución de drabkin a un tubo de 13 x 100mm.
2.
Transferir 20 11L de sangre con anticoagulante a la solución anterior.
3.
Mezclar bien y dejar reposar al menos durante 3 minutos a temperatura ambiente.
4.
Medir la absorbancia a 540 nm de la muestra frente a agua destilada. El color es estable durante varias horas.
S.
Determinar la concentración de hemoglobina multiplicando la absorbancia por el factor 36.77. El resultado se reporta en g/dL
101
VALORES DE REFERENCIA Hombres Adultos:
13 -18 g/dl
Mujeres adultas:
11-16 g/dl
Recién nacidos:
14 -23 g/dl
NOTA: Puede haber variaciones fuera de los intervalos indicados por efecto de la edad, la raza, el ejercicio, la altitud y la estación del año. BIBLIOGRAFÍA Bennington, Fouty & Hougie. El Laboratorio en el Diagnóstico Clínico. La Prensa Medica Mexicana, 1977, 2'. Ed. González de Buitrago, J. M., E. Arillo Ferreiro, M. Rodríguez-Segade & A. Sánchez Pozo. Bioquímica Clínica. McGraw-Hill, 1998
Voet, D. & J.Voet. Bioquímica. Ed. Omega, 1992
102
RESULTADOS, DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES.
103
IDENTIFICACIÓN DE GRUPOS SANGUÍNEOS
OBJETIVOS
l.
El alumno identificará el grupo sanguíneos ABO y el carácter Rh de una muestra de sangre
2.
El alumno explicará la relevancia clínica de los grupos sanguíneos ABO y del carácter Rh
GENERALIDADES
Las sustancias que determinan los grupos sanguíneos son componentes de la membrana de los eritrocitos (y en muchos casos de otros tipos celulares) cuya variedad se debe a polimorfismos genéticos. En el hombre se han reconocido más de 200 variantes genéticas de antígenos de los eritrocitos, producidas por al menos 20 sistemas de grupos sanguíneos, pudiendo haber en cada sistema dos o más fenotipos distintos. En el sistema ABO, por ejemplo, existen cuatro fenotipos (A, B, AB Y 0), que corresponden a cuatro grupos sanguíneos en dicho sistema. El sistema ABO es de gran importancia por su alto poder de inmunogenicidad. Los individuos pertenecientes al grupo A poseen el antígeno A en sus células rojas, los del grupo B poseen el antígeno B, los del grupo AB poseen ambos antígenos y los del grupo O no poseen ninguno de los dos. Una característica notable de los grupos ABO es la relación recíproca entre los antígenos presentes en los eritrocitos y los anticuerpos que se encuentran en el plasma de los mismos individuos, de acuerdo con la siguiente tabla: GRUPO SANGUÍNEO (FENOTIPO)
GENOTIPO 0/0
ANTfGENOS EN ERITROCITOS NINGUNO
ANTICUERPOS EN EL PLASMA ANTI-A, ANTI-8
o
A/ A
A
ANTI-B
A/0
A
ANTI-B
B/B
B
ANTI-A
B/0
B
ANTI-A
A/B
A, B
NINGUNO
A
B AB
La razón de esta relación reciproca no se conoce pero se cree que la formación de anticuerpos anti-A y anti-B puede ser la respuesta al contacto con las sustancias A y B que se encuentran de manera natural en el ambiente. Las especificidades antigénicas de estos grupos sanguíneos se deben a variaciones en el azúcar terminal del oligosacárido de cierto glicolípido membrana!. En el caso del grupo A, el azúcar
104
terminal del oligosacárido es Nacetilgalactosamina, mientras que en el grupo Bes O-galactosa. La presencia de uno u otro azúcar en esa posición depende de que exista la N-acetilgalactosamina transferasa o la O-galactosa transferasa, lo cual a su vez depende de que un determinado locus presente el alelo A o el alelo B, respectivamente. Cuando la información del gen no produce ninguna de las dos enzimas, dicho /ocus presenta el alelo O, y entonces el oligosacárido no tiene ni N-acetilgalactosamina ni O-galactosa. El componente membrana! correspondiente al alelo O se denomina sustancia H, de manera tal que si a la sustancia H se adiciona N-acetilgalactosamina, resulta el grupo A; si se le adiciona O-galactosa, resulta el grupo B, y si no se le adiciona ninguno de los dos azúcares, resulta el grupo O. En la población caucásica, aproximadamente 40-45% de los individuos tienen dos copias del alelo O, otro 40-45% tienen al menos una copia del alelo A. EllO% tiene al menos una copia del alelo By el 5% tiene una copia del alelo A y una del alelo B. Otro grupo sanguíneo de importancia comparable con el del sistema ABO es el factor Rh (por haber sido descubierto en los monos rhesus). Genéticamente, los grupos Rh son complejos, pero de una manera introductoria puede considerarse que el sistema consta de dos alelos, O y d, con tres posibles genotipos, DIO, Dld y d/d. D/D y 0/d son fenotípicamente Rh positivos, mientras que
d/d es fenotípicamente Rh negativo. A diferencia de lo que ocurre con el sistema ABO, en el sistema Rh no se encuentran de manera natural anticuerpos anti-Rh en personas Rh negativas, aunque en determinadas condiciones sí se forman dichos anticuerpos. Los anticuerpos anti-Rh también se conocen como anti-0 IMPORTANCIA CLÍNICA
La importancia de los grupos sanguíneos en general tiene relación con el proceso de transfusión pues considerando la posible presencia de anticuerpos en la sangre del receptor puede propiciarse la generación de una reacción inmunológica si no se tiene el cuidado de ensayar previamente la compatibilidad de la sangre del donante con la del receptor. El individuo con sangre tipo A puede recibir eritrocitos de tipo A u O, mientras que el individuo con sangre tipo B puede recibir eritrocitos de tipo Bu O. En cambio, quien tiene tipo AB puede recibir eritrocitos de cualquier tipo y quien es tipo O puede recibir solo eritrocitos de tipo O. La compatibilidad o incompatibilidad de una combinación determinada se halla en función de la presencia o ausencia de anticuerpos en la sangre del receptor, según indica la tabla anteriormente presentada.
105
La transfusión de eritrocitos incompatibles (por ejemplo tipo B a un receptor tipo A o tipo O) provoca una reacción de aglutinación de los eritrocitos transfundidos, activación del complemento y hemólisis intravascular. La reacción a la transfusión se manifiesta clínicamente por fiebre, hipotensión, dolor en la región inferior de la espalda, sensación de compresión en el pecho, náusea y vómito. La destrucción de los eritrocitos puede provocar choque circulatorio y la liberación del contenido de dichas células, principalmente la hemoglobina, la cual puede producir necrosis tubular aguda. Antes de practicar la transfusión deben llevarse a cabo las pruebas cruzadas para asegurar la compatibilidad. En la llamada prueba mayor, se mezclan dos gotas de suero del receptor con una gota de suspensión de eritrocitos lavados del donador y en la prueba menor se mezclan dos gotas de plasma o suero del donador con una gota de eritrocitos del receptor. La ausencia de aglutinación indica compatibilidad. La enfermedad hemolítica del recién nacido (EHRN) aparece en neonatos cuyas madres fueron sensibilizadas por antígenos de los eritrocitos fetales. Los anticuerpos que en respuesta produce la madre, atraviesan la placenta y reaccionan con los eritrocitos fetales, causando su destrucción. La sensibilización de la madre Rh negativa a las células Rh positivas del producto ocurre usualmente durante el nacimiento del primer hijo Rh positivo, cuando algunas células rojas del producto se escapan a través de la placenta hacia la sangre materna, donde son reconocidas por el aparato inmunocompetente de la madre. Debido a esto, el primer hijo Rh positivo usualmente no resulta afectado, pero a partir del segundo hijo Rh positivo el riesgo es creciente de ser afectado debido a la inmunización reiterada de la madre. Después de que nace un hijo Rh positivo de una madre Rh negativa, puede administrarse a está anticuerpos anti-Rh, lo cual permitirá eliminar los eritrocitos fetales que en subsiguientes embarazos pudieran pasar a la sangre materna, antes de que activen la producción cada vez mayor de anticuerpos. Esto ha permitido una disminución de la frecuencia con la que se presenta la EHRN. También puede presentarse incompatibilidad cuando una madre tipo O tiene un producto A o B, sin embargo, en la gran mayoría de los casos no aparece la eritroblastosis fetal, presentándose un cuadro más bien benigno que se ha atribuido a la presencia del antígeno A o B en la placenta, con lo que se neutralizan los anticuerpos maternos.
106
PROCEDIMIENTO l.
Se obtiene una muestra de sangre mediante una punción con lanceta del dedo pulgar
2.
Se colocan tres gotas de sangre en diferentes espacios de una placa de aglutinación
3.
A cada gota de sangre se agrega una gota de uno de los sueros anti-A, anti-B o anti-D
4.
En cada caso se mezclan las muestras con un palillo durante aproximadamente un minuto
5.
La reacción positiva se manifiesta por aglutinación observable a ojo. Si en el ensayo del sistema ABO se obtiene reacción positiva solamente con anti-A, el grupo de la sangre es A; si solo se obtiene aglutinación con anti-B, se trata de sangre tipo B; si se obtiene reacción positiva con ambos antisueros, se trata de sangre tipo AB y si en ambos casos la reacción es negativa, el tipo de sangre es O.
6.
En lo concerniente al sistema Rh, la reacción positiva con anti-D indica que la sangre es Rh positiva y la no aglutinación de los eritrocitos implica que el tipo de sangre es Rh negativo.
BLIBLIOGRAFÍA Meissenberg, G. and W. H. Simmons. Principies of Medica/ Biochemistry. Mosby, 1998 Roith, 1, Brostoff, J. And Male, D. lmmuno/ogy, 3'' edition. Mosby, 1993 Thompson, J. S. and Thompson, M. W., Genetics in Medicine, 2"' edition, W. B. Saunders Co., 1973 Bonilla-Zavala, R. (2005) Pruebas pretransfusionales. Rev Med lnst Mex Seguro Soc 43: 13-15 Incompatibilidad feto-materna por el grupo sanguíneo ABO: http://www.pruebadepaternidad.info/?p=197
107
RESULTADOS, DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES.
108
RENCUENTO PLAQUETARIO
OBJETIVOS El alumno determinará la concentración de plaquetas en una muestra de sangre El alumno explicará el contexto clínico relevante del recuento plaquetario GENERALIDADES El sistema hemostático del organismo humano tiene como función evitar la pérdida de sangre mediante la formación de un coágulo que ocluye la solución de continuidad, preservando el estado líquido dentro de los vasos sanguíneos. Los principales componentes del sistema hemostático son: 1.
Plaquetas
2.
Componente endotelial vascular
3.
Proteínas plasmáticas, tanto las que participan en la coagulación como las que actúan en la fibrinólisis.
Estos tres componentes interrelacionan entre sí para generar el efecto hemostático. La pared interna de los vasos sanguíneos se encuentra recubierta por células endoteliales y cuando éstas se lesionan, dejan expuestas fibras de colágena y otras sustancias del medio subyacente, a las cuales se adhieren algunas plaquetas que entonces se activan e inducen la agregación plaquetaria, que termina formando un tapón primario; por otra parte, la solución de continuidad permite la activación de las vías de la coagulación (extrínseca, por exposición al factor tisular, e intrínseca, por la exposición de una superficie extraña, de manera relevante la colágena), a lo que sigue la cascada de reacciones que conduce a la formación del coágulo. Plaquetas. También llamadas trombocitos, son células enucleadas en forma discoidal de 2 a 4 ¡.¡m de diámetro, derivadas de los megacariocitos. Su vida promedio es de aproximadamente 7 .S días y su concentración normal en la sangre oscila entre 150,000 y 400,000/mm 3 • Normalmente, del total de plaquetas presentes en el organismo, 2/3 se encuentran circulando y 1/3 se encuentra en el bazo. La participación de las plaquetas consta de cuatro fases: 1.
Adhesión de las plaquetas a superficies extrañas que quedan expuestas por efecto de la lesión endotelial. Este proceso depende de la presencia de glucoproteínas membranales a las que se enlazan los trombocitos y es fundamental para contener la hemorragia.
109
2.
Luego de la adhesión de las plaquetas, su activación produce que se contraigan y formen estructuras similares a seudópodos, concentrando sus compuestos químicos en el centro de ellos.
3.
Liberación de gránulos al medio inmediato
4.
Los productos liberados (ADP, serotonina, trombina, etc.) estimulan la agregación plaquetaria y la coagulación.
Endotelio vascular. Normalmente libera óxido nítrico (vasodilatador) y prostaglandina PGI 2
(antiagregante plaquetario), que hacen que el flujo sanguíneo se mantenga normal. Las proteínas adhesivas fibronectina, vitronectina, tromboespondina y el factor Von Willebrand, también se elaboran en este sitio y participan en el proceso de agregación plaquetaria. Al continuar el proceso de la coagulación, las células endoteliales intactas que se encuentran en las proximidades del sitio lesionado limitan la formación de fibrina a partir de fibrinógeno, activando a los inhibidores de la trombina. Proteínas plasmáticas. Entre ellas se encuentran las proteínas necesarias para los procesos de coagulación y fibrinólisis. La mayor parte de las que participan en la hemostasia, son
glucoproteínas que se activan secuencialmente hasta llegar a la reacción en que el fibrinógeno se transforma en fibrina, proteína activa que al polimerizarse forma redes insolubles en donde quedan atrapadas las plaquetas y otros elementos formes de la sangre. El recuento plaquetario es una prueba importante, ya que permite detectar la trombocitopenia (disminución del número de plaquetas), la cual es la enfermedad hemorrágica más común. Además, los recuentos precisos son de suma importancia para seguir el curso de enfermedades relacionadas con la médula ósea como son la leucemia y la anemia aplástica. Esta determinación es también un valioso auxiliar para la evaluación de la terapéutica con anticoagulantes, fármacos tóxicos, quimioterapia y radioterapia.
IMPORTANCIA CLÍNICA EL AUMENTO DEL NÚMERO DE PLAQUETAS PUEDE SER DE DOS TIPOS:
A. TROMBOCITOSIS. En esta condición el número de plaquetas no es superior a 800,000/mm'. El aumento es pasajero, asintomático y de escasa importancia clínica. Solo valores superiores por lo menos en 100,000/mm' al límite superior de las cifras normales suelen clasificarse dentro de este grupo. Se presenta en los siguientes casos y situaciones:
110
l.
Esfuerzo corporal intenso, ascenso a grandes alturas y estado post-parto
2.
Anemia post-hemorrágica
3.
Infecciones agudas como escarlatina, fiebre reumática, cólera y algunas septicemias.
4.
Período posoperatorio de intervenciones quirúrgicas importantes
5.
Esplenectomía. En este caso puede presentarse un incremento importante de las
plaquetas. 6.
Adrenalina. Por administración de la hormona. El efecto dura una hora.
7.
Leucemia mielógena crónica.
B. TROMBOCITEMIA. Presenta cifras de hasta millones de plaquetas/mm 3 en forma permanente y se clasifica como sigue: l.
Esencial o primaria, llamada también trombocitemia hemorrágica, se acompañan de
trombosis. Es una enfermedad rara. 2.
Secundaria. Como consecuencia de enfermedades por lo general mieloproliferativas,
como policitemia vera, mieloesclerosis (enfermedad evolutiva crónica en que la médula ósea es reemplazada por tejido fibroso y la sangre se produce en el hígado y el bazo en lugar de la médula ósea. Se caracteriza por agrandamiento del bazo y anemia evolutiva, carcinosis (tendencia al desarrollo de cáncer) medular o de colon, entre otras.
DISMINUCIÓN DE NÚMERO DE PLAQUETAS TROMBOCITOPENIA O TROMBOPENIA. Así se clasifica la deficiencia de plaquetas cuando los
recuentos plaquetarios son menores a 150,000/mm 3, aunque únicamente cifras inferiores a 3
30,000/mm cursan con manifestaciones hemorrágicas. Se presenta en los siguientes casos y situaciones:
l.
Púrpura trobocitopénica idiopática
2.
Anemia perniciosa, aplástica (disminución de células sanguíneas por hipocelularidad de la
médula ósea) 3.
Neumonías
4.
Alergias
5.
Quimioterapia contra el cáncer
6.
Lesiones de la médula ósea
111
7.
Medicamentos. Ciertos medicamentos administrados en altas dosis y por tiempos
prolongados:
quinidina
(antiarrítmico),
sulfas
(antibacteriano),
clorpropamida
(hipoglucemiante), clorotiazida (diurético), etc. producen trombocitopenia.
MATERIAL
l. Sangre venosa (1 ml)
2.
Solución de oxalato de amonio al 1% y azul de metileno (al preparar la solución se añaden 20 gotas de azul de metileno a cada 100 ml de la solución de oxalato de amonio y se filtra la solución).
3.
Anticoagulante EDTA
4.
Cámara de recuento celular (hemocitómetro) con cubreobjetos
5.
Caja de Petri
6.
Microscopio
7.
Agitador tipo vórtex
8.
Papel filtro
PROCEDIMIENTO
l.
Verter la sangre extraída en un tubo de ensayo que contenga una gota de anticoagulante y mezclar suavemente por inversión.
2.
Inmediatamente después, medir 20 ¡.tl de sangre con una micropipeta apropiada
3.
Transferir la alícuota de sangre a un tubo que contenga 4.0 ml de oxalato de amonio y azul de metileno
4.
Agitar durante 70 segundos con el vórtex a alta velocidad
5.
Colocar el cubreobjetos sobre el hemocitómetro
6.
Cargar una micropipeta con la preparación y depositar una gota en la orilla del cubreobjetos, a nivel de una de las hendiduras del hemocitómetro.
7.
Colocar el hemocitómetro en una caja de Petri cubriéndolo con la tapa en la que, previamente, se habrá colocado un papel filtro húmedo. Dejar en reposo durante 10 minutos.
8.
Enfocar la cuadrícula con el seco débil, luego con el seco fuerte e identificar las plaquetas. Una vez identificadas, hacer el recuento de las plaquetas utilizando la cuadrícula central
112
del hemocitómetro. Dicha cuadrícula consta de 25 cuadros con una distribución de 5 x 5. Cada uno de dichos cuadros contiene a su vez 16 subcuadros (4 x 4) 9.
El conteo debe hacerse con todo cuidado, detectando las plaquetas en cada uno de los 16 subcuadros de cada uno de los 25 cuadros.
10. La cifra obtenida se multiplica por 2000 y el resultado corresponde al número de plaquetas por mm
3
•
Hemocitómetro o cámara de Newbauer
Cargando el hemocitómetro
Cuadrícula del hemocitómetro
113
VALORES DE REFERENCIA
150,000- 400,000/mm 3
BIBLIOGRAFÍA Balcells, A, La Clínica y el Laboratorio. Ed. Marín, 1989 González de Buitrago, J. M., E. Arillo Ferreiro, M. Rodíguez-Segade & A. Sánchez Pozo. Bioquímica
Clínica. McGraw-Hill, 1998 Devlin, T. M. (Editor) Textbook of Biochemistry with clinical correlotions,
2002 RESULTADOS, DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
114
s'h
edition. Wiley-Liss,
BILIRRUBINAS SÉ RICAS
OBJETIVOS 1.
El alumno determinará las concentraciones de bilirrubina directa, indirecta y total en una muestra de suero sanguíneo
2.
El alumno explicará los contextos clínicos en que es relevante la cuantificación de bilirrubina
GENERALIDADES
La bilirrubina es un compuesto de color amarillo anaranjado cuando se encuentra en solución, originándose en un 80 a 85% a partir del catabolismo del grupo hemo de la hemoglobina y el resto a partir del catabolismo del grupo hemo que forma parte de otras proteínas como la mioglobina, los citocromos, la cata lasa, etc. Los
eritrocitos
senescentes
son
captados
por
el
sistema
reticuloendotelial,
presente
fundamentalmente en el bazo y en el hígado. Al catabolizarse la hemoglobina liberada de los eritrocitos, se producen aminoácidos libres a partir de la parte proteínica de la hemoglobina (globina), y bilirrubina a partir de la fracción no proteínica (hemo). La bilirrubina producida por el sistema reticuloendotelial se conoce como bilirrubina indirecta o no conjugada y es una sustancia marcadamente insoluble en agua, asociándose con albúmina a fin de ser transportada por la sangre. Al pasar los complejos de bilirrubina indirecta y albúmina por el hígado, los hepatocitos captan la bilirrubina indirecta. En el interior de los hepatocitos la bilirrubina indirecta se combina con glucuronato por la acción catalítica de la glucuronil transferasa, generándose así la bilirrubina directa o conjugada, la cual en un 85% corresponde a diglucurónido de bilirrubina y el 15% restante a monoglucurónido de bilirrubina. Finalmente, la bilirrubina directa es transferida a la luz de los canalículos biliares
mediante un mecanismo de transporte activo para pasar luego al intestino formando parte de la bilis. En última instancia la bilirrubina se excreta en su mayor parte después de haber sufrido algunas modificaciones químicas, en forma de urobilina por la orina y como estercobilina por las heces fecales. IMPORTANCIA CLÍNICA
La cuantificación de bilirrubinas directa e indirecta en el suero tiene relevancia diagnóstica. El aumento de la concentración sanguínea de bilirrubina o hiperbilirrubinemia puede generarse por 115
incremento en la producción de bilirrubina o por limitaciones en su excreción. Cuando la concentración sérica de bilirrubina alcanza la cifra de 2 a 2.5 mg/dL se presenta ictericia (pigmentación amarillenta de la piel y mucosas). La ictericia se detecta primeramente en las escleróticas debido a que éstas son ricas en elastina, proteína que presenta gran afinidad par la bilirrubina. La hiperbilirrubinemia puede producirse por tres tipos de patologías:
l.
Ictericia prehepática. Se produce en las enfermedades que cursan con destrucción
incrementada de eritrocitos, como son la ictericia neonatorum, policitemia, transfusión de sangre incompatible, paludismo, deficiencia de glucosa 6-fosfato deshidrogenasa, etc. La hiperbilirrubinemia se explica en función de la hiperproducción de bilirrubina indirecta. Su acumulación en la sangre ocurre debido a que la capacidad de conjugación hepática es limitada. Sin embargo, si se trata de una patología hemolítica pura, únicamente se registra un incremento no muy importante de bilirrubina indirecta, alcanzando una concentración de unos 4 mg/dl. Si la hemólisis se presenta dentro de un cuadro de enfermedad sistémica con compromiso hepático, se registrará también incremento de la bilirrubina directa. Los cuadros clínicos con hemólisis prolongada pueden propiciar la precipitación de la bilirrubina en la vesícula biliar, produciendo cálculos de esa sustancia. El síndrome de Gilbert es una hiperbilirrubinemia indirecta que se debe a deficiencia en la captación de la bilirrubina indirecta por los hepatocitos, y al parecer también por un defecto en la conjugación. Su prevalencia según varios estudios es de al menos 8% en la población general, con predominio notable del sexo masculino. La bilirrubina generalmente es menor a 3 mg/dL y todas las pruebas de funcionamiento hepático son normales. La ictericia neonatal fisiológica ocurre frecuentemente entre los días 2 y 5 posteriores al nacimiento, presentando una bilirrubinemia de 5 a 10 mg/dl. La causa es la falta de desarrollo de la fisiología hepática al momento del nacimiento, lo cual es normal. Antes del nacimiento la bilirrubina fetal pasa a través de la placenta y se procesa por el organismo materno. Los mecanismos implicados en el metabolismo de la bilirrubina maduran rápidamente y dentro de las primeras dos semanas se normalizan las concentraciones sé ricas de bilirrubina. 2.
Ictericia hepatocelular. Se produce en las enfermedades que cursan con insuficiencia
hepática como son los casos de tumores hepáticos, hepatitis viral, cirrosis, congestión hepática por insuficiencia cardiaca, hepatitis medicamentosa, hepatitis alcohólica, etc.
116
Puede detectarse incremento en las dos fracciones, directa e indirecta de la bilirrubina, aunque fundamentalmente aumenta la bilirrubina directa puesto que a pesar del daño hepático, la bilirrubina indirecta continua conjugándose en proporción importante. La elevación de la bilirrubina directa se explica en función de que su transferencia a los canalículos biliares depende de energía, proceso que se limita severamente bajo condiciones de insuficiencia hepática. La acumulación de bilirrubina directa en los hepatocitos produce lo que se conoce como "regurgitación" para denotar su retroceso a la circulación. 3. Ictericia poshepática. Se produce en obstrucciones totales de las vías biliares, encontrándose elevada claramente la fracción directa, aunque puede presentarse incremento discreto de la indirecta. Puede deberse a colangitis (inflamación de las vías biliares), neoplasia o cálculos. Las proporciones de bilirrubina directa e indirecta entre la ictericia hepatocelular y la pos hepática no permiten distinguir el tipo de patología. PROCEDIMIENTO (Randox)
Fundamento: la bilirrubina total se determina en presencia de cafeína mediante la reacción con ácido sulfanílico diazotado. La bilirrubina directa se determina en ausencia de cafeína Bilirrubina total
Pipetear en cubetas:
Reactivo Rl
200 11L
Reactivo R2
200 !lL 1 gota (50 !lL)
Reactivo R3
1.0 mL
1.0 mL
Muestra
200 11L
200 !lL
Mezclar y dejar reposar durante 10 minutos entre 20 y 25 ºC. Añadir:
Reactivo 4
1.0 mL
1.0 mL
Mezclar y dejar reposar 5~30 minutos entre 20 y 25 ºC y leer la absorbancia (Asrl a 578 nm de la muestra frente al blanco
117
Bilirrubina directa
Pipetear en cubetas:
Reactivo R1
200 llL
Reactivo R2
200 llL 1 gota {50 11L)
NaCI 0.9%
2.0 mL
2.0 mL
Suero
200 llL
200 llL
Mezclar y dejar reposar durante S minutos exactos entre 20 y 25 ºC. leer la absorbancia (A80 ) a 546 nm de la muestra frente al blanco
CÁLCULOS Bilirrubina total (BT) Asr X 10.8 = _ _ _ mg/dL
Bilirrubina directa (BD) A80 X 14.4 = _ _ _ mg/dL Bilirrubina indirecta (BI) Se obtiene por diferencia entre la bilirrubina total y la directa VALORES DE REFERENCIA Bilirrubina total:
hasta 1.0 mg/dL
Bilirrubina directa
hasta 0.25 mg/dL
BIBLIOGRAFÍA Berk, P. D., and A. W. Wolkoff {2001). Bilirubin metabolism and hyperbilirubinemias. En: Braunwald, E, A. S. Fauci, D. L. Kasper, S. L. Hauser, D. L. Longo and J. Larry Jameson (Eds). Harrison's Interna/ Medicine, 15th ed., McGraw-Hill, New York, N. Y., USA. P.1715-1720 Guyton, A. C. And J. E. Hall. Textbook of Medica/ Physiology, 101h edition, W. B. Saunders Company, 2000 Devlin, T. M. (Editor) Textbook of Biochemistry with clinical correlations, 5th edition. Wiley-Liss, 2002
118
RESULTADOS, DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES.
119
ÁCIDO ÚRICO SÉRICO
OBJETIVOS
l.
El alumno determinará la concentración de ácido úrico en una muestra de suero sanguíneo
2.
El alumno explicará los contextos clínicos relevantes de la cuantificación de ácido úrico en suero
GENERALIDADES
El ácido úrico es el producto final del metabolismo de las bases nitrogenadas purínicas, proceso que se lleva a cabo principalmente en el hígado y en la mucosa intestinal. En estos tejidos se registra gran actividad de la xantina oxidasa, enzima que produce directamente el ácido úrico. En otros tejidos solo se encuentran indicios de dicha enzima. El contenido total de ácido úrico en el adulto es de aproximadamente 1.2 g y se origina tanto de los nucleótidos de purinas ingeridos en los alimentos como de los endógenos. Las concentraciones de ácido úrico y de su base conjugada, el urato, dependen del pH. La primera disociación del ácido úrico tiene un pK de aproximadamente 5.8, por lo que en el plasma (pH 7.4) y en el líquido sinovial el urato representa el 98% y el ácido úrico solo el 2%. La cantidad de urato en el organismo es el resultado de la cantidad que se produce y de la que se excreta. Normalmente entre 2/3 y 3/4 del urato se excreta por la vía renal y el resto por la intestinal. El urato filtra libremente a través del glomérulo, enseguida es reabsorbido casi íntegramente, luego los tú bulos proximales secretan aproximadamente el 50% del absorbido y de esa cantidad se vuelve a reabsorber un 80%. La excreción neta es de 8 a 12% del total filtrado por los glomérulos. Mientras más ácida es la orina mayor será la proporción ácido úrico/urato. La concentración sérica de ácido úrico se halla influenciada por el sexo y la edad. En los niños oscila normalmente entre 3 y 4 mg/dl. A partir de la pubertad aumenta en los hombres pero no en las mujeres debido en parte a que las mujeres excretan una mayor cantidad de urato, por lo cual los valores normales de los hombres adultos son mayores a los de las mujeres. En los hombres los valores oscilan entre 3.4 y 7.0 mg/dL y en las mujeres entre 2.4 y 5.7 mg/dl.
120
IMPORTANCIA CLÍNICA
La hiperuricemia puede definirse como una concentración de urato superior a 7 mg/dl. A partir de este valor aumenta el riesgo de sufrir artritis gotosa o uro litiasis. Entre el 2 y el13 %de los adultos ambulatorios presenta hiperuricemia. En la hiperuricemia se tiene la condición propicia para que se precipite el urato, aunque intervienen factores adicionales que hacen que no ocurra en personas con elevadas concentraciones de urato. Se considera que esto se debe a la presencia de algunas sustancias presentes en el plasma normal. Cuando llega a ocurrir, se forman cristales que tienden a acumularse en las articulaciones formando los llamados tofos, que constituyen la causa de la artritis gotosa aguda, la cual puede progresar a artritis gotosa crónica. El 90% de las personas hiperuricémicas deben tal condición a deficiencia en el manejo renal del ácido úrico. El exceso de ácido úrico favorece la precipitación de cristales, que pueden observarse en la orina. Alrededor del 13% de los cálculos renales son de ácido úrico. Numerosas enfermedades y factores sociales y de comportamiento se asocian a modificaciones de la concentración de ácido úrico en el plasma. El aumento de la concentración sérica de urato es más frecuente y clínicamente más significativo que su disminución. SE PRESENTA AUMENTO DE ÁCIDO ÚRICO EN:
1.
Insuficiencia renal. La retención de urato refleja una disminución de la secreción tubular,
una reabsorción tubular aumentada o ambos factores. 2.
Nefropatía crónica por plomo, patología que se asocia con gota (gota saturnina).
3.
Medicamentos. Algunos fármacos interfieren con la excreción renal de urato, por
ejemplo: furosemida (diurético de asa), tiazidas (diuréticos que actúan en el tú bulo distal), salicilato (aspirina) y fenilbutazona (antiinflamatorio no estero id e de acción muy potente pero con efectos colaterales muy importantes, ya que puede suprimir la producción de leucocitos y puede producir anemia aplástica). 4.
Alimentos. La ingesta de alimentos ricos en purinas, como carne, hígado, riñón,
leguminosas y otros vegetales, provoca hiperuricemia ligera con efecto uricosúrico. S.
Fructosa. El exceso en la ingestión de fructosa puede alterar el metabolismo hepático, el
cual produce mayores cantidades de ácido úrico derivado de la adenosina. La adenosina se deriva del AMP, el cual aumenta de concentración cuando abunda el ADP ya que en tales condiciones éste se combina consigo mismo para formar ATP, coproduciéndose el AMP (2 ADP -MTP + AMP). La elevada concentración de ADP se debe a que la fructosa se fosforila
121
en el hígado a partir de ATP y la fructosa 1-fosfato resultante se metaboliza muy lentamente, generándose un déficit de ATP que termina provocando la formación de AMP, meta bolito que es muy lábil y se descompone fácilmente en adenosina y fosfato. 6.
Deficiencia de hipoxantina-guanina fosforribosil transferasa {HGFT). La HGFT interviene en una vía metabólica alterna de la síntesis de nucleótidos de purinas. La enzima cata liza la combinación de las bases hipoxantina y guanina con un derivado que contiene la ribosa y el fosfato (fosforribosil pirofosfato) para formar los ribonucleótidos correspondientes (IMP y GMP). La deficiencia de la enzima hace que se acumulen las bases y entren a fase catabólica, produciendo ácido úrico. Cuando se encuentra activa la enzima, se retarda el catabolismo de las bases purínicas, lo cual resulta en una tasa menor de formación de ácido úrico.
7.
Neoplasias como linfomas, leucemia, macroglobulinemia de Waldenstrom (también se conoce como linfoma linfoplasmacítico, correspondiendo a un cáncer de linfocitos B en el que se producen grandes cantidades de globulinas lgM, en un grado tan alto que la sangre de hace hiperviscosa, dificultándose la circulación sanguínea en los vasos más pequeños), policitemia, mieloma múltiple y otras.
8.
Etanol. La ingesta de grandes cantidades propicia la degradación del ATP en el hígado y la mayor producción de ácido úrico. Por otra parte, la acidosis láctica que puede presentarse secundaria a la ingestión etílica abundante favorece la precipitación de cristales de ácido úrico
9.
Radiación ionizante, que produce alteraciones en la estructura del DNA, lo cual aumenta su tasa de degradación a ácido úrico.
10. Acidosis. El acetoacetato, el 13-hidroxibutirato, el lactato o los salicilatos se acumulan en estados metabólicos acidóticos y en tales condiciones compiten con el ácido úrico para ser secretados por los tú bulos renales, lo cal lleva a menor excreción de éste.
122
PROCEDIMIENTO (Randox) Fundamento: el ácido úrico se transforma en alantoína y peróxido de hidrógeno en presencia de uricasa. El peróxido de hidrógeno reacciona con ácido 3, 5-dicloro-2 hidroxibencensulfónico y 4aminofenazona, por catálisis de la peroxidasa, produciendo quinoneimina, que es un compuesto colorido. La intensidad del color es directamente proporcional a la concentración de ácido úrico.
Pipetear en tubos de ensayo:
Patrón
20 ¡.¡L
Suero o plasma Reactivo de trabajo
20 ¡.¡L 1.0 mL
1.0 mL
1.0 mL
Mezclar e incubar a 37 ºC durante S minutos. Medir la absorbancia a 546 nm del patrón y la muestra frente al blanco. El color es estable durante 15 minutos
CÁLCULO (A m,.,,,./ A blooco) X 10 = _ _ mg/dL Ácido úrico
VALORES DE REFERENCIA Hombres: 3.4-7 .O mg/dL Mujeres: 2.4-5.7 mg/dL
BIBLIOGRAFÍA Balcells, A. La Clínica y el Laboratorio. Ed Marín, 1989 Grases, F., A. l. Villacampa, A. Costa-Bauza and O. Sohnel (1999). Uric acid calculi. Scanning Microscopy 13: 223-234 Devlin, T. M. (Editor) Textbook of Biochemistry with clinical carrelations, 5th edition. VViley-Liss,
2002 Wortmann, R. L (2001). Disorders of purine and pyrimidine metabolism. En: Braunwald, E, A. S. Fauci, D. L Kasper, S. L. Hauser, D. L Longo and J. Larry Jameson (Eds). Harrison's Interna! Medicine, 15th ed., McGraw-Hill, New York, N. Y., USA. P. 2268-2273
123
RESULTADOS, DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
124
FOSFASATA ÁCIDA SÉ RICA
OBJETIVOS
l.
El alumno determinará la actividad de fosfatasa ácida total y prostática en una muestra de suero sanguíneo
2.
El alumno explicará el contexto clínico en que es relevante la cuantificación de la fosfatasa ácida total y de su fracción prostática
GENERALIDADES
La fosfatasa ácida (FAC) es el nombre que recibe un grupo de enzimas cuya función es hidrolizar a pH ácido una serie amplia de esteres de fosfatos (combinaciones de alcoholes con ácido fosfórico), tales como las hexosas fosfato, el glicerol-fosfato y los nucleótidos. Su máxima actividad se despliega a un pH de 4.9. Los productos de la reacción catalizada por esta enzima son fosfato inorgánico y el alcohol correspondiente, como se muestra en la siguiente reacción general: R-O- P0 3 H- + H20 -
R- OH + H2 P04
Existe una serie de isoenzimas de la FAC en el organismo, de tal manera que virtualmente todas las células la contienen, y aunque se detecta esta actividad en el citosol, la localización intracelular predominante es la lisosomal. Desde el punto de vista clínico son importantes las fosfatasas ácidas de la próstata, de los eritrocitos y de las plaquetas. La FAC de origen prostático se inhibe en presencia de l-tartrato, aunque algunas de otros tejidos también son sensibles a dicho reactivo, como lo demuestra el hecho de que tanto en hombres prostatectomizados como en mujeres, se detecta actividad de FAC sensible al tartrato. La FAC de los eritrocitos se inhibe en presencia de formaldehido, por lo cual, si una muestra de sangre se hemoliza, puede añadírsele dicha sustancia para evitar alteraciones de la actividad real de FAC en el suero. Esto resulta particularmente útil cuando se dificulta o no existe forma de obtener otra muestra de sangre del paciente.
IMPORTANCIA CLÍNICA
l.
Cáncer prostático. La principal utilidad de determinar la actividad de la FAC sérica tiene relación con el cáncer prostático. Cuando la enfermedad se ha diseminado a los huesos adyacentes, aumenta grandemente la actividad de FAC sérica (en condiciones normales la FAC prostática no se vierte a la sangre sino al semen). La diseminación del cáncer prostático a tejidos blandos también se acompaña par actividad sérica alta pero sólo en
125
una proporción menor de pacientes. Cuando el tumor se ha mantenido como un nódulo discreto y no se ha extendido más allá de la cápsula prostática, sólo en el 50% de los pacientes se registran valores anormales de FAC prostática. El cáncer de próstata tiene una prevalencia de 35 por cada 100,000 hombres blancos y de 65 por cada 100,000 hombres de raza negra. La incidencia de esta enfermedad aumenta después de los 50 años de edad y casi nunca se presenta en menores de 40 años. En algunas personas el masaje prostático que ocurre durante la exploración rectal puede provocar una elevación transitoria de la FAC prostática en el suero sanguíneo, por lo cual es recomendable extraer la muestra de sangre antes de practicar dicho procedimiento. 2.
Enfermedades óseas. Estas enfermedades registran incremento de la FAC sérica. Se
incluyen
hiperparatiroidismo
primario
y
metástasis
carcinomatosas
de
diversas
procedencias. 3.
Líquido vaginal. Debido a que el semen contiene FAC prostática, en caso de sospecha de
violación puede determinarse la actividad de la enzima en el líquido vaginal. Se observa una mayor actividad en las primeras 12 horas después del contacto sexual pero puede detectarse incluso a las 48 h. 4.
Enfermedades diversas. La actividad de FAC sérica puede encontrarse aumentada en la
enfermedad de Gaucher (enfermedad genéticamente determinada que se presenta con mayor frecuencia en mujeres de origen judío, caracterizada por esplenomegalia, anemia, leucopenia y lesiones del esqueleto, con pronóstico grave, debida a una deficiencia enzimática para degradar cierto tipo de lípidos, los cuales se acumulan en varios tejidos), en nefropatías, afecciones hepatobiliares y enfermedades del sistema reticuloendotelial. La fiebre puede causar falsas elevaciones. PROCEDIMIENTO (Randox)
Fundamento: la hidro lisis del1-naftil-fosfato, catalizada par la FAC, da como productos fosfato y 1naftol. El1-naftol reacciona a su vez con 4-cloro-2-metilfenildiazonio, y forma colorante azo, cuya concentración es directamente proporcional a la actividad de la FAC. Para determinar la fosfatasa ácida prostática (FAP) se realiza un ensayo igual al que se sigue para la fosfatasa ácida total, pero se añade tartrato a la mezcla de reacción. Dicha sustancia inactiva a la FAP, de manera que la actividad obtenida en el ensayo corresponde a la fosfatasa ácida total
126
menos la FAP, es decir la fosfatasa ácida no prostática (FANP). Para obtener la actividad de la FAP, se resta la FANP de la total.
Pipetear en cubetas:
Suero
100 !!L
Reactivo FAT
1.0 mL
Reactivo FANP
100 !lL
1.0 mL
Las preparaciones FAT y FANP se procesan una a la vez. La cubeta se incuba en baño de agua a 37 ºC durante S minutos. Sacar y secar la cubeta y tomar una primera absorbancia (Ao) a 405 nm frente al aire y sin sacar la celdilla del espectrofotómetro, tomar lecturas adicionales a 1 (A1 ) , 2 (A 2 ) y 3 (A3 ) minutos
FAT = fosfatasa ácida total FANP = fosfatasa ácida no prostática
CÁLCULO Obtener los 3 valores de M en cada muestra (FAT y FANP) como sigue: A 1 - A0, A2
-
A 1 y A3
promediarlos.
M
pmmedio de FAT X
~A
pcomediode FANP
743 = _ _ U/L Fosfatasa ácida total
x 743 = _ _ U/L Fosfatasa ácida no prostática
Fosfatasa ácida prostática= fosfatasa ácida total- fosfatasa ácida no prostática
VALORES DE REFERENCIA Fosfatasa ácida total:
Hombres: hasta 4.7 U/L Mujeres: hasta 3.7 U/L
Fosfatasa ácida prostática:
hasta 1. 6 U/L
127
-
A2 y
BILBLIOGRAFÍA González de Buitrago, J. M., E. Arillo Ferreiro, M. Rodríguez··Segade & A. Sánchez Pozo. Bioquímica
Clínica. McGraw-Hill, 1998 Mathews, C. K. & K. E. Van Holde. Bioquímica, 2a. ed. McGraw-Hill, 1998 Devlin, T. M. {Editor) Textbook of Biochemistry with clinical correlations, 5th edition. Wiley-Liss, 2002
RESULTADOS, DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES.
128
