Procesos Biotecnológicos II Clase 8: Transferencia de Oxígeno Hugo Menzella Mayo de 2013
1
Sobre el término Fermentación Microbiología
Se refiere a procesos de conversión anaeróbicos. Ej. producción de etanol Biotecnología Se refiere a todos los procesos incluidos los aeróbicos
2
Bioproceso aeróbico Stock de células
Materias primas
Erlenmeyer
Medio de cultivo
Fermentador de inoculación
Esterilización Fermentador
Aire Captura Purificación
Productos
3
Aireación y Agitación Importancia del mezclado en la fermentación Dispersar burbujas de gas para asegurar transferencia de gases Mantener células en suspensión
Mantener medio homogeneo Favorecer la transferencia de calor 4
Aireación
Aireación hace referencia al proceso de introducir aire para incrementar la concentración de oxígeno de los liquidos Cumple además la función de eliminar gases tóxicos (CO2)
5
Aireación de un líquido Puede llevarse a cabo de distintas maneras: 1- Burbujeando aire en el líquido 2- Llevando a cabo un spray del líquido en aire 3- Agitando el para incrementar la superficie de absorción 4- Combinación de las anteriores. Ej. Burbujeo + agitación 6
Oxígeno es el sustrato gaseoso más importante
Existen múltiples factores que afectan la transferencia de oxígeno La eficiencia de la transferencia de oxígeno es muchas veces el factor limitante de la producción de un proceso fermentativo Los fermentadores y procesos de fermentación estan diseñados para maximizar la transferencia de oxígeno Satisfacer la demanda de oxígeno es una de las etapas más costosas de los procesos, tanto desde el punto de vista operativo como de capital
7
Transferencia de masa e intercambio de gases
Problema: baja solubiliad del oxigeno en agua, solo ~8 ppm (mg/L), a 20℃ y 1 atm
Debido a la influencia de sales disueltas que constituyen el medio de cultivo la solubilidad es aún menor que en agua pura.
La solubilidad de los gases sigue la ley de Henry en el rango de presiones en el cual operan los fermentadores. 8
Ley de Henry
Describe la solubilidad del O2 en un líquido en relación a la presión parcial del O2 en el gas en contacto con la fase líquida Po C* H
C* es la concentración de saturación en la solución nutriente, Po es la presión parcial de O 2 en la fase gaseosa y H es la cte de Henry, específica para para el gas y la fase líquida
Insuflando aire se logra una concentración de 8 mg O2/L en agua, con oxígeno puro 43 mg O2/L. 9
Etapas de la transferencia de O2 desde la burbuja a la célula
10
Etapas de la transferencia de O2 desde la burbuja a la célula 1 - Difusión dentro de la burbuja hacia la interfase gas-líquido 2 – Difusión a través de la interfase gas-líquido 3 - Difusión a través de la película líquida en torno a la burbuja 4 – Movimiento por difusión en el seno del líquido 5 - Difusión a través de la película líquida en torno al flóculo celular 6 – Entrada al flóculo celular 7 - Difusión a través del flóculo celular 8 – Difusión a través de la membrana celular 9 – Reacción de oxidación
11
Etapas de la transferencia de O2 desde la burbuja a la célula Etapa 1 Difusión dentro de la burbuja hacia la interfase gas-líquido Las moléculas de gas se mueven rapidamente y estan homogeneamente distribuidas O2
12
Etapas de la transferencia de O2 desde la burbuja a la célula Etapa 2 - Difusión a través de la interfase gas-líquido La resistencia es despreciable. En sentido contrario el CO2 pasa del líquido a la burbuja
O2 CO2
O2 13
Etapas de la transferencia de O2 desde la burbuja a la célula Etapa 3- Difusión a través de la película líquida en torno a la burbuja. El movimiento es lento, es la etapa limitante y depende de:
Temperatura Concentración de oxigeno en la burbuja y el liquido Viscosidad del medio de cultivo
14
Etapas de la transferencia de O2 desde la burbuja a la célula Etapa 4 Movimiento por difusión en el seno del líquido En general es rápida. Depende de: La eficiencia del mezclado La viscosidad del medio de cultivo
O2
15
Etapas de la transferencia de O2 desde la burbuja a la célula
Pasos 5 a 9
5 - Difusión a través de la película líquida en torno al flóculo celular 6 – Entrada al floculo celular 7 - Difusión a través del flóculo celular 8 – Difusión a través de la membra celular 9 – reacción
Los pasos 5 y 7 son lentos. Las células aisladas son siempre preferibles a aquellas que crecen en flóculos (Ej. microorganismos filamentosos) por su facilidad para captar oxígeno
16
Etapas de la transferencia de O2 desde la burbuja a la célula Si el proceso utliliza células aisladas en suspensión y el mezclado del líquido es eficiente:
El paso limitante del proceso de transferencia es la etapa 3- Difusión a través de la película líquida en torno a la burbuja
17
Proceso de transferencia de oxígeno Paso 3 La ecuación para la transferencia de oxígeno en la interfase:
N A k L a (C * CL ) OTR NA = Transfrencia de masa (mMO2/Lh) kL = Coeficiente de transferencia (m/h) a = Superficie de intercambio por unidad de volumen (m-1) kLa = Coeficiente volumétrico de transferencia de O2 (h-1) C* = Valor de saturación para la cc O2de en la interfase (aprox igual a la solubildad de O2 en fase líquida) (mM/L) CL = Concentración de O2 en fase liquida (mM/L)
de aquí en adelante OTR = O2 Transfer Rate (mM O2/Lh)
18
Parametros que influyen en la capacidad de transferencia de oxígeno de un sistema de fermentación
Diseño del fermentador: Turbinas Baffles Aireadores Geometría Organismo: Morfología
Medio de cultivo: Solubilidad del oxígeno Viscosiidad Presencia de agentes tensoactivos
Parametros del proceso: Veloc agitación(RPM) Caudal aireación(VVM) Presión parcial de O2 (pO2)
19
Influencia de la Temperatura en la OTR
20
Influencia de la Temperatura en la OTR
>T < Solubilidad de O2 >T >Difusión 10°C-40°C: predomina >Difusión , aumenta OTR >40°C: predomina < Solubilidad de O2, disminuye OTR
21
Influencia la morfología y del medio de cultivo en la OTR Izquierda:
influencia de la viscosiad del medio en la OTR
Derecha: influencia de la efecto la la presencia de componentes del medio en la OTR
22
Influencia de la agitación y caudal de aireación en OTR
23
Influencia de la PO2 en la OTR PO2 puede ser variada de distintas maneras: 1- Aumento de la presión en el tanque 2- Incremento de la concentración de oxígeno en el gas suministrado
Importante: Debe realizarse un exhasutivo análisis de costo antes de implementar el aumento de presión o uso de oxígeno puro
24
Influencia del uso de agentes antespumantes
Son moleculas anfipáticas
Se ubican en torno a las burbujas y disminuyen la transferencia de O2 La formación de espuma aumenta con el caudal de aire suministrado. Caudales mayores a 1 v/vmin no pueden utilizarse en fermentaciones de alta densidad de células Cuando es posible se prefiere el uso de dispositivos mecánicos rompe espuma 25
Contenido de gas del fermentador y tiempo de residencia de las burbujas El O2 debe ser suministrado tratando que las burbujas queden temporalmente retenidas en el seno del líquido para que el O2 se transfiera a la fase líquida. A > T residencia de burbuja > transferencia de O2 hasta el punto en que la concentración de O2 de la burbuja es muy baja. T residencia de Burbuja depende del tamaño y de la geometría del fermentador (a > h > Tr)
26
Porque es importante determinar KLa para un sistema de fermentación?
Es un parámetro confiable que permite determinar la maxima OTR de un fermentador, una de sus caracteristicas más importantes (la otra es la capacidad de disipar el calor generado)
Puedo determinar que fermentador es adecuado para escalar un proceso (scaling up)
Si debo desarrollar un nuevo proceso y adaptarlo a un fermentador de gran escala preexistente, permite conocer las las limitaciones que voy a tener en planta y limitar el alcance de la etapa I+D (scaling down) 27
Métodos para determinar KLa
1. Método de oxidación de sulfito (método de Cooper) 2. Gassing out estático 3. Gassing out dinámico
28
Métodos para determinar KLa 1. Método de oxidación de sulfito Mide la velocidad de conversión de una solución 0.5 M de sulfito de sodio a sulfato en presencia de cobre como catalizador
Na2SO3 + 1/2 O2
Cu++ or Co ++
Na2SO4
La velocidad de oxidación del sulfito es proporcional a la transferencia de oxígeno Desventajas
i) lento ii) no considera reología delmedio
29
Métodos para determinar KLa Método de Gassing out estático
Utilizando la técnica de gassing out se mide con una sonda polarográfica el incremento en O 2 disuelto de un medio de cultivo del cual se ha eliminado el O 2
30
Métodos para determinar KLa Se elimina todo el O2 del medio por burbujeo de N2, luego se administra aire y se grafíca: Y
Concentración de O2 disuelto
X
Tiempo
La OTR a tiempo X es igual a la pendiente de la tangente a la curva
31
Métodos para determinar KLa Ventajas del Métodos de Gassing out estático Rápido
~15 mins Puede utilizar medio de cultivo
Desventajas En escala industrial se requieren grandes cantidades de N2 para eliminar todo el oxigeno Mide la transferencia de O2 n un unico punto del fermentador El tiempo de respuesta del electródo introduce errores
32
Métodos para determinar KLa Método de Gassing out dinámico Mide los niveles de O2 en cultivos que estan creciendo en el fermentador
Se suspende la aireación y el consumo de los microorganismos reduce el nivel de O2
El incremento BC de O2 observado in el oxígeno disuelto es la diferencia entre el OTR y el consumo de los microorganismos (OUR)
33
Métodos para determinar KLa Método de Gassing out dinámico para la dereminación de Kla La aireación se suspende en el punto A y se reinicia en B X
C
A
Concentración de O2 disuelto
Pendiente AB da RX (Velocidad de respiración) Pte BC da dC/dt
B Tiempo
34
Método de Gassing out dinámico Expresado como ecuación: dC/dt = Kla (Csat - CL) - QO2.X QO2 = veloc respiración (mmoles of O2 g-1 biomass h-1), X = Biomasa Se suspende la aireación, se mide O2 disuelto dC/dt = - QO2.X ... La pte AB permite determinar QO2.X Se reinicia la aireación y se mide O2 disuelto , dC/dt (pte BC)
= KLa
(Csat (tabulada)
CL) (Observada)
- QO2.X (pte AB) 35
Método de Gassing out dinámico Ventajas Puede determinar KLa durante una fermentación real Rápido Desventajas Puede trabajar en un rango limitado de concentraciones de O2, el nivel no puede caer por debajo de la Ccrit Dificil de aplicar en fermentaciones con alta demanda de O2 (como la de nuestro TP!) Mide OTR en un solo punto del fermentador, adonde se aloja la sonda. 36
Niveles críticos de O2 disuelto
Para maximizar la producción de biomasa se debe satisfacer la demanda de O2 de las células en cultivo manteniendo el nivel por encimaa de la Ccrit
Si la concentración cae por debajo de Ccrit se altera el metabolismo con el consecuente impacto en la productividad
Importante: el consumo de puede controlarse regulando la velocidad de administración de los sustratos oxidables, este es el fundamento de las denominadas “fermentaciones en batch alimentado”
37
Estequiometría de la respiración Consideramos el uso de glucosa como fuente de carbono y energía;
C6H12O6 + 6O2
=
6H2O + 6CO2
PM glucosa =180 PM O2= 32
Para oxidar 180 g de glucosa se requiren 192 g de O2. Si la velocidad de captación de O2 de la biomasa (OUR) supera la OTR se consume rapidamente todo el O2 y habrá alteraciones metabolicas Pero… puedo administrar la glucosa a una velocidad tal que el fermentador pueda suministrar el O2 necesario para oxidarla. Esta es la razón mas importante para establecer procesos en batch alimentado 38
Ccrit O2 para algunos microorganismos Organism o
Temperatura oC
Concentración crítica de O2 (mmoles dm -3)
Azotobacter sp.
30
0.018
E. coli
37
0.008
Saccharomyces sp.
30
0.004
Penicillium chrysogenum
24
0.022
Ccrit es la cc de O2 por debajo de la cual la velocidad de respiracion comienza a disminuir, se relaciona con Km de oxidasas de cadena respiratoria 39
Concentración de O2 vs Velocidad de respiración (Veloc Cto) El efecto de la concentración de O2 disuelto en la velocidad de respiración la cual puede relacionarse directamente con la velocidad de crecimiento puede describirse con una ec de Michaelis Menten
Veloc respiración (QO2) = QO2 max . conc O2 / ( Ks + conc O2 ) Vel cto especifico = max. C/ (Ks + C) donde C = conc O2 QO2 = mmoles O2 consumidos por gramo de peso seco de biomasa 40
Effecto de la concentración de O2 disuelto en el QO2 de un microorganimo
QO2
Ccritical
concentración de O2 disuelto El consumos especifico de O2 se incrementa al aumentar la concentración de O2 disuelto hasta un cierto valor denominado Ccrit
41
Factores que afectan la demanda de oxígeno Velocidad de respiración determinada por la afinidad de oxidasas Tipo de respiración (aeróbica vs anaeróbica) Tipo de sustrato (glucosa vs metano) Otros factores ambientales (pH, temp etc.) Relacion superficie/ volumen Tamaño (bacteria v célula animal) Presencia de hifas, clogs, etc. Naturaleza de la superficie (presencia de capsula, etc) 42
Para recordar: balance entre demanda y suministro de O2 al diseñar un bioproceso El diseño de un proceso de fermentación debe ser tal que en todo momento el OUR sea menor al OTR OUR = QO2.X QO2 = O2 Veloc de captacion específica, X = Biomasa
OTR = KLa(Csat - CL ) Además la concentración de O2 disuelto debe ser > Ccrit en todo momento.
43
Para recordar: balance entre demanda y suministro de O2 al diseñar un bioproceso La fermentación tiene un OTR máximo dictado por los factores descriptos anteriormente, por lo tanto si es superada la OTR máxima debe reducirse la demanda del bioproceso mediante:
•Control de la concentración de biomasa •Control de la QO2 •Combinaciones de ambas
44
