PRESENCIA DE LACTATO DESHIDROGENASA. CITOCROMO OXIDASA Y SUCCÍNICO DESHIDROGENASA

PRESENCIA DE LACTATO DESHIDROGENASA. CITOCROMO OXIDASA Y SUCCÍNICO DESHIDROGENASA

2013

S e m e s t re : 2 0 1 3 - 1

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

Decana de américa

Q. UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS Escuela de Farmacia y Bioquímica F. Mg. Yadira Fernández Jerí

Integrantes: Alderete Espejo, Hattie. Hattie. Moleros Coral, Diego Alejandro. Alejandro. Porras Cochachi, Katia Rubí. Quiñones Huayaney, María Eugenia.

Docente:

Tolentino Chávez, Jorge Luis

Q.F. Mg. Yadira Férnandez Jerí

PRESENCIA DE LACTA LACTATO DESHIDROGENASA. CITOCROMO OXIDASA Y SUCCÍNICO DESHIDROGENASA

ASIGNATURA: Bioquími Bioquímica ca I

PRESENCIA DE LACTATO DESHIDROGENASA, CITOCROMO OXIDASA Y SUCCÍNICO DESHIDROGENASA DESHIDROGENASA OBJETIVOS •

•

•

Identificar la presencia de citocromo y el efecto de inhibidores sobre la cadena transportadora de electrones. Evaluar la actividad de la enzima lactato deshidrogenasa en tejidos de res. Determinar la actividad de la succinato deshidrogenasa en la fracción mitocondrial de hígado de res en presencia y en ausencia de un inhibidor competitivo de la enzima.

INTRODUCCIÓN En esta práctica se evaluaron las enzimas lactato deshidrogenasa(LDH), que a su vez vez se libe libera ra al plas plasma ma como como cons consec ecue uenc ncia ia de la dest destru rucc cció ión n celu celula larr (fisiológica o patológica) y es un marcador de destrucción celular sensible aunq aunque ue poco poco espe especí cífi fico co.. Por otr otro lado lado la succ succin inat ato o desh deshid idro roge gena nasa sa o deshidrogen deshidrogenasa asa del ácido succínico succínico,, es una oxidorred oxidorreductas uctasa a que cataliza la oxidación del succinato para formar fumarato siendo la coenzima el FAD. Para ello se hizo la extracción y preparación de las enzimas y coenzimas, provenientes del corazón y del hígado de res, eliminando completamente la grasa y el tejido conectivo, para el lavado se utilizó KCl 0.154M, para hacer luego un homogenizado. Posteriormente se hizo un seguimiento de la reacción catalizada por el lactato deshidrogenasa, en donde el sustrato fue lactato de sodio 0.1M, azul de metileno como indicador y el aceite mineral para proteger la oxidación oxidación del azul azul de metileno. metileno. Por otro otro lado se identificó identificó al malonato malonato de sodio sodio 0.1M como inhibi inhibidor dor especí específic fico, o, puesto puesto que sólo sólo actúa a nivel nivel de la


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ASIGNATURA: Bioquímica I

succinato deshidrogenasa, mientras que el cianuro de sodio 0.1M es un inhibidor del citocromo oxidasa, el buffer fosfato 0.1M dio el medio adecuado. Es posible distinguir 5 isoenzimas de la LDH, que permiten diferenciar hasta cierto punto el órgano u órganos de procedencia. Así, la LDH-1 procede en el 60% del músculo cardíaco, mientras que la LDH-5 procede mayoritariamente del hígado y la piel.

MARCO TEÓRICO LACTATO DESHIDROGENASA (LDH)

Es una enzima que cataliza una parte del metabolismo anaeróbico de la glucosa y de la síntesis de la glucosa, los humanos disponemos de dos cadenas polipeptídicas isoenzimáticas para esta enzima: el isoenzima H que se expresa abundantemente en el músculo cardiaco y el isoenzima M que lo hace en el músculo esquelético1. Hay cinco forma isoenzimáticas distintas codificadas por genes distintos. Su función es la de reducir reversiblemente el piruvato a lactato. La lactato deshidrogenasa (LDH) aparece en altas concentraciones en muchos órganos, a diferencia de otras enzimas. Se encuentra gran cantidad de deshidrogenasa láctica especialmente en el hígado, los músculos, los glóbulos rojos (eritrocitos) y los riñones. Las concentraciones elevadas de lactato deshidrogenasa son clínicamente importantes y pueden encontrarse en estados patológicos que causan daño celular. Los infartos del miocardio, enfermedades hepáticas y renales, anemias megaloblásticas, distrofia muscular progresiva y algunas neoplasias producen altos valores de lactato deshidrogenasa en el suero2. PRINCIPIO:

El lactato deshidrogenasa convierte el L-lactato y NAD en piruvato y NADH. El índice de incremento en absorbancia de la mezcla de reacción a 340 nm, debido a la formación del NADH, es proporcional a la actividad de la LDH.


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SUCCÍNICO DESHIDROGENASA (SDH)

La enzima succinato deshidrogenasa (SDH, E.C. 1.3.99.1) es una flavoproteína que participa en el ciclo de Krebs y al estar asociada a la membrana interna mitocondrial, también forma parte la cadena de transporte electrónico mitocondrial. La SDH cataliza estereoespecíficamente la deshidrogenación en trans del ácido succínico hasta ácido fumárico. Esta enzima se inhibe por malonato y maleato, que son análogos estructurales del succinato 3.


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El déficit de

succínico semialdehído deshidrogenasa (SSADH) es una enfermedad de expresión clínica variable e inespecífica, pudiendo presentar en sus inicios moderado a severo retardo del desarrollo motor con hipotonía global y reflejos conservados (hipo o hiperrreflexia), y posterior retraso en la manipulación de objetos, con movimientos coreoatetósicos y ataxia truncal. Si bien el retraso del desarrollo, la hipotonía y el retardo mental constituyen las características clínicas más constantes del déficit de SSADH (74 a 78%) aproximadamente el 50% de los pacientes presentan trastornos de conducta, ataxia y convulsiones; pudiendo ser éstas tónico-clónicas, mioclónicas o crisis de ausencias.

CITOCROMO OXIDASA


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La citocromo C-oxidasa es un enzima que cataliza la transferencia de electrones al oxígeno para dar agua, constituye lo que se conoce como complejo 4 de la cadena de transporte electrónico y está presente en todos los organismos aerobios (es decir que utilizan el oxígeno como aceptor de electrones). Los citocromos son proteínas que contienen porfirinas que tienen ligado un átomo de hierro. Existen citocromos que son hidrosolubles, otros que son liposolubles. Otra peculiaridad es que existen citocromos móviles como por ejemplo el citocromo c. Aunque la gran mayoría funcionan asociadas a macromoléculas como pueden ser los complejos III y IV. Los citocromos son enzimas transportadoras de electrones que tienen ferroporfirina como grupo prostético. Los citocromos fueron descubiertos y designados originalmente como histohematinas por C. MacMunn en 1866, su significado en las funciones biológicas fue descrito por D. Keilin en este siglo, quien los nombró como citocromos. La determinación de sus propiedades espectroscópicas lo realizó en un espectroscopio manual, utilizando músculos de insecto; observó cómo aparecían y desaparecían bandas de absorción con la actividad muscular. Finalmente los agrupó en tres clases diferentes: a, b y c, según las bandas características de cada uno.Cada tipo de citocromo en estado reducido exhibe tres bandas de absorción características en el espectro de luz visible, a, b, y g o Soret. La mayoría de los citocromos son muy difíciles de purificar pues están embebidos en las membranas, excepto el citc que puede ser aislado mediante disoluciones salinas; el hemo de este citocromo, está unido a la proteína por puentes tioéster entre el anillo de porfirina y dos residuos de Cys, es el único en donde hay un enlace covalente 4. UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

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CICLO DE KREBS

El ciclo de Krebs (de los ácidos tricarboxílicos o del ácido cítrico) es una vía metabólica presente en todas las células aerobias, es decir, las que utilizan oxígeno como aceptor final de electrones en la respiración celular. En los organismos aerobios las rutas metabólicas responsables de la degradación de los glúcidos, ácidos grasos y aminoácidos convergen en el ciclo de Krebs, que a su vez aporta poder reductor a la cadena respiratoria y libera CO25 Reacciones del Ciclo de Krebs: 1. La acetil-CoA (2C) se une al ácido oxalacético (4C) y forma ácido cítrico (6C). La CoA se libera así y puede volver a reaccionar con más ácido pirúvico. 2. Isomerización del ácido cítrico, que pasa a Isocitrato 3. Oxidación del Isocitrato por el NAD+ produciéndose ácido cetoglutárico (5C), NADH y una molécula de CO2 4. Descarboxilación oxidativa del α-cetoglutárico, debida al NAD+ que vuelve a dar NADH y una molécula de CO2. El resto acilo (4C) se une al CoA, y forma succinil-CoA. 5. Hidrólisis del succinil-CoA para liberar la energía del enlace, que se transfiere al GTP, un nucleótido de alta energía, mediante fosforilación a nivel de sustrato. Así se forman succinato y CoA. 6. Transformación del succinato en malato, gracias al FAD, que es usado como coenzima por una deshidrogenasa y se transforma en FADH2


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ANARANJADO DE METILO Naranja de metilo es un colorante azoderivado, con cambio de color de rojo a naranja-amarillo entre pH 3,1 y 4,4. El nombre del compuesto químico del indicador es sal sódica de ácido sulfónico de 4-Dimetilaminoazobenceno. La fórmula molecular de esta sal sódica es C 14H14N3NaO3S y su peso molecular es de 327,34 g/mol

MATERIALES:


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ASIGNATURA: Bioquímica I -

10 tubos de ensayo.

-

2 Matraces Erlenmeyer de 150 mL.

-

Beaker de 500 mL.

-

Homogenizador.

-

4 pipetas 5 mL.

-

5 pipetas 2 mL.

-

2 tubos de centrifuga.

-

1 Gradilla.

-

Un pipeteador.

REACTIVOS: -

KCl 0,154 M.

-

Lactato de Sodio 0.1M.

-

Sol. De Azul de Metileno 0,01%.

-

Buffer fosfato 0,1M ypH 7,4.

-

Solución malonato de sodio 1%.

-

Solución de cianuro de potasio 0,05M.

-

Solución de p-fenilendiamina al 1%.

-

Solución de succinato de sodio al 1%.

-

Aceite mineral.

-

Agua destilada.

-

Baño de hielo.

-

Tejido hepático fresco.

-

Tejido cardiaco fresco.


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El método de ensayo de la actividad SDH se basa en la utilización de un aceptor artificial de electrones

PARTE EXPERIMENTAL 1. Seguimiento de la reacción catalizada por lactato deshidrogenasa

Actividad sobre el Piruvato. Lactato deshidrogenasa. Estructura tridimensional.

2. Seguimiento de la reacción por la citocromo oxidasa.

Reactivo Lactato de Sodio 0.1M Sol. De Azul de Metileno. Cianuro de Sodio Malonato de Sodio Homogenizado de corazón. Sol. de pfenilendiamina

Función. Sustrato Indicador de reacción. Inhibidor del sistema citocromo. Inhibidor Fuente de Lacto Deshidrogenasa. Sustrato.


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3. Seguimiento de la reacción catalizada por la Succínico deshidrogenasa.

Reactivo Sol. De Azul de Metileno. Succinato de Sodio 0.1M Malonato de Sodio Cianuro de Sodio Ferricianuro de Sodio Homogenizado de Hígado.

Función. Indicador de reacción. Sustrato Inhibidor Inhibidor Inhibidor Fuente de Lacto Deshidrogenasa.

A todos los tubos inmediatamente después de agregarles los reactivos se les agrego 1 mL de aceite mineral para evitar la interferencia del oxígeno en la reacción.


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RESULTADOS Ensayo 1 SEGUIMIENTO DE LA REACCIÓN CATALIZADA POR LA LACTATO DESHIDROGENASA

COMPONENTES

TUBO1

TUBO2

TUBO3

TUBO4

Lactato de sodio 0.1M

1.0

0.0

1.0

0.0

Sol. De azul de metileno

1.0

1.0

1.0

1.0

Homogenizado de hígado

0.5

0.5

-

-

Homogenizado de corazón

-

-

0.5

0.5

OBSERVACIONES

Solución azul turquesa

Solución azul turquesa oscuro

Solución azulada

Solución azulada oscura

RESULTADOS

++

+++

++

+++

Reacción6:


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ASIGNATURA: Bioquímica I Ensayo 2 SEGUIMIENTO DE LA REACCIÓN CATALIZADA POR LA CITOCROMO OXIDASA COMPONENTE TUBO1 S

TUBO2

TUBO3

TUBO4

Homogenizad o de corazón

0

1.0

1.0

1.0

Cianuro de sodio 0.1M

0.0

0.0

0.5

0.0

Malonato de sodio 0.1M

0.0

0.0

0.0

0.5

Sol.PFenilendiamin a

1.0

1.0

1.0

1.0

Buffer fosfato 0.1M ,pH 7,4

1.5

0.5

0.0

0.0

OBSERVACIO NES

Solución incolora

Solución marrón rojiza

Solución anaranjada

Solución marrón rojiza

RESULTADOS

-

+++

++

+++

Reacción7:

2 Citocromo c reducido + 2H + + ½ O2 oxidado +H2O


2Citocromo c

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2Citocromo c oxidado + P-Fenilendiamina coloreado (marrón rojizo)

Compuesto

ENSAYO 3 SEGUIMIENTO DE LA REACCIÓN CATALIZADA POR LA SUCCÍNICO DESHIDROGENASA REACTIVOS

TUBO1

TUBO2

TUBO3

TUBO4 TUBO5

TUBO6

TUBO7

Azul de metileno (0.02%)

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

Buffer fosfato 0.1M pH 7,4

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

Succinato de sodio 0.1M

0.2

0.2

-

0.2

-

0.2

-

Agua bi-destilada

-

-

0.2

-

0.2

-

0.2

Malonato de sodio

-

0.3

0.3

-

-

-

-

Cianuro de sodio 0.1M

-

-

-

0.3

0.3

-

-

Ferricianuro de potasio 0.1M

-

-

-

-

-

0.3

0.3

Homogenizado de hígado

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5


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ASIGNATURA: Bioquímica I OBSERVACIONES

Solució Solució Solució Soluci Solució n n verde n ón n incolora incolora azulada verde azulada incolor a

Solució Solució n n verdos Verdos a a

RESULTADOS

-

+++

-

++

-

++

+++

Reacción8:

DISCUSIONES: 1. EXTRACCIÓN YPREPARACIÓN DE LAS ENZIMAS Y COENZIMAS

•

Los resultados obtenidos en todas las mesas de trabajo no fueron muy eficientes debido a que la extracción y preparación de la muestra se realizó con muchos días de anticipación a la práctica. Por ello se debe tener en cuenta el rendimiento y la pureza de cada fracción celular a usar


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•

•

o cada homogenizado. Además la lactato deshidrogenasa solo tiene una vida media de 113 horas aproximadamente (9). La conservación parcial del homogenizado se obtuvo gracias a los lavados con KCl, pues esta sal detiene la actividad enzimática. El mecanismo de acción de esta sal es someter a las células a un medio hipertónico, obligando así a la salida del agua junto a otros componentes responsables de la degradación celular. (10) Además esta conservación enzimática parcial también fue posible gracias al hielo. Esto se debe a que las bajas temperaturas inactivan a las enzimas y permiten conservar los tejidos.

2. SEGUIMIENTO DE LA REACCIÓN CATALIZADA POR LA LACTATO

DESHIDROGENASA

La LDH es una enzima citoplasmática. Su centro activo se encuentra en el interior de cada subunidad, siendo específico para el lactato, y utiliza únicamente NAD+ como coenzima. Pero, a pesar que en la reacción no agregamos el NAD+ la reacción si se realizó, esto es debido a que se utilizó un homogenizado en el cual ya se contaba con esa coenzima (11). El azul de metileno funciona como un indicador de tipo REDOX, se utiliza como aceptor de hidrogeno (tiene carga positiva y se une a compuestos cargados negativamente), pues posee la propiedad muy útil de cambiar de color al pasar de oxidado a reducido. Es azul de metileno cuando esta oxidado y blanco (incoloro) de metileno cuando esta reducido. El azul de metileno al ser un indicador de REDOX y no de viraje de pH, podríamos utilizar en su lugar un indicador con la misma propiedad como la sal férrica de la ortofenantrolina, que cambia de azul pálido(forma oxidada) a rojo(forma reducida) o el ácido difenilaminosulfónico, que cambia de incoloro(forma oxidada) a violeta(forma reducida). La reacción con el homogenizado de hígado presentó mayor decoloración que el homogenizado de corazón, lo que puede significar que en el primero hay mayor presencia de enzimas. Sin embargo, es necesario recalcar que La isoenzima M4 (presente en el hígado) tiene mayor afinidad por piruvato y la H4


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(presente en el corazón) por lactato. Es decir, la concentración de enzimas en el hígado influenció más que la afinidad de la enzima por el lactato (12). En los tubos 2 y 4 la decoloración por la reducción del azul de metileno fue casi imperceptible debido a que La LDH es una enzima cuyo sustrato específico es el lactato. Al no encontrarse dicho sustrato en la solución no pudo haber transferencia de electrones y por ende no se realizó la reacción REDOX (13). 3. SEGUIMIENTO DE LA REACCIÓN CATALIZADA POR LA CITOCROMO

OXIDASA

El ensayo en la prueba inhibidora del Malonato nos dio una coloración rojiza marrón, lo que indicaba que la reacción se desarrolló normalmente, sin embrago según referencias el Malonato es un inhibidor, entonces la reacción se dio porque el Malonato actúa sobre el succinato, pero no actúa o inhibe al citocromo oxidasa. La coloración marrón rojiza es ocasionada porque la fenilendiamina se oxida. El cianuro de sodio presento una coloración anaranjada, se debe a una reacción del homogeneizado con el sustrato fenilendiamina, en donde el cianuro es un inhibidor que inhibe al citocromo c impidiendo el flujo normal de electrones para que se oxide el sustrato. Las reacciones que se hicieron fueron hechas con homogeneizados, lo cual nos puede indicar que en este homogeneizado no solo se encuentra la enzima que deseamos sino su cofactor, parte de su sustrato y entre otros

4. SEGUIMIENTO DE LA REACCIÓN CATALIZADA POR LA SUCCINICO

DESHIDROGENASA

En el tubo N°1 se obtuvo una decoloración mucho mayor que en los demás tubos, eso se debe a la presencia del sustrato (succinato de sodio), el medio óptimo de pH (7,4) y al compuesto azul de metileno (indicador tipo REDOX). Cabe recordar que para que la enzima succinato deshidrogenasa actúe, necesita una proteína (FAD) el cual funciona como aceptor de hidrógeno oxidando así al succinato a fumarato y reduciendo el azul de metileno a blanco


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de metileno (incoloro). El FAD no fue agregado porque el homogenizado, al ser parte de un organismo vivo, cuenta ya con esa flavoproteína (14). En todos los tubos solo se trabajó con el homogenizado de hígado debido a q el succinato deshidrogenasa es la única enzima que no se encuentra en la matriz, en cambio está ligado a la membrana mitocondrial de hígado de ratas hembras y macho. Por ello resulta más eficiente trabajar solo con el homogenizado de hígado (15). En los tubos 2 y 3, no se aprecia una decoloración de la solución, esto se debe a que la Succinato Deshidrogenasa es inhibida por el Malonato, con estructura semejante al Succinato, que únicamente tiene un metilo (-CH2-) y no se puede oxidar por deshidrogenación. Otro compuesto que también la inhibe es el Oxalacetato, que tampoco se puede deshidrogenar (16). El cianuro es un inhibidor enzimático no específico, se conoce que el cianuro se une e inactiva aproximadamente 40 enzimas, entre las cuales se encuentra la succínica deshidrogenasa. Es por ello que los tubos 4 y 5 que fueron sometidos a esta solución de cianuro, permanecieron casi azul. Sin embargo, se pudo presenciar una ligera decoloración, la cual se debe a que el cianuro bloquea principalmente la citocromo oxidasa y con menos intensidad el succinato deshidrogenasa (17). La presencia del substrato (succinato), en los tubos 6 y 7, permite que dicho succinato se oxide, proceso que implica un transporte de electrones, los cuales son captados por el ferrocianuro, el cual se va decolorando a medida que ello ocurre, pero luego son liberados algunos electrones y son captados por el azul de metileno. Es por ello que la solución tomó un color verde pálido, de la mezcla del azul de metileno y el ligero color amarillo del ferricianuro (oxidado) (18).

CONCLUSIONES: UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

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ASIGNATURA: Bioquímica I •

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Se determinó la actividad de las enzimas, citocromo oxidasa, cuya importancia en la actividad reside en el metabolismo oxido-reducción. Los inhibidores actúan específicamente en un lugar de la cadena de transporte de electrones. El cianuro de hidrogeno inhibe la citocromo c oxidasa, Malonato de sodio inhibe en la parte que los electrones llegan al succinato deshidrogenasa.

El tejido de res presenta lactato deshidrogenasa, que según los experimentos podemos deducir que el homogeneizado de hígado posee más enzima lactato deshidrogenasa que el homogeneizado de corazón. Esto fue comprobado por una diferencia de coloración con la reducción del azul de metileno. Se determinó la actividad enzimática de la enzima succinato deshidrogenasa del tejido de la res, usando como indicador la reducción del azul de metileno. EL uso de un buffer era indispensable para los estudios debido a que la enzima requiere de estos medios. El Malonato es un inhibidor, el cianuro de hidrogeno es un inhibir que acepta los electrones y el azul de metileno no se reduce, el ferricianuro de potasio acepta los electrones, este se reduce y se aprecia el color verde.


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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: 1. Jeremy Mark Berg,Lubert Stryer,John L. Tymoczko. Bioquímica. Capítulo 10. Pág. 283 2. Burtis, C.A. and Ashwood, E.R. (Eds), Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 2nd ed., W.B. Saunders Co., Philadelphia (1994). 3. Virginia Melo,Virginia Melo Ruiz,Oscar Cuamatzi. Bioquímica de los procesos metabólicos. 4. Jean F. Mac Faddin. Pruebas Bioquímicas para la Identificación de Bacterias de Importancia Clínica. Pag. 346 5. Teijón, José María. Fundamentos de Bioquímica metabólica.Pag.37 6. Introducción a la enzimología .Disponible en: http://webcache.googleusercontent.com/search? q=cache:zqUqPNirWn4J:www.usal.es/~dbbm/clasmed/enz02.ppt+lactato+deshid rogenasa+reacciones+ppt&cd=1&hl=es&ct=clnk&gl=pe

7. Pruebas Bioquímicas.Disponible en: http://books.google.com.pe/books? id=FYWSzy7EjR0C&pg=PA349&lpg=PA349&dq=citocromo+oxidasa+con+soluci on+de+p-fenilendiamina&source=bl&ots=RMQGUdP8Qs&sig=RLzedHZWowZAcxKhH57z6dwW6s&hl=es&sa=X&ei=wy21Ufi8CuTn0QGYoYDwDQ&ved=0CDsQ6 AEwAw#v=onepage&q=citocromo%20oxidasa%20con%20solucion%20de%20pfenilendiamina&f=false

8. Reacciones y enzimas del ciclo de Krebs .Disponible en: http://www.bioquimicaqui11601.ucv.cl/unidades/krebs/metcdek3fid.html

9. Enzimas séricas. Recuperado de: http://www.fmvuba.org.ar/grado/medicina/ciclo_biomedico 10. ECURED. Cloruro de potasio. Recuperado de: http://www.ecured.cu/index.php/Cloruro_de_Potasio 11. Lactato deshidrogenasa (LDH). Recuperado de:


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http://medicina-1105.wikispaces.com/Lactato+Deshidrogenasa 12. Actividad y regulación de las acciones enzimáticas. Recuperado de: http://www.oocities.org/pelabzen/regenz.html 13. Actividad lactato deshidrogenasa en hígado de rata. Recuperado de: http://campus.usal.es/~delefn/java/alumnos/oregano/hues5.htm 14. Virginia Melo,Virginia Melo Ruiz,Oscar Cuamatzi. Bioquímica de los procesos metabólicos.Barcelona: Reverté; 2007. 15. Ruelos Torreblanca, Consuelo Betzabe. Actividad de succinato deshidrogenasa mitocondrial (C.E.1.3.99, 1) en hígado de ratas sometidos a la acción de hormonas sexuales. Recuperado de: http://bases.bireme.br/cgi-bin/wxislind.exe/iah/online 16. Miguel Ángel Ordorica Vargas & María de la Luz Velázquez Monroy. Ciclo del ácido cítrico. Recuperado de: http://www.bioquimica.dogsleep.net/Teoria/archivos/Unidad62.pdf 17. Quiroga, Patricia N. *; Olmos, Valentina. Revisión de la toxicocinética y la toxicodinamia del ácido cianhídrico y los cianuros. Argentina; Ciudad Autónoma de Buenos Aires, v.17 n.1; 2009. 18. Oxidación mitocondrial del succinato. Recuperado de : http://practicasdebioqumica.blogspot.com/


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CUESTIONARIO: 1. ¿Cuál es la importancia del sistema redox en el metabolismo energético? REACCIÓN REDOX En los sistemas vivos, las reacciones que capturan energía (fotosíntesis) y las reacciones que liberan energía (glucólisis y respiración), son reacciones de oxidaciónreducción. La oxidación completa de un mol de glucosa libera 686 kilocalorías de energía libre; de modo inverso, la reducción del dióxido de carbono para formar un mol de glucosa almacena 686 kilocalorías de energía libre en los enlaces químicos de la glucosa. Si esta energía fuera liberada de una sola vez, la mayor parte se disiparía como calor. Esto no solamente no sería útil para la célula, sino que la alta temperatura resultante sería letal. Sin embargo, la vida ha evolucionado adquiriendo mecanismos que regulan la marcha de estas reacciones químicas y una multitud de otras, de modo tal que la energía se almacena en enlaces químicos particulares de los que puede ser liberada en pequeñas cantidades cuando la célula lo necesite. Estos mecanismos, con la aparición de nuevos tipos de moléculas, permiten un aprovechamiento eficaz de la energía sin alterar el delicado equilibrio que caracteriza a los sistemas biológicos. Implican generalmente secuencias de reacciones, algunas de las cuales son reacciones de oxidación-reducción. Aunque cada reacción en la secuencia representa solamente un pequeño cambio en la energía libre, el cambio global de energía libre para la secuencia puede ser considerable.


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2. Usos clínicos de la evaluación de las enzimas estudiadas. LACTATO DESHIDROGENASA LDH: El examen de sangre mide la cantidad de deshidrogenasa láctica (DHL). Razones por las que se realiza el examen La deshidrogenasa láctica (DHL) se mide con mayor frecuencia para verificar daño tisular. La enzima de deshidrogenasa láctica se encuentra en muchos tejidos del cuerpo, especialmente el corazón, el hígado, el riñón, el músculo esquelético, las células sanguíneas del cerebro y los pulmones. La deshidrogenasa láctica (DHL) afecta la reacción química para la conversión del piruvato y el lactato. Los músculos en ejercicio convierten la glucosa en lactato (y los glóbulos rojos la metabolizan). El lactato luego es liberado en la sangre y finalmente absorbido por el hígado, el cual lo convierte de nuevo en glucosa y libera dicha glucosa en la sangre. Los músculos en reposo, los glóbulos rojos y otros tejidos absorben luego esta glucosa. Valores normales Los valores normales pueden variar ligeramente de un laboratorio a otro. Un rango típico es de 105 a 333 UI/L (unidades internacionales por litro). Significado de los resultados anormales Los niveles superiores a los normales pueden ser indicio de: Accidente cerebrovascular (ACV, apoplejía) Ataque cardíaco Anemia hemolítica Presión arterial baja Mononucleosis infecciosa Deficiencia de sangre (Isquemia intestinal ) Enfermedad hepática (por ejemplo, hepatitis) Lesión muscular Distrofia muscular Estados (neoplásicos) de formación anormal de nuevos tejidos Pancreatitis Muerte de tejido (infarto pulmonar) Si se eleva el nivel de DHL, el médico puede ordenar una medición de las isoenzimas de deshidrogenasa láctica. Otras afecciones bajo las cuales se puede realizar el examen son: Anemia por deficiencia de B12 Anemia megaloblástica Anemia perniciosa • • • • • • • • • • • • •

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ASIGNATURA: Bioquímica I CITOCROMO OXIDASA: La enzima citocromo oxidasa cede electrones de un sustrato de oxígeno, en el tren de transportes de electrones. Se usa para diferenciar pseudomonas, oxidasa + enterobacterias, oxidasa -, neisserias. Todas las especies de pseudomonas y neisseria producen la oxidasa que, cuando se encuentra en presencia del oxígeno atmosférico, citocromo C y reactivo oxidasa, oxidan al reactivo para formar un compuesto coloreado. Existen comercialización de discos o tiras de papel ya listo para la determinación. La aparición de una coloración purpura sobre la zona de inoculación se considerara reacción +.

Datos clínicos y análisis clínicos recientes: Niño de 11 años de edad que consulta por torpeza motriz, dificultad en la coordinación de los movimientos y lentitud en su ejecución, retraso escolar y pie cavo derecho. Presenta tics de cierre palpebral de un mes de evolución. Los problemas que tenía el niño se vieron afectadas por déficit de citocromo C oxidada (1). SUCCINATO DESHIDROGENASA El papel fundamental de succinato-coenzima Q reductasa en la cadena de transferencia de electrones de las mitocondrias hace que sea vital en la mayoría de los organismos multicelulares, la eliminación de esta enzima a partir del genoma también se ha demostrado ser letal en la fase embrionaria en ratones. SDHA mutaciones pueden llevar al síndrome de Leigh, encefalopatía mitocondrial, y atrofia óptica. Mutaciones SDHB pueden conducir a la tumorogénesis de células cromafines, causando paraganglioma hereditario y feocromocitoma hereditario. Los tumores tienden a ser maligno. También puede conducir a la disminución de la vida útil y el aumento de la producción de iones superóxido. SDHC mutaciones pueden llevar a una disminución de la vida útil, el aumento de la producción de iones superóxido, paraganglioma hereditario y feocromocitoma hereditario. Los tumores tienden a ser benignos. Estas mutaciones son poco frecuentes. SDHD mutaciones pueden llevar a paraganglioma hereditario y feocromocitoma hereditario. Los tumores tienden a ser benigna, y se producen a menudo en las regiones de cabeza y cuello. Estas mutaciones también pueden disminuir la vida útil y aumentar la producción de iones superóxido.(5) •

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3. Mencione 5 inhibidores respiratorios y precise en qué lugar de la cadena respiratoria ejercen su acción.


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ASIGNATURA: Bioquímica I •

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Cianuro y monóxido de carbono: Inhiben la cadena de transporte de electrones uniéndose más fuertemente que el oxígeno a los centros Fe-Cu en la citocromo c oxidasa, evitando la reducción del oxígeno. Oligomicina inhibe la ATP sintasa, los protones no pueden ser devueltos a la mitocondria. Como resultado, las bombas de protones son incapaces de operar, y el gradiente se torna demasiado fuerte como para ser superado. NADH deja de ser oxidado y el ciclo del ácido cítrico deja de operar porque la concentración de NAD+ cae por debajo de la concentración que estas enzimas pueden utilizar. AntimicinaA, Actúa bloqueando la transferencia de electrones entre el citocromo b y el citocromo c1. En presencia de esta substancia, el citocromo bH puede ser reducido pero no oxidado, y consecuentemente, el citocromo c permanece oxidado, al igual que los citocromos a y a3 del Complejo IV. Malonato y oxaloacetato: Inhibidores competitivos de la succinato dehidrogenasa (complejo II).(3) Barbitú ricos,

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Piericidina A, Rotenona: Sobre la NADH-deshidrogenasa, bloqueando la transferencia de electrones entre la flavina y la ubiquinona. (Inhibidores del complejo I).

4. Mencione 5 aceptores electrónicos artificiales. 1) Ferricianuro: 2) Azul de metileno 3) 2,6 diclorofenolindofenol 4) Menadiona 5) Metasulfato de fenacina


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ASIGNATURA: Bioquímica I REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:

I.

Aznar Soria. SINDROME DE LEIGH POR DEFICIT DE CITOCROMO C OXIDASA: CASO CLINICO. Pediatr 1996; 45:286-288.

II.

Garcia Jose, Sava. Del Carmen. MANUAL TECNICO SUPERIOR DE LABORATORIO DE ANALISIS CLICNOS. Ed MAD; 2004:345-3450.

III.

Melo Virginia. BIOQUIMICA DE LOS PROCESOS METABOLICOS. Ed Reverté. Barcelona; 2007: 205-2010.


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PRESENCIA DE LACTATO DESHIDROGENASA. CITOCROMO OXIDASA Y SUCCÍNICO DESHIDROGENASA

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