DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD DE SUCCINATO DESHIDROGENASA DE Escherichia coli HIPOTESIS Si Escherichia coli tiene mayor afinidad con la glucosa, entonces, al utilizarla como fuente de carbono tendrá un mayor crecimiento que en succinato. Si la enzima succinato deshidrogenasa es inducida con succinato, entonces, hay mayor actividad de la enzima con esta fuente de carbono que la inducida con glucosa. Si se mide la actividad enzimática de la succinato deshidrogenasa por el método de Ells, entonces Escherichia coli no hace una cadena transportadora de electrones natural sino una cadena transportadora de electrones artificial.
DISEÑO EXPERIMENTAL a) Obtención de la Suspensión Celular
Glucosa al 50%
Succinato de Sodio al 25%
Regulador de Fosfatos
Medio de Sypher y Strauss
• Solución que será diluida para preparar los matraces con glucosa como fuente de carbono. • Solución que será diluida para preparar los matraces con succinato como fuente de carbono. • Medio de suspensión para las células inocuo.Ideal para diluciones ó lavados. • Es un medio mínimo con las condiciones necesarias para que cualquier microorganismo crezca.
Se utiliza una cepa silvestre de Escherichia coli, organismo que representa nuestro objeto de estudio, es decir, del cual determinaremos la actividad de succinato deshidrogenasa. Esta cepa se utiliza para inocular 2 matraces que contienen cada uno 50 mL del medio sintético Sypher y Strauss, un medio sintético del cual se conoce las cantidades concretas de las sustancias químicas puras que lo conforman; en el primer ensayo la fuente de carbono es la glucosa, que se encuentra presente en el 1.0% y el en segundo la fuente de carbono es succinato 0.5%. Se incuba a 37°C, en agitación durante 12 horas. Las células se cosechan por centrifugación en condiciones de esterilidad y se lavan y se resuspenden con regulador de fosfatos, el cual mantiene el pH óptimo para la enzima succinato deshidrogenasa. Las suspensiones anteriores se emplean para elaborar una serie de cuatro ensayos: En el primero y segundo ensayo se utiliza un cultivo previo de Succinato, y se emplea como fuente de carbono adicional Succinato 0.5% y Glucosa 1.0%, respectivamente (SS y SG). En el tercer y cuarto ensayo el cultivo previo empleado es Glucosa, y la fuente de carbono adicionada es succinato 0.5% y Glucosa 1.0% respectivamente (GS, GG). En condiciones de esterilidad, se toman alícuotas de 4 mL y se leen las absorbancias a 600nm, al tiempo inicial y final de incubación, de 37°C por 5 horas, contra un blanco (medio de cultivo sin inóculo), esto nos permitirá conocer el efecto de la fuente de carbono en el crecimiento y actividad enzimática de Escherichia coli. b) Efecto de la fuente de Carbono sobre la actividad de la succinato deshidrogenasa.
Celda espectrofotométrica
• Se utilizó una celda espectrofotométrica debido a que se medirá la transmitancia de la solución en un espectrofotómetro
• Éste es un indicador de reacción óxido- reducción que va a actuar como aceptor artificial final de electrones inespecífico al término de la cadena artificial creada 2,6 diclorofenol por medio del método de Ells indofenol
KCN
• Es un inhibidor de la enzima oxidasa terminal que permite que el 2,6 diclorofenil indofenol sea el aceptor final de electrones
• Se utilizó Regulador de Fosfatos con la finalidad de mantener un pH de 7.3 para poder crearse la cadena transportadora de electrones artificial y así mismo, es un Regulador de pH óptimo para medir la actividad de la Succinato Deshidrogenasa Fosfatos
• Se utilizó para realizar el método de Ells en dónde actúa como donador de electrones para llevar a cabo la cadena artificial de transporte y así medir el Succinato de efecto de la fuente de carbono sobre la actividad de succinato deshidrogenasa. Sodio
Metosulfato de Fenazina
Suspensión celular
• Es utilizado como transportador de electrones, ya que acopla la transferencia de electrones entre los nucleótidos de piridina y el 2, 6- diclorofenil indofenol.
• Se utilizaron 4 diferentes suspensiones de células de Escherichia coli crecidas en las siguientes fuentes de carbono : Succinato/Succinato, Succinato/Glucosa, Glucosa/Glucosa y Glucosa/ Succinato, con el fin de medir la actividad de cada uno de succinato deshidrogenasa..
• En seguida que se agregó la suspensión celular, se selló la celda con papel parafilm y se agitó rápidamente para comenzar a llevar a cabo la Mezclar por reacción e inducir la formación de la cadena artificial de transporte. inversión
Lectura
Registrar datos
• Después de haberse mezclado la solución por inversión , inmediatamente se comienza a leer el %T de ésta en un espectrofotómetro previamente calibrado contra un blanco de Regulador de fosfatos.
• Finalmente se registran los datos de %T en un intervalo de 30 segundos por lectura.
Se realiza la determinación de la actividad de la enzima succinato deshidrogenasa de la siguiente manera: Ya que ninguno de los componentes clave puede medirse directamente, la reacción Succinato → Fumarato se medirá mediante la reducción de un aceptor de electrones artificial, el colorante 2,6- diclorofenol indofenol, se añaden 0.25 ml de este colorante a una celda de espectrofotómetro, se adicionan 0.6 ml de KCN para bloquear la trayectoria normal de electrones a través del sistema de transporte de electrones mitocondrial, inhibiendo la transferencia de electrones del citocromo a, al aceptor final de electrones (el oxígeno, se adicionan también a la celda 3.25 ml de regulador de fosfatos para mantener el pH óptimo de la enzima, 1.0 ml de Succinato de sodio como sustrato que la enzima oxidará, 0.4 ml de metosulfato de fenazina, compuesto que actúa como acarreador para garantizar que los electrones sean captados por el aceptor artificial de electrones, y por último se añade 0.5 ml de suspensión celular, que contiene a Escherichia coli, microorganismo del que se pretende lleve a cabo esta cadena artificial de transporte de electrones. Rápidamente la celda se sella con papel parafilm, se mezcla por inversión y se lee el porciento de transmitancia a 600nm contra un blanco de regulador de fosfatos. Leemos en realidad la reducción del colorante (cambio de color azul a incoloro). Se registran lecturas cada 30 segundos por cinco minutos. Este procedimiento se realiza con los 4 ensayos, es decir suspensiones celulares SS, GS, GG y SG.
OBJETIVOS Observar el crecimiento de E. coli al utilizar como fuentes de carbono a succinato y la glucosa. Inducir una cadena artificial de electrones para E. coli y así poder determinar la actividad enzimática de succinato deshidrogenasa. Determinar qué fuente de carbono genera una mayor actividad enzimática en succinato deshidrogenasa.
REGISTRO DE DATOS EFECTO DE LA FUENTE DE CARBONO EN EL CRECIMIENTO DE E. coli Después del desarrollo experimental, se obtuvieron los siguientes datos: Se presentan las absorbancias inicial y final obtenidas a 600 nm, las cuales son un indicativo del crecimiento de Escherichia coli en los distintos cultivos y fuentes de carbono empleadas. *Cabe destacar que este ensayo no se realizo, por lo cual solo no se discutirán técnicas experimentales
TABLA 1 EFECTO DE LA FUENTE DE CARBONO EN EL CRECIMIENTO DE E. COLI. Cultivos previos en:
Matraces con medio base
+ Fuente de carbono
Succinato
1 2 3
Succinato Glucosa Succinato
Glucosa
Crecimiento (Absorbancia a 600nm) Inicial Final 0.712 1.005 0.720 1.200 0.894 1.105
Crecimiento
0.293 0.486 0.211
4
Glucosa
0.889
1.211
0.322
Y, a partir de estos datos, obtenemos la gráfica correspondiente al ensayo: GRÁFICA 1 EFECTO DE LA FUENTE DE CARBONO EN EL CRECIMIENTO DE ESCHERICHIA COLI
0.5 0.45 0.4 0.35 S-S
0.3
S-G 0.25
G-S
0.2
G-G
0.15 0.1 0.05 0 S-S
S-G
G-S
G-G
SS = Cultivo previo en Succinato + adición de Succinato como fuente de carbono. SG = Cultivo previo en Succinato + adición de Glucosa como fuente de carbono. GS = Cultivo previo en Glucosa + adición de Succinato como fuente de carbono. GG = Cultivo previo en Glucosa + adición de Glucosa como fuente de carbono.
EFECTO DE LA FUENTE DE CARBONO SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA SUCCINATO DESHIDROGENASA Se muestran los resultados obtenidos dónde las fuentes de carbono para los cultivos son: S-S: Succinato-succinato. S-G: Succinato-glucosa. G-S: Glucosa-succinato. G-G: Glucosa-glucosa.
TABLA 2 LECTURAS OBTENIDAS DE %T A 600 NM PARA ACTIVIDAD DE SUCCINATO DESHIDROGENASA EN LAS DIFERENTES FUENTES DE CARBONO . TIEMPO
0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300
% DE TRANSMITANCIA A 600 nm DE LAS SUSPENCIONES CELULARES CRECIDAS EN LAS FUENTES DE CARBONO S-S S-G G-S G-G 15.5 15.6 16.2 16.3 17.4 16.5 17.4 19.8 19.5 17.3 17.8 20.8 22.8 18.1 18.6 22 25.5 19.2 19.2 22.8 28.4 16.2 19.5 24 31 17.1 20.6 24.9 34 18.1 21.3 25.9 36.8 18.7 21.7 26.7 40.1 19.3 22.3 27.3 43 19.8 23 28
TABLA 3 DIFERENCIA DE %T A 600 NM PARA SUCCINATO DESHIDROGENASA EN LAS DIFERENTES FUENTES DE CARBONO.
TIEMPO 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300
Δ%T S-S 0 1.9 4 7.3 10 12.9 15.5 18.5 21.3 24.6 27.5
S-G 0 0.9 1.7 2.5 3.6 0.6 1.5 2.5 3.1 3.7 4.2
G-S 0 1.2 1.6 2.4 3 3.3 4.4 5.1 5.5 6.1 6.8
G-G 0 3.5 4.5 5.7 6.5 7.7 8.6 9.6 10.4 11 11.7
GRÁFICA 2 ACTIVIDAD DE LA SUCCINATO DESHIDROGENASA DE E SCHERICHIA COLI CRECIDAS CON FUENTES DE CARBONO GLUCOSA Y SUCCINATO POR EL MÉTODO DE E LLS 30
25
Δ%T a 600nm
20 S-S
15
S-G G-S
10
G-G 5
0 0 -5
50
100
150
200
250
300
350
Tiempo (min)
MANEJO DE DATOS EFECTO DE LA FUENTE DE CARBONO EN EL CRECIMIENTO DE E. coli Para el ensayo del efecto de la fuente de carbono en el crecimiento de E. coli: Graficamos el crecimiento obtenido en cada uno de los diferentes ensayos con cultivos previos y fuentes de carbono adicionales, para esto obtenemos el ∆ de absorbencia, el cual corresponderá al crecimiento total para cada ensayo: Matraz con cultivo previo en Succinato + Succinato como fuente de carbono: ∆Abs600nm = A600nm final - A600nm inicial ∆Abs600nm = 1.005 – 0.712 ∆Abs600nm = 0.293
Matraz con cultivo previo en Succinato + Glucosa como fuente de carbono: ∆Abs600nm = A600nm final - A600nm inicial ∆Abs600nm = 1.200–0.720 ∆Abs600nm = 0.486
Matraz con cultivo previo en Glucosa + Succinato como fuente de carbono: ∆Abs600nm = A600nm final - A600nm inicial ∆Abs600nm = 1.105 – 0.894 ∆Abs600nm = 0.211
Matraz con cultivo previo en Glucosa +Glucosa como fuente de carbono: ∆Abs600nm = A600nm final - A600nm inicial ∆Abs600nm = 1.211–0.889 ∆Abs600nm = 0.322
EFECTO DE LA FUENTE DE CARBONO SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA SUCCINATO DESHIDROGENASA Se obtuvo la diferencia del % de transmitancia para cada cultivo cada treinta segundos durante 5 minutos a partir de los resultados registrados de la tabla 1.
EJEMPLO: Para el cultivo de succinato-succinato:
A Continuación se muestra el comportamiento que se espera obtener en la medición de la actividad de succinato deshidrogenasa para cada una de las condiciones de cultivo por el método de Ells. Gráfica. 3 Comportamiento Esperado de la actividad de succinato deshidrogenasa, medido como porcentaje de transmitancia en funcion del tiempo para cada una de las condiciones de cultivo 12
10
8
gluc - succ
% Ts
succ - gluc gluc - gluc
6
succ - succ 4
2
Tiempo (seg)
0 0
50
100
150
200
250
300
DISCUSIÓN Según los resultados de efecto de la fuente de carbono en el crecimiento de E. coli, se observa que la bacteria si puede incorporar succinato a su metabolismo 1, ya que sí presento crecimiento en este medio de cultivo. La bacteria creció mejor en glucosa que en succinato ya que la absorbencias iniciales de los matraces 3,4 son mayores que las absorbencias de los matraces 1,2, (tabla 1) esto se debe a que el uso de glucosa como sustrato utiliza dos vías centrales en condiciones aerobias, la glicolisis y el ciclo de Krebs, lo cual genera un mayor poder reductor que se verá reflejado en mayor síntesis de ATP 2, mientras que el succinato es un sustrato que se va a incorporar en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos, pero produciendo menor poder reductor 3 . El mecanismo para que E. coli incorpore succinato a su metabolismo requiere una fase de adaptación de mayor tiempo, ya que como se observo el cultivo sí presento crecimiento en succinato pero de manera más lenta en comparación con las células crecidas en glucosa 4. El cambio en la fuente de carbono afecto el crecimiento celular ya que las lecturas finales de absorbencia de los matraces 1,2 y 3,4 no son iguales. En el matraz 2 (succinato - glucosa) Se observa que el crecimiento se acelero mas al cambiar las células pre incubadas en succinato por otra fuente de carbono como glucosa, esta observación es notoria si restamos las absorbencias iniciales de las finales (los valores son de M1 =0.293 y M2 =0.486), mientras que para el matraz 1 donde no se cambio la fuente de carbono, las células continuaron replicándose pero de una manera un tanto más constante. En los resultados del segundo par de matraces (3,4) se presento un mejor crecimiento en glucosa – glucosa, comparado con el crecimiento glucosa – succinato, los valores de absorbencia iniciales son similares pero al cambiar la fuente de carbono, el crecimiento en succinato fue afectado disminuyendo (matraz 3 Abs = 1.105) en comparación con el de las células crecidas en glucosa (matraz 4 Abs = 1.211).La succinato deshidrogenasa es una enzima que está presente en procesos en la última parte del ciclo de Krebs, una conversión de succinato a fumarato, la des hidrogenación depende de FAD . Esta enzima está unida a la membrana de E. coli y pasa los electrones del succinato a la CoQ, por medio del FAD para permitir que se lleva a cabo la fosforilación oxidativa. 5 En los resultados de actividad de la enzima succinato deshidrogenasa se observa que la enzima de la bacteria presenta una mayor actividad cuando E. coli creció en los medios de cultivo succinato – succinato. También se observa que para el crecimiento en los medios de cultivo succinato – glucosa se vio afectada la actividad de la succinato deshidrogenasa, pero no de manera determinante, es decir, que la enzima si presento actividad, si esta actividad se compara con las de enzimas de las células que crecieron en glucosa – succinato podemos decir que la tendencia de éstas rectas fueron muy parecidas. Para los ensayos de acuerdo a la bibliografía, se reporta que la actividad de la succinato deshidrogenasa se ve reprimida cuando E. coli es crecida en un medio que contiene glucosa, pero además esta enzima incrementa su actividad cuando en el medio de cultivo existe succinato como la principal fuente de carbono 6. Si succinato deshidrogenasa es una enzima reprimible, se debe tener una clara disminución en la actividad de la enzima para el crecimiento en glucosa – glucosa y un aumento en el porciento de transmitancia (cuantificación de la actividad) para el ensayo de succinato – succinato. . En el caso de los otros dos ensayos se esperaba un comportamiento similar, de valores de porcentaje de absorbencia entre los de succinato – succinato y glucosa – glucosa, se realizo una tendencia de estos datos, representados en el gráfico 3.
La metodología por la cual se determino la actividad de la enzima es un conjunto de reacciones de oxido reducción que conforman una cadena de transporte de electrones artificial, donde el ultimo aceptor de electrones fue el 2,6-diclorofenol indofenol, que genero un color verde 7, para que posteriormente se leyera la absorbencia en un espectrofotómetro, donde para el ensayo de glucosa – glucosa se presento una desviación muy notable en nuestros resultados, esto lo podemos atribuir a que como equipo tuvimos un error experimental en confundir las celdas en donde se midió esta actividad al agregar en vez de células de glucosa-glucosa a su celda correspondiente, agregamos otras células crecidas en succinato-glucosa. La tendencia de las graficas obtenidas no concuerda con lo reportado en la bibliografía 6 ya que como se dijo se presentaron errores experimentales, sobre todo en el ensayo donde utilizamos a las células crecidas en glucosa-glucosa cuyo valor debería ser muy diferente, pero cabe destacar que las condiciones de las células con las cuales se trabajo, no eran conocidas, ya que como se menciono en el registro de datos solo realizo la determinación de la actividad enzimática y no se incubaron estas. Por otro lado al ser un método indirecto y colorimétrico las interferencias inherentes al método, y, a los errores del espectrofotómetro fueron eliminadas mediante el tratamiento de datos. Los resultados del método realizado, el cual era la formación de una cadena artificial para medir la actividad de la enzima succinato deshidrogenasa, no son satisfactorios como se esperaba, ya que aunque estos resultados muestran que la enzima es inducible por la presencia de succinato no muestra que sea reprimible por la presencia de glucosa.
CONCLUSIONES E. coli presenta un alto crecimiento en un medio que contiene células incubadas en succinatoglucosa. E. coli presenta un buen crecimiento en un medio de glucosa-glucosa comprado con el crecimiento en succinato-succinato. El crecimiento de E. coli disminuye con la presencia de succinato como principal fuente carbono y aumenta si la fuente de carbono es glucosa. Se determinó que la mejor fuente de carbono que genera una mayor actividad enzimática de succinato deshidrogenasa en E. coli fue cuando se utilizó sólo Succinato. No obtuvieron resultados que demuestren que la enzima succinato deshidrogenasa de E.coli sea inducible según la fuente de carbono presente en el medio.
Bibliografía 1. 2. 3. 4. 5.
J. Monza, S. Doldan y S. Signorelli. Ciclo De Krebs http://www.unavarra.es/genmic/metabolismo/glucolisis.htm Mary K. Campbell, Shawn O. Farrell. Bioquímica. Edit. CENGAGE Learning. Pág 560 – 565. Curso Químico Biológico en Línea de la UCV: http://www.bioquimicaqui11601.ucv.cl/ Christopher k. Mathew kensal e. Van hole kevin g. Ahern. Pearson. Bioquimica 3a edit. 586 587 6. J. Rufz Herrera y L. G. García. Marzo 1972. Regulation of succinate dehydrogenase in escherichia coli . Departamento de microbiología, Escuela nacional de ciencias biológicas, instituto politécnico nacional, México 17, D. F. 7. H. Alan Ells. A colorimetric Method for the Assay of Succinic Dehydrogenase and Pyridineucleoticde – Linked Deshudrogenases .
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
BIOQUÍMICA MICROBIANA DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD DE SUCCINATO DESHIDROGENASA DE Escherichia coli ALUMNOS: ALVARADO RODRÍGUEZ DIANA KAREN MARTÍNEZ PINEDA MICHELLE RODRÍGUEZ RAMÍREZ ALEJANDRA GRUPO: 5IV1 SECCIÓN: 1 EQUIPO: 1
FECHA DE ENTREGA DE INFORME: 13/03/14
