[Práctica 3: Cinética Enzimática de la Glucosa-Oxidasa] Glucosa-Oxidasa]
Introducción a la Biotecnología
RESUMEN El presente reporte está elaborado en miras a focalizar y entender la aplicación del método método experimental en lo que refiere a la verificación de mediciones haciendo uso del modelo de Michaelis-Menten para una reacción química a través del estudio de la catálisis enzimática para la enzima “glucosa-oxidasa” al preparar soluciones con diferentes concentraciones de glucosa (50, 100, 500, 1000, 2000, 3000 y 4000 ppm), donde en los frascos del espectrofotómetro a 10μL de
solución de glucosa se le añadían 10 ml de reactivo enzimático(Glucosa Oxidasa) para todas las soluciones de las diferentes concentraciones preparadas, luego en un frasco aparte se preparó el blanco para la realización de la curva de calibración, el cual se preparó usando 10 ml de reactivo enzimático con 100μL de agua destilada, para cada solución de las diferentes concentraciones se dio un tiempo de reacción de 45 minutos a 25ºC y se tomaba la lectura de la absorbancia cada 5 min. hasta llegar a 30 min. y luego hasta 45 min. Luego, con los datos de absorbancia obtenidos para las diferentes concentraciones se elaboró la curva de calibración y el cálculo de las concentraciones de quinoneimina producidas existentes existentes en cada tiempo “t” junto con el cálculo de
la velocidad de aparición de ésta y la velocidad de desaparición de la glucosa, para después establecer para cada concentración los parámetros de Michaelis-Menten que se muestran en los cálculos mostrados en éste reporte.
INTRODUCCIÓN TEÓRICA
la aparición de los productos desaparición de los reactivos.
La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Estos estudios proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción catalítica y de la especifidad de la enzima. 1
Al seguir la velocidad de aparición de producto (o de desaparición del sustrato) en función del tiempo se hace el estudio de la cinética de la reacción. A medida que la reacción transcurre, la velocidad de acumulación del producto va disminuyendo porque se va consumiendo el sustrato de la reacción. Para evitar esta complicación se procede a medir la velocidad inicial de la reacción (v0). La velocidad inicial de la reacción es igual a la pendiente de la curva de avance a tiempo cero. De esta forma, la medida de v0 se realiza antes de que se consuma el parte del total del sustrato, de forma que pueda considerarse la [S] como esencialmente constante a lo largo del experimento.2
La velocidad de una reacción catalizada por una enzima puede medirse con relativa facilidad. La medida se realiza siempre en las condiciones óptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc, y se utilizan concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de reacción observada es la velocidad máxima. La velocidad puede determinarse bien midiendo
o
la
1
PRODUCTION AND APPLICATION OF ENZYME http://www.biosimex.co http://www.biosimex.com.mx/pdf/in m.mx/pdf/insertos%20dedic sertos%20dedic ados/Quimica%20clinica/12503 ados/Quimica%20clinica/12503%20glucosa.pdf %20glucosa.pdf
2
Mier, Geraldine; Rhodes, V.J.; Maharg, Leta; Webb, Nancy, S; et al.: BEEF TENDERIZATION WITH
1
[Práctica 3: Cinética Enzimática de la Glucosa-Oxidasa] Además, en estas condiciones no es necesario considerar la reacción inversa, ya que la cantidad de producto formada es tan pequeña que la reacción inversa apenas ocurre. De esta forma se simplifican enormemente las ecuaciones de velocidad.
En otras palabras:
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Una forma práctica de linealizar los datos es haciendo uso de la gráfica de LineweaverBurk, que es la forma más común de mostrar los datos cinéticos. Para ello, se toman los valores inversos a ambos lados de la ecuación de Michaelis-Menten, el resultado de este tipo de representación es una línea recta cuya ecuación es y = mx + c, siendo el punto de corte entre la recta y el eje de ordenadas equivalente a 1/Vmax, y el punto de corte entre la recta y el eje de abscisas equivalente a -1/K m.4
[S]= concentración del sustrato [P]= concentración del producto [v0]= velocidad inicial + = aparición de producto - = desaparición de sustrato Se ha tomado el supuesto que la enzima usada en la práctica (Glucosa-Oxidasa) se comporta según el modelo de cinética de Michaelis-Menten de donde se deduce la siguiente ecuación:
Fig. 1: La recta obtenida de la linealización es la pendiente que representa a: Km/Vmax, el intercepto es equivalente a 1/Vmax de la reacción enzimática.
La ecuación es la base de la mayoría de las cinéticas enzimáticas de sustrato único. La constante de Michaelis K m se define como la concentración a la que la velocidad de la reacción enzimática es la mitad de la V max.3
PROTELYITIC ENZYMES; E.E.U.U.; Food Tech; p.16,111; Dairy Sci. Abstracts; p.23,197. 3
Murray, Robert; Granner, Daryl; Rodwell, Victor; Mayes, Peter; 1997; BIOQUÍMICA DE HARPER; México; Editorial El Manual Moderno; p.77-93. http://www.biosimex.com.mx/pdf/insertos%20dedic ados/Quimica%20clinica/12503%20glucosa.pdf
El reactivo enzimático del que se hará uso contiene dos enzimas: Glucosa-Oxidasa (GOD), la cual se hidroliza a ácido glucónico 4
Murray, Robert; Granner, Daryl; Rodwell, Victor; Mayes, Peter; 1997; BIOQUÍMICA DE HARPER; México; Editorial El Manual Moderno; p.93-98. Mier, Geraldine; Rhodes, V.J.; Maharg, Leta; Webb, Nancy, S; et al.: BEEF TENDERIZATION WITH PROTELYITIC ENZYMES; E.E.U.U.; Food Tech; p.16,111; Dairy Sci. Abstracts; p.23,197.
2
[Práctica 3: Cinética Enzimática de la Glucosa-Oxidasa]
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y Peroxidasa (POD), que comprueba la presencia de peróxido de hidrógeno. De donde luego ocurren las siguientes reacciones:
La segunda reacción antes mostrada ocurre tan rápido que podemos suponer que la velocidad de aparición de la quinoneimina es igual a la velocidad de consumo de glucosa y es igual a la velocidad de aparición de peróxido de hidrógeno, la velocidad de aparición de la quinoneimina la mediremos en el espectrofotómetro de UV visible y de aquí partiremos para hacer el cálculo de las demás variables.5
5
http://www.uco.es/organiza/departamentos/b ioquimica-biolmol/pdfs/08III%20ESPECTROFOTOMETRÍA.pdf Murray, Robert; Granner, Daryl; Rodwell, Victor; Mayes, Peter; 1997; BIOQUÍMICA DE HARPER; México; Editorial El Manual Moderno; p.99-110.
3
[Práctica 3: Cinética Enzimática de la Glucosa-Oxidasa]
MÉTODOS Materiales utilizados:
Espectrofotómetro de UV visible. Celda para espectrofotómetro. Frascos volumétricos de 500ml. Pipeta graduada de 1 mL. Pipeta graduada de 10mL. Perilla de succión.
Reactivos:
Reactivo enzimático (Glucosa Oxidasa y Glucosa Peroxidasa). Solución de Glucosa. Agua destilada.
Procedimiento: Aviso previo a la realización de la práctica: Se tuvo presente la pureza del reactivo de trabajo, éste debía encontrarse sin nada que lo contamine, ya que los oxidantes dan color al mismo permitiendo el acrecentamiento de blancos, los reductores disminuyen la respuesta de color y los detergentes, metales pesados y cianuros son inhibidores de enzimas. Evitando todo contacto con la piel y membranas mucosas. Preparación de la curva de calibración: 1. Se prepararon soluciones de glucosa anhidra con las concentraciones a continuación: 50, 100, 500, 1000, 2000, 3000, 4000 ppm. 2. En los frascos de uso para el espectrofotómetro, se añadió a
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a cabo para todas las concentraciones que se prepararon en el paso no. 1. 3. En otro frasco de uso en el espectrofotómetro, se preparó una solución de 10 ml de reactivo enzimático
con
100μL
de
agua
destilada; éste fue usado para tomar el blanco de la curva de calibración. 4. Se dejó que la reacción transcurriera en un tiempo de 45 min. a T=25ºC, donde se tomaba lectura de la absorbancia para cada concentración en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 500nm. 5. Luego transcurridos los 45 min. y haber hecho la toma de datos, se llenó la primera tabla de datos de absorbancia proporcionada. Obtención de datos para la elaboración de la curva de cinética química: 1. Nuevamente
se
prepararon
las
soluciones “glucosa + reactivo enzimático” y el “blanco” como fue
detallado en el procedimiento de elaboración de la curva de calibración. De las soluciones de glucosa-reactivo enzimático se tuvieron que preparar desde la concentración de 50ppm hasta 3000ppm, exceptuando la última de 4000ppm. 2. Para cada concentración preparada, se iba tomando el dato de absorbancia en lapsos de tiempo de 5 min. por lectura hasta llegar a 30 min. y luego una última lectura de absorbancia en 45 min. para luego llenar la segunda tabla de datos de absorbancia dada.
100μL de solución de glucosa, 10ml
de reactivo enzimático. Esto se llevó
4
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CÁLCULOS Y RESULTADOS
Ahora bien los datos obtenidos son:
Para medir la disminución de la concentración de la glucosa tomaremos como base la reacción secundaria de producción de quinoneimina, que es un compuesto coloreado de rojo, del cual podemos medir su concentración en la solución usando un espectrofotómetro de absorción de UV visible.
Concentración Inicial de Glucosa en ppm 0 50 100 500 2000 3000 4000
La glucosa es oxidada por la enzima glucosa oxidasa (GOD) para formar un compuesto orgánico y peróxido de hidrógeno, luego el peróxido junto con un tinte incoloro y fenol, por la acción de la enzima peroxidasa (POD), son transformados a quinoneimina y agua (ver sistema de reacciones 1). Glucosa +
2+
2O
6
12
7
+
2
2
2 H2 O2 + Tinte Incoloro + Fenol
Quinoneimina + 4
2
La segunda reacción es casi inmediata por lo que la velocidad de producción de quinoneimina está determinada por la formación de peróxido de la primera reacción. Por esta razón se puede asumirse que la velocidad de formación del complejo coloreado es igual a la velocidad de formación del peróxido de hidrógeno y esta a su vez es igual a la velocidad de desaparecimiento de glucosa (sustrato de la GOD).
Absorbancia de la Quinoneimina 0 0,3676 0,396 0,5894 1,0434 1,2546 1,5173
Tabla 1: Datos para la curva de calibración. [G] (ppm)
5 min
50 100 500 1000 2000 3000
0,3620 0,3849 0,5384 0,9689 0,9497 1,0934
Datos de Absorbancia 10 15 20 25 min min min min 0,3656 0,3667 0,3670 0,3671 0,3926 0,3939 0,3942 0,3954 0,5811 0,5889 0,5909 0,5917 1,1076 1,1402 1,1467 1,1480 1,0298 1,0454 1,0479 1,0482 1,2275 1,2559 1,2626 1,2646
30 min 0,3673 0,3954 0,5964 1,1481 1,0470 1,2625
Tabla 2: Datos de absorbancia en el tiempo a diferentes concentraciones iniciales de glucosa [G].
Podemos calcular la curva de calibración en términos de la concentración de la quinoneimina [Q]. Sabemos por estequiometria que por cada mol que se produce de quinoneimina, se necesitan 2 moles de peróxido y por tanto 2 moles de glucosa para formarlo, entonces:
1
= [ ] 2
=
1
Xo ppm de Glucosa mg g de Glucosa 2 1000 × 180 g mol Xo ppm mol = (Ec.1) 360000 Lt
5
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[Práctica 3: Cinética Enzimática de la Glucosa-Oxidasa] Con esto podemos formar una nueva tabla:
Para Xo de 50 ppm de glucosa:
Concentración de la Glucosa (en ppm) 0 50 100 500 2000 3000 4000
Concentración Quinoneimina Absorbancia (mol/Lt) 0 0 0,000138889 0,3676 0,000277778 0,396 0,001388889 0,5894 0,005555556 1,0434 0,008333333 1,2546 0,011111111 1,5173 Tabla 3: Datos para la gráfica de la curva de calibración.
Concentración Inicial de 50 ppm de Glucosa Tiempo (min) 0 5 10 15 20 25 30
Absorbancia Concentración de Q de Q (mol/Lt) 0 -0,000009 0,362 0,000189295 0,3656 0,000200524 0,3667 0,000203995 0,367 0,000204945 0,3671 0,000205262 0,3673 0,000205896 Tabla 4: Variación de la concentración de quinoneimina [Q] en el tiempo para una concentración inicial de 50 ppm de glucosa [G].
Graficando y obteniendo la curva de regresión más ajustada tenemos: Curva de Calibración de Absorbancia vrs Concentración Molar de Q
Variación de Q vrs t G inicial = 50 ppm
[Q] = -0.0026abs4 + 0.0049abs3 + 0.0045abs2 0.0016abs - 9E-06 R² = 0.9997
0.012 0.01
0.00025 0.0002
0.008 ) t L / l o m ( Q
) t L / l o m ( Q
0.006 0.004
0.00015 0.0001 0.00005
0.002
0 -0.00005 0
0 -0.002
[Q] = 2E-10t5 - 2E-08t4 + 7E-07t3 - 1E-05t2 + 8E-05t - 9E-06 R² = 0.9992
0
0.5
1
1.5
Absorbancia
Gráfico 1: Curva de Calibración con la curva de mejor ajuste.
Ahora tenemos una ecuación para encontrar [Q] a partir de la absorbancia con muy buena aproximación:
− − − −
= 0,0045
4 3 0,002 + 0,0049 + 2 0,0016 9 × 1 0 06
5
10
15
20
25
30
35
Tiempo (min)
2
Gráfico 2: Concentración de Q en el tiempo con la curva de mejor ajuste.
De donde obtenemos la curva de mejor ajuste siguiente:
− − −− − −−−
10
7
=2×10 3 1×10
10 5 5
2×10 8 2 +8×10 5
(Ec. 3)
4
+7× 9×10
−
6
(Ec. 2)
Entonces con los datos de la tabla 2 obtenemos para cada concentración inicial de glucosa:
6
[Práctica 3: Cinética Enzimática de la Glucosa-Oxidasa] Luego para Xo de 100 ppm de glucosa:
Luego para Xo de 500 ppm de glucosa:
Concentración Inicial de 100 ppm de Glucosa Tiempo (min)
Absorbancia de Q
Concentración Inicial de 500 ppm de Glucosa
Concentración de Q (mol/Lt)
0 5 10 15 20 25 30
0 -0,000009 0,3849 0,00026417 0,3926 0,000291192 0,3939 0,000295846 0,3942 0,000296924 0,3954 0,000301249 0,3954 0,000301249 Tabla 5: Variación de la concentración de quinoneimina [Q] en el tiempo para una concentración inicial de 100 ppm de glucosa [G].
Tiempo (min)
Absorbancia de Q
) t L / l o m ( Q
0 -0,000009 0,5384 0,00098026 0,5811 0,001245819 0,5889 0,001297405 0,5909 0,001310784 0,5917 0,001316153 0,5964 0,001347896 Tabla 6: Variación de la concentración de quinoneimina [Q] en el tiempo para una concentración inicial de 500 ppm de glucosa [G]. Variación de Q vrs t G inicial = 500 ppm
) t L / l o m ( Q
5
10
15
[Q] = -4E-09t4 + 3E-07t3 - 8E-06t2 + 9E-05t - 7E-06 R² = 0.994
20
25 30 Tiempo (min)
De donde obtenemos la curva de mejor ajuste siguiente:
−− − − − − −− = 4×10 9 4 +3×10 7 3 10 6 2 + 9 × 1 0 5 7×10
35
0.0016 0.0014 0.0012 0.001 0.0008 0.0006 0.0004 0.0002 0 -0.0002 0
[Q] = -1E-08t4 + 8E-07t3 - 2E-05t2 + 0.0003t - 5E-06 R² = 0.9991
5
10
15
20
25
30
35
Tiempo (min)
Gráfico 3: Concentración de Q en el tiempo con la curva de mejor ajuste.
(Ec. 4)
Concentración de Q (mol/Lt)
0 5 10 15 20 25 30
Variación de Q vrs t G inicial = 100 ppm 0.00035 0.0003 0.00025 0.0002 0.00015 1E-04 5E-05 -1E-19 -5E-05 0
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6
8×
Gráfico 4: Concentración de Q en el tiempo con la curva de mejor ajuste.
De donde obtenemos la curva de mejor ajuste siguiente:
−− − − − − −− = 1×10 8 4 +8×10 7 3 10 5 2 + 3 × 1 0 4 5×10
2×
6
(Ec. 5)
7
[Práctica 3: Cinética Enzimática de la Glucosa-Oxidasa] Luego para Xo de 1000 ppm de glucosa:
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Luego para Xo de 2000 ppm de glucosa:
Concentración Inicial de 1000 ppm de Glucosa
Concentración Inicial de 2000 ppm de Glucosa
Tiempo (min) 0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (min) 0 5 10 15 20 25 30
Absorbancia de Q 0 0,9689 1,1076 1,1402 1,1467 1,148 1,1481
Concentración de Q (mol/Lt) -0,000009 0,004830775 0,0064844 0,00688594 0,006966297 0,006982377 0,006983614
Absorbancia de Q 0 0,9497 1,0298 1,0454 1,0479 1,0482 1,047
Tabla 8: Variación de la concentración de quinoneimina [Q] en el tiempo para una concentración inicial de 2000 ppm de glucosa [G].
Tabla 7: Variación de la concentración de quinoneimina [Q] en el tiempo para una concentración inicial de 1000 ppm de glucosa [G]. Variación de Q vrs t G inicial = 1000 ppm
) t L / l o m ( Q
0.008 0.007 0.006 0.005 0.004 0.003 0.002 0.001 0 -0.001 0
Variación de Q vrs t G inicial = 2000 ppm
) t L / l o m (
[Q] = -4E-08t4 + 4E-06t3 - 0.0001t2 + 0.0014t + 3E-07 R² = 0.9998 5
10
15
20
25
30
35
Q
0.007 0.006 0.005 0.004 0.003 0.002
[Q] = -6E-08t4 + 5E-06t3 - 0.0001t2 + 0.0014t + 2E-05 R² = 0.9977
0.001 0 -0.001 0
5
10
Tiempo (min)
Gráfico 5: Concentración de Q en el tiempo con la curva de mejor ajuste.
De donde obtenemos la curva de mejor ajuste siguiente:
−− = 10
− − − −− 8 4
6 3
4×10 +4×10 1× 3 7 +1,4×10 +3×10
4 2
(Ec. 6)
Concentración de Q (mol/Lt) -0,000009 0,004612282 0,005542709 0,005729074 0,005759072 0,005762674 0,005748269
15
20
25
30
35
Tiempo (min)
Gráfico 6: Concentración de Q en el tiempo con la curva de mejor ajuste.
De donde obtenemos la curva de mejor ajuste siguiente:
−− − − − −− = 10
6×10 8 4 +5×10 6 3 1 × 4 2 +1,4×10 3 + 2 × 1 0 5
(Ec. 7)
8
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[Práctica 3: Cinética Enzimática de la Glucosa-Oxidasa] Luego para Xo de 3000 ppm de glucosa:
Derivando la Ec. 3:
− − − − − − − =1×10
Concentración Inicial de 3000 ppm de Glucosa Tiempo (min) 0 5 10 15 20 25 30
Absorbancia de Q 0 1,0934 1,2275 1,2559 1,2626 1,2646 1,2625
10
−
Tiempo (min) 0 5 10 15 20 25 30
0.006 0.004 [Q] = -7E-08t4 + 6E-06t3 - 0.0002t2 + 0.0019t + 2E05 R² = 0.9991
-0.002 0
5
10
15
20
25
30
Tiempo (min)
Gráfico 7: Concentración de Q en el tiempo con la curva de mejor ajuste.
De donde obtenemos la curva de mejor ajuste siguiente:
−− − − − −− = 10
7×10 8 4 +6×10 6 3 2 × 4 2 +1,9×10 3 + 2 × 1 0 5
(Ec. 8)
Para conocer la velocidad de reacción inicial debemos derivar la expresión obtenida de la regresión de curva de mejor ajuste y evaluarla en el tiempo 0, así:
+8×10
5
2×
=
[ ]
Concentración Inicial de 50 ppm de Glucosa
0.008
0
+2,1×
Entonces podemos obtener la siguiente tabla evaluando para cada tiempo t:
0.01
0.002
2×10
5
8 3
Después para obtener la velocidad de desaparición de la glucosa hacemos la relación de la estequiometria:
Variación de Q vrs t G inicial = 3000 ppm
Q
8×10
(Ec. 9)
Concentración de Q (mol/Lt) -0,000009 0,006310506 0,007967348 0,008317459 0,008399711 0,008424232 0,008398484
Tabla 9: Variación de la concentración de quinoneimina [Q] en el tiempo para una concentración inicial de 3000 ppm de glucosa [G].
) t L / l o m (
6 2
9 4
35
Velocidad de Q (M/ min) 0,000080 0,000223 0,000420 0,000633 0,000840 0,001033 0,001220
Velocidad de G 1 x (M/min) 0,000160 0,000446 0,000840 0,001266 0,001680 0,002066 0,002440
Tabla 10: Velocidad de reacción de aparición de la quinoneimina [Q] y de conversión de la glucosa [G] en el tiempo para una concentración inicial de 50 ppm de glucosa [G].
Ahora si graficamos los datos obtenemos: Velocidad de Reacción d[G]/dt vrs t [G] inicial = 50 ppm ) i ] n G m [ / e M d ( r x 1 -
3.0E-03 2.5E-03 2.0E-03 1.5E-03 1.0E-03 5.0E-04 0.0E+00 0
10
20
30
40
Tiempo (min)
Gráfico 8: Velocidad de reacción en función de la glucosa versus el tiempo en minutos.
9
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[Práctica 3: Cinética Enzimática de la Glucosa-Oxidasa] Luego, haciendo lo mismo para las demás concentraciones iniciales: Derivando la Ec. 5: Derivando la Ec. 4:
=
− −− 1,6× 10 10
5
8 3
− − −
+9×10
+9×10
(Ec. 10)
7 2
1,6×
5
Concentración Inicial de 100 ppm de Glucosa
=
− −− 4×10 10
8 3
5
− − −
+ 2,4 × 10
+3×10
(Ec. 11)
6 2
4×
4
Concentración Inicial de 500 ppm de Glucosa
Tiempo (min)
Velocidad de Q (M/ min)
Velocidad de G 1 x (M/min)
Tiempo (min)
Velocidad de Q (M/ min)
Velocidad de G -1 x (M/min)
0 5 10 15 20 25 30
0,000090 0,000031 0,000004 -0,000002 0,000002 0,000002 -0,000012
0,000180 0,000061 0,000008 -0,000003 0,000004 0,000005 -0,000024
0 5 10 15 20 25 30
0,000300 0,000155 0,000100 0,000105 0,000140 0,000175 0,000180
0,000600 0,000310 0,000200 0,000210 0,000280 0,000350 0,000360
Tabla 11: Velocidad de reacción de aparición de la quinoneimina [Q] y de conversión de la glucosa [G] en el tiempo para una concentración inicial de 100 ppm de glucosa [G].
Tabla 12: Velocidad de reacción de aparición de la quinoneimina [Q] y de conversión de la glucosa [G] en el tiempo para una concentración inicial de 500 ppm de glucosa [G]. Velocidad de Reacción d[G]/dt vrs t [G] inicial = 500 ppm
Velocidad de Reacción d[G]/dt vrs t [G] inicial = 100 ppm 2.0E-04 ) n ] i m G / [ e ( M d r x 1 -
1.5E-04
) n ] i G m [ / e M d ( r x 1 -
1.0E-04 5.0E-05 0.0E+00 -5.0E-05 0
10
20
30
40
Tiempo (min)
Gráfico 8: Velocidad de reacción en función de la glucosa versus el tiempo en minutos.
7.0E-04 6.0E-04 5.0E-04 4.0E-04 3.0E-04 2.0E-04 1.0E-04 0.0E+00 0
10
20
30
40
Tiempo (min)
Gráfico 9: Velocidad de reacción en función de la glucosa versus el tiempo en minutos.
10
[Práctica 3: Cinética Enzimática de la Glucosa-Oxidasa] Derivando la Ec. 6:
=
Derivando la Ec. 7:
− − − 1,6× 10 10
4
Introducción a la Biotecnología
7 3
+1,2×10
+1,4×10
(Ec. 12)
−
3
− − 5 2
2×
=
− − − 2,4× 10 10
4
7 3
+1,5×10
+1,4×10
(Ec. 13)
−
3
− − 5 2
2×
Concentración Inicial de 1000 ppm de Glucosa
Concentración Inicial de 2000 ppm de Glucosa
Tiempo (min) 0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (min) 0 5 10 15 20 25 30
Velocidad de Q (M/ min) 0,001400 0,000680 0,000440 0,000560 0,000920 0,001400 0,001880
Velocidad de G 1 x (M/min) 0,002800 0,001360 0,000880 0,001120 0,001840 0,002800 0,003760
Tabla 13: Velocidad de reacción de aparición de la quinoneimina [Q] y de conversión de la glucosa [G] en el tiempo para una concentración inicial de 1000 ppm de glucosa [G].
Velocidad de Reacción d[G]/dt vrs t [G] inicial = 2000 ppm
4.0E-03 3.5E-03 3.0E-03 2.5E-03 2.0E-03 1.5E-03 1.0E-03 5.0E-04 0.0E+00
) n ] i m G [ / e M ( d r x 1 -
0
10
20
30
Velocidad de G -1 x (M/min) 0,002800 0,001490 0,001320 0,001930 0,002960 0,004050 0,004840
Tabla 14: Velocidad de reacción de aparición de la quinoneimina [Q] y de conversión de la glucosa [G] en el tiempo para una concentración inicial de 2000 ppm de glucosa [G].
Velocidad de Reacción d[G]/dt vrs t [G] inicial = 1000 ppm
) n ] i m G [ / e M d ( r x 1 -
Velocidad de Q (M/ min) 0,001400 0,000745 0,000660 0,000965 0,001480 0,002025 0,002420
40
Tiempo (min)
Gráfico 10: Velocidad de reacción en función de la glucosa versus el tiempo en minutos.
6.0E-03 5.0E-03 4.0E-03 3.0E-03 2.0E-03 1.0E-03 0.0E+00 0
10
20
30
40
Tiempo (min)
Gráfico 11: Velocidad de reacción en función de la glucosa versus el tiempo en minutos.
11
[Práctica 3: Cinética Enzimática de la Glucosa-Oxidasa] Derivando la Ec. 8:
=
− − − 2,8× 10 10
4
7 3
+1,8×10
+1,9×10
(Ec. 14)
−
3
− − 5 2
4×
Concentración Inicial de 3000 ppm de Glucosa Tiempo (min)
Velocidad de Q (M/ min)
Velocidad de G 1 x (M/min)
0 5 10 15 20 25 30
0,001900 0,000315 -0,000580 -0,000995 -0,001140 -0,001225 -0,001460
0,003800 0,000630 -0,001160 -0,001990 -0,002280 -0,002450 -0,002920
Tabla 15: Velocidad de reacción de aparición de la quinoneimina [Q] y de conversión de la glucosa [G] en el tiempo para una concentración inicial de 3000 ppm de glucosa [G].
Velocidad de Reacción d[G]/dt vrs t [G] inicial = 3000 ppm
4.0E-03 2.0E-03 0.0E+00 -2.0E-03 0 -4.0E-03
10
20
30
Ahora que tenemos las velocidades iniciales a diferentes concentraciones graficamos el inverso de las velocidades iniciales de reacción (1/Vo) vrs la concentración inicial de sustrato, que en este caso es la glucosa (1/[G]), para poder obtener los parámetros del modelo de reacción de MichaelisMenten. [Go] mol/Lt 0,000277778 0,000555556 0,002777778 0,005555556 0,011111111 0,016666667
- Vo 1 / [G] - 1 / Vo M/min 0,000160 3600 6250 0,000180 1800 5555,556 0,000600 360 1666,667 0,002800 180 357,1429 0,002800 90 357,1429 0,003800 60 263,1579 Tabla 16: Inversos de la concentración inicial de glucosa [Go] y de la velocidad inicial en función de la glucosa (Vo).
1/Vo vrs 1/[G] de la Glucosa-oxidasa
6.0E-03 ) n ] i m G / [ e ( M d r x 1 -
Introducción a la Biotecnología
40
Tiempo (min)
8,000 7,000 6,000 5,000 o 4,000 V / 1 3,000 2,000 1,000 0 -1,000 -1000 0
y = 1.8196x + 561.4 R² = 0.8827
1000
2000
3000
4000
1/[G]
Gráfico 12: Velocidad de reacción en función de la glucosa versus el tiempo en minutos.
Gráfico 13: Gráfico de los inversos de velocidad vrs. los inversos de la concentración inicial para obtener los parámetros de la Michaelis-Menten.
La gráfica parece apegarse a la linealidad de groso modo debido a su varianza de 0,8827. Por tanto podemos suponer que el modelo elegido no dista de la realidad.
12
[Práctica 3: Cinética Enzimática de la Glucosa-Oxidasa] Con el intercepto en y (x=0) de la curva de ajuste podemos obtener el valor de la velocidad máxima de reacción:
1
= 561,4 =>
= 0,00178
Introducción a la Biotecnología
Luego con el intercepto en x (y=0) podemos adquirir el valor de la constante de reacción de Michaelis-Menten:
− − − 1
=
561,4
1,8196
=>
= 0,00324
Quedando totalmente definido el modelo para la reacción Michaelis-Menten.
BIBLIOGRAFÍ A 3,4,5 - Murray, Robert; Granner, Daryl; Rodwell, Victor; Mayes, Peter; 1997; BIOQUÍMICA DE HARPER; México; Editorial El Manual Moderno; p.77-110. 2,4 - Mier, Geraldine; Rhodes, V.J.; Maharg, Leta; Webb, Nancy, S; et al.: BEEF TENDERIZATION WITH PROTELYITIC ENZYMES; E.E.U.U.; Food Tech; p.16,111; Dairy Sci. Abstracts; p.23,197. 1 - PRODUCTION AND APPLICATION OF ENZYME PREPARATIONS IN FOOD MANUFACTURE; (Symposium, London,1959); Monograph No.11; Industrial Chemical Society; London.
Páginas de Internet consultadas: 5 - http://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biolmol/pdfs/08III%20ESPECTROFOTOMETRÍA.pdf Consultada el día Jueves 27 de Mayo de 2010 a las 22:49 horas
1,3 - http://www.biosimex.com.mx/pdf/insertos%20dedicados/Quimica%20clinica/ 12503%20glucosa.pdf Consultada el día Sábado 29 de Mayo de 2010 a las 23:56 horas
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