PRAKTIKUM UJI KANDUNGAN PROTEIN DENGAN METODE BRADFORD
Disusun Oleh : ARGHYA NARENDRA DIANASTYA (111510501105) (111510501105) (Mahasiswa Penerima Penerima Beasiswa Unggulan S-1 PS. Agroteknologi Agroteknologi Fakultas Fakultas Pertanian UNEJ)
PROGRAM STUDI AGROTEKNOLOGI FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS JEMBER 2012
1. PENDAHULUAN
Semua sistem kehidupan mengandung sejumlah besar protein yang berbeda. Perbedaannya terdapat pada asam amino, urutan asam amino, kandungan nonasam amino, bobot molekul, dan faktor yang menentukan konformasi protein. Dalam hal tersebut, untuk menentukan struktur protein tertentu kita diharuskan untu untuk k prot protein ein terseb tersebut ut dari dari baha bahan n non non prot protei ein n dan dan dari dari prot protein ein yang yang lain lain (Robinson, 1995). Protein merupakan polimer kondensasi asam amino dengan penghilangan unsur air dari gugus aminop dan gugus karboksil yang dimiliki. Jika protein tersebut tersebut memiliki memiliki bobot bobot senyawa senyawa yang kurang dari 6.000, 6.000, biasanya biasanya digolonga digolongakn kn kedala kedalam m polipe polipepti ptida. da. Secara Secara umum, umum, pada pada hidrol hidrolisi isiss protei protein n terten tertentu tu biasan biasanya ya ditemukan ditemukan 16 sampai 20 asam amino yang berlainan. berlainan. Asam amino dalam sebuah protein tersusun secara saling berkaitan membentuk rantai polimer lurus dengan sambung silang antara gugus sulfhidril sisteina membentuk jembatan disulfida (Robinson, 1995). Prot Protei ein n memi memili liki ki bebe beberap rapaa fung fungsi, si, lima lima dian dianta taran ranya ya adal adalah ah seba sebaga gai: i: biokatalisator, protein cadangan, biomol pentrasfer bahan, struktural, dan protektif.namun demikian, pada umumnya protein dikenal sebagai bagian dari makana makanan n yang yang diperg diperguna unakan kan sebagai sebagai pengg penggant antii jaring jaringan an sel (Martoh (Martoharso arsono, no, 1998). Prot Protei ein n memil memilik ikii kera keraga gama man n dan dan keru kerumi mita tan. n. Adan Adanya ya kera keraga gama man n dan dan keru kerumi mita tan n
terseb tersebut ut mend mendor oron ong g
terci tercipt ptan anya ya
baga bagan n
peng penggo golo long ngan an..
Prot Protei ein n
tumbuhan sebagai contoh telah dikelompokkan berdasarkan sumbernya. Secara umum didalam tumbuhan terdapat dua portein, yaitu portein biji dan protein daun. Prot Protei ein n ters terseb ebut ut lebi lebih h lanj lanjut ut diba dibagi gi menj menjad adii prot protei ein n embr embrio io dan dan prot protei ein n endo endosp sperm ermaa pada pada prot protein ein biji biji dan dan prot protei ein n klor klorop opla lass untt unttuk uk prot protei ein n daun daun (Robinson, 1995). Bagan penggolongan lain didasarkan kepada penglompokan menjadi protein sederhana, yaitu protein yang pada hidrolisisnya hanya menghasilkan asam amino alfa, dan protein konjugasi. Protein konjugasi adalah protein yang pada proses
hidrolisisnya menghasilkan asam amino dan senyawa lain. Anak golongan utama protein sederhana dicantumkan dalam “Penggolongan Osborne”. Beberapa contoh protein tersebut adalah Albumin, Globulin, Glutelin, Prolamin Histon His ton (Robinson, 1995). Terdapat beberapa golongan protein sederhana yang tidak dapat dimasukkan ke dalam dalam salah salah satu golongan golongan pada pada bagan bagan klasik klasik ini. ini. Satu Satu kelomp kelompok ok protein protein penting ialah protein yang bersifat asam yang berkaitan dengan DNA kromosom atau RNA ribosom (Robinson, 1995). Pada tanaman, konsentrasi protein tertinggi tertinggi didapati dalam biji sebesar 40% dan ditemukan dalam biji dari berat keringnya. Protein dalam biji akan digunakan sebagai energi dalam perkecambahan biji. Protein dalam tanaman larut dalam air, namun demikian terdapat protein yang terikat pada membran lipoprotein sehingga yang akan dihitung adalah total protein terlarut. Hal tersebut dikarenakan sebagai pelarut atau buffernya merupakan air (Siswoyo dan Handoyo, Handoyo, 2012). Terd Terdap apat at bebe beberap rapaa cara cara untu untuk k mene menent ntuk ukan an kons konsen entr trasi asi prot protei ein, n, salah salah satunya satunya menggu menggunak nakan an penguj pengujian ian bradfo bradford. rd. Penguj Pengujuia uian n Bradfo Bradford rd merupa merupakan kan metode yang sering digunakan, khususnya dalam penentuan kandungan protein dari dari fraksi fraksi
sel atau dari gel electrop electrophor horesis esis.. Metode Metode ini merupaka merupakan n prosed prosedur ur
standar dengan sensivitas antara 20 – 200 ug protein. Lebih lanjut, pengujian ini ddidasarkan ddidasarkan pada observasi observasi bahwa absorban maksimum maksimum untuk untuk larutan larutan asam dari CBB G-250 antara 165 nm sampai 595 nm ketika protein terikat (Siswoyo dan Handoy Handoyo, o, 2012). 2012). Untuk Untuk menget mengetahu ahuii langka langkah h penguk pengukura uran n kandun kandungan gan protei protein n dengan dengan meode Branford, Branford, dilaksanaka dilaksanakan n praktikum praktikum yang mengukur mengukur kandungan kandungan protein dalam biji dan daun tanaman kakao.
1. TUJUAN
1. Untu Untuk k meng menget etah ahui ui cara cara peng penguk ukur uran an kand kandun unga gan n prot protei ein n deng dengan an meod meodee Bradford menggunakan bahan biji dan daun tamaman kopi dan kakao; 2. Untuk mengetah mengetahui ui seberapa besar kandunga kandungan n protein pada biji dan daun tanaman kopi dan kakao; 3. Untuk memband membandingkan ingkan kadar kadar protein antara antara biji dan daun kopi serta kakao.
3. BAHAN DAN METODE 3.1 Alat dan Bahan 3.1.1 Alat :
1. Tabu Tabung ng Rea Reaks ksii 2. Mikropipet Mikropipet (20, (20, 200 200 dan 1000 ul) 3. Inku Inkuba bato tor r 4. Spekro Spekrofot fotome ometer ter 5. Rak tabung tabung reaksi reaksi
3.1.2 Bahan :
1. Coomassie Coomassie Brilliant Brilliant Blue Blue G-250 2. 95 % Eth Ethan anol ol 3. 85% Phosph Phosphori oricc Acid Acid 4. BSA (Bovine (Bovine Serum Serum Albumine Albumine)) sebagai sebagai standar 5. Bradford Bradford reagent : 100 mg Coomasie Coomasie Brilliant Brilliant Blue G-250 G-250 dalam 50 ml ethanol ethanol 95% dan ditambahkan ditambahkan 100 ml (w/v) Phosphoric Phosphoric acid dan tambahkan tambahkan aquades aquades sampa sampaii volu volume me 1 liter liter.. Sari Saring ng laru laruta tan n deng dengan an kert kertas as what whatma man n sebe sebelu lum m digunakan.
3.2 Cara kerja :
1. 2 gr sampel digerus digerus dengan mortar mortar pestle setelah setelah diberi nitrogen nitrogen cair. 2. Tambahkan 3 kali volume buffer buffer ekstraksi yang mengandung (100 mM MOPS NaOH (pH 7,5), 10 mM MgCl 2, 1 mM EDTA, 10 mM beta-2 mercaptoenol dan 10 % PVP. 3. Homogenat Homogenat dimasukkan dimasukkan dalam 4 ependorf ependorf dan disentrifugasi disentrifugasi pada kecepatan kecepatan 10.000 rpm 4 oC selama 10 menit, kemudian ambil supernatan dan digunakan sebagai sumber enzim (satu epedorf untuk pengukuran protein ).
Pembuatan grafik standar BSA
1. Siapka Siapkan n 5 tabung tabung mikro mikro sentri sentrifus fusee (beri (beri nomor nomor 1-5), 1-5), kemudi kemudian an isi masing masing masing dengan bahan seperti table dibawah ini :
Nomor
Volume BSA
Larutan Buffer
Bradford Reagent (uL)
Tabung 1. 2. 3. 4.
(uL) 5 10 20 25
(uL) 45 40 30 25
950 950 950 950
Catatan : - Konsentrasi larutan stok BSA = 1 UG UL-1 Setelah didiamkan selama 15 menit ukur OD 595 nm dengan spektrofotometer. Cari persamaan regresinya sebagai X adalah OD 596 dan sebagai Y adalah jumlah BSA.
Pengukuran sampel
1. Masukkan Masukkan sampel protein protein sebanyak sebanyak 25 uL ke dalam tabung mikrosentrif mikrosentrifugasi ugasi dilakukan 4 kali pengenceran dan ditambah larutan buffer sebanyak 30 uL dan divortex. 2. Tambahkan Tambahkan 950 ul ul reagent reagent Bradford Bradford dan divortex. divortex. 3. 15 menit kemudian kemudian ukur ukur OD pada panjang panjang gelombang gelombang 595 nm 4. Hitung Hitung kandungan kandungan protein sampel sampel menggunakan menggunakan grafik grafik standar BSA
4. HASIL HASIL PERCOB PERCOBAAN AAN
4.1 Pembuatan Pembuatan Kurva Kurva Standar Standar Analisis Analisis Protein Metode Metode Bradford Bradford
Absorban 0,000 0,427 0,516 0,655 0,665 4.2 4.2
Kurva Standar Konsentrasi BSA (mg/ml) 0,000 5,000 10,000 20,000 25,000
Peng Penguk ukur uran an Abso Absorb rban an Samp Sampel el Kopi Kopi-K -Kak akao ao Sampel
A595 Ulangan 2 0,610 0,571 0,434 0,438
Ulangan 1 0,601 0,583 0,401 0,409
Biji Kopi Daun Kopi Biji Kakao Daun Kakao
Ulangan 3 0,587 0,595 0,431 0,418
4.3 Penent Penentuan uan Persam Persamaan aan Regre Regresi si
Persamaan Regresinya adalah y = 33,36x - 3,102 4.4 Penent Penentuan uan Persam Persamaan aan Regre Regresi si Kandungan Protein
Kadar Protein (mg/ml) Sampel
Ulangan
Ulangan
Ulangan
ke- 1
ke- 2
ke- 3
Sampel dan Rata-rata
Stdev
Toleransi Kesalahannya
Biji Kopi
3,389
3,450
3,296
3,378
0,077
3,378 ± 0,077
Kopi Biji
3,269
3,189
3,349
3,269
0,080
3,269 ± 0,080
Kakao Daun
2,055
2,275
2,255
2,195
0,122
2,193 ± 0,099
Kakao
2,108
2,302
2,168
2,193
0,099
2,195 ± 0,123
Daun
5. PEMB PEMBAH AHAS ASAN AN
Metode Bradford adalah salah satu metode yang digunakan untuk mengukur kandun kandungan gan protei protein. n. Metode Metode tersebu tersebutt dilaku dilakukan kan pertam pertamaa kali kali oleh oleh Bradfo Bradford rd (Bradford et al., 1976). Pada saat ini, metode Bradford telah banyak dilakukan untuk mengukur kandungan protein karena metode tersebut dinilai mudah, cepat, dan hasiln hasilnya ya cukup cukup akurat akurat.. Selain Selain itu, itu, pengu pengukur kuran an kandun kandungan gan protei protei dengan dengan metode metode Bradford Bradford lebih tahan terhadap terhadap interferensi interferensi senyawaan nonprotein nonprotein yang sering kali mengganggu jalannya pengujian kuantitatif protein. Pengujian Pengujian kandungan kandungan protein protein dengan metode metode Bradford Bradford
didasarkan didasarkan pada
pengikatan zat warna Coomassie Br terhadap p protei protein. n. Bril ilia iant nt Blue Blue GG-25 250 0 terhada Coomassie Briliant Blue G-250 memiliki memiliki formasi ion berbeda dengan nilai pKa 1.15, 1.82 dan 12.4. Bentuk kationik zat warna tersebut berwarna merah dan hijau dengan panjang gelombang serapan maksimum pada 470 dan 650 nm. Sedangkan bentuk anioniknya berwarna biru dengan absorbansi (panjang gelombang gelombang serapan) maks maksim imum um 590 590 nm. nm. Namu Namun, n, untu untuk k peng penguk ukur uran an prot protei ein n dila dilaku kuka kan n deng dengan an menentukan jumlah zat warna dalam bentuk anionik (biru) serta dilakukan dengan mengukur absorbansi larutan pada 595 nm. Zat warna Coomassie Blue G-250 bereaksi cepat dengan residu arginil dan lysil dari protein, sehingga menyebabkan adanya variasi hasil pengukuran untuk jenis protein yang berbeda. Protein dengan residu arginil dan lysil lebih banyak, akan menghasilkan warna biru yang lebih intens. Sedangkan, protein yang memiliki residu arginil dan lysil lebih sedikit, warna biru tidak lebih intens, walaupun jumlah proteinnya sama. Meto Metode de Brad Bradfo ford rd meru merupa paka kan n meto metode de yang yang pali paling ng sesua sesuaii dan dan umum umum diguna digunakan kan.. Metode Metode Bradfo Bradford rd memili memiliki ki dua jenis jenis assay assay protei protein, n, yaitu yaitu Standar Assay dan tandar Assay Assay diguna dan Micr Microa oass ssay ay.. Standar digunakan kan untuk untuk penguk pengukura uran n kadar kadar
protein antara 10 sampai 100 µg, sedangkan Microassay digunakan digunakan untuk pengukuran kadar protein antara 1 sampai 10 µg. Namun, pengukuran dengan Microassay umumnya lebih rentan terhadap interferensi senyawaan nonprotein. Prin Prinsi sip p
kerj kerjaa
anal analis isis is
prot protei ein n
den dengan gan
meto etode
Brad Bradfo ford rd
adal adalah ah
spektrofometri. Spektrofotometri adalah sebuah alat yang dapat memberikan nilai absorban pada sampel. Spektrofotometri akan mengirimkan cahaya berupa cahaya
tampak yang akan diserap oleh sampel. Semakin besar cahaya yang diserap, maka semakin besar nilai absorbannya. Namun, kandungan protein tidak dapat langsung diketahui. diketahui. Kandungan protein setiap sampel harus dihitung lagi menggunak menggunakan an nilai absorban setiap sampel. Secara Secara umum, umum, protein protein terdapa terdapatt pada pada hampir hampir setiap setiap susuna susunan n sel mahluk mahluk hidup. Pada tanaman yang menghasilkan biji, kandungan protein lebih dominan terdapat pada bagian biji. Sebagai contoh pada tanaman kopi dan kakao. Hasil percobaan yang kami lakukan dengan membandingkan kandungan protein pada biji dan daun menunjukkan bahwa kandungan protein pada biji lebih banyak dibandingkan pada bagian daun. Hasil rata-rata perhitungan kandungan protein pada biji kopi 3,378 sedangkan pada daun kopi 3,269, sehingga kita dapat meng menget etah ahui ui bahw bahwaa kand kandun unga gan n prot protei ein n pada pada biji biji jauh jauh lebi lebih h ting tinggi gi 0,10 0,109 9 diband dibanding ingkan kan pada pada bagian bagian daun daun kopi. kopi. Sedang Sedangkan kan,, hasil hasil perhit perhitung ungan an rata-ra rata-rata ta kandungan protein dalam biji kakao sebesar 2,881 dan pada daun kakao 2,193. Selisih yang didapatkan dari perbedaan kandungan protein biji kakao dan daun kakao adalah 0,688. Dari Dari hasil hasil analisa analisa protein protein yang dilakuka dilakukan, n, dapat
diketa diketahui hui pula bahwa
kandungan protein pada biji dan daun kopi lebih besar terhadap biji dan daun kakao. kakao. Hal tersebut dikarenakan dikarenakan pada tanaman tanaman kopi, kopi, sebagian sebagian hasil fotosintat fotosintat diubah menjadi protein, sedangkan pada tanaman kakao, hasil fotosintat secara umum diubah menjadi bentuk lemak. lemak. Namun demikian, demikian, kandungan kandungan dari hasil fotosi fotosinta ntatt yang yang tersim tersimpan pan masih masih tergan tergantun tung g pada pada usia usia tanama tanaman. n. Seperti Seperti hasil hasil penelitian Wealth of India (1990), kandungan protein dari 100 gram biji kopi adalah sebesar 11,23 gram. Menurut Belitz et al ., ., kandungan protein biji kakao adala adalah h 11,5 11,5.. Perb Perbed edaan aan kand kandun unga gan n prot protei ein n deng dengan an meto metode de Brad Bradfo ford rd pada pada penelitian kami tidak sesuai dengan pernyatan tersebut, karena terdapat faktorfaktor kesalahan terjadi ketika penelitian. Sehingga, hal itu memengaruhi hasil dari kandungan protein. Didalam Didalam praktikum praktikum terdapat terdapat faktor-faktor faktor-faktor kesalahan yang mempengaru mempengaruhi hi hasi hasill
peng penguk ukur uran an kand kandun unga gan n
prot protei ein, n, hal hal
ters terseb ebut ut dian dianta tara rany nyaa
meli melipu puti ti
penggerusan biji dan daun pada kopi dan kakao. kakao. Penggerusan akan mempengaruhi
halus tidaknya bahan yang digerus. Semakin halus, maka analisis protein yang dilakukan akan semakin mudah. Hal tersebut dikarenakan, semakin halus substrat yang yang ditumb ditumbuk, uk, maka maka akan akan memuda memudahka hkan n dalam dalam hal reaksi reaksi terhada terhadap p Bradfo Bradford rd reagen. Selain itu, faktor keseterilan keseterilan alat sangat berpengaruh. berpengaruh. Semakin steril alat praktikum yang digunakan, maka semakin baik hasil yang diperoleh. Faktor manusia, juga mmempengaruhi dalam analisa protein. Hal tersebut dikarenakan sering terjadinya human eror dalam pencatatan hasil dan pengelolahan data.
Kandungan protein semua bahan, protein2 itu berada dimana? Perbandingan protein pada biji dan daun kopi dan kakao, kenapa kok beda Perbandingan protein pada kopi dan kakao, kenapa kok beda
6. KESIMPUL KESIMPULAN AN DAN DAN REKOMEN REKOMENDASI DASI
6.1 Kesimpulan
Uji kandungan protein dengan metode Bradford sangat mudah dan cukup akurat akurat.. Kandun Kandungan gan protein protein pada pada tanama tanaman n yang yang mengha menghasil silkan kan biji biji umumny umumnyaa banyak terdapat pada bijinya dibandingkan pada daunnya, seperti s eperti pada kakao dan kopi. kopi. Hal itu karena karena hasil fotosi fotosinta ntatt lebih lebih banyak banyak disimp disimpan an pada pada biji biji kakao kakao maupun kopi.
6.2 Rekomendasi
Sebaiknya Sebaiknya dalam melaksanaka melaksanakan n praktikum praktikum penentuan penentuan kandungan kandungan protein deng dengan an meto metode de Brad Bradfo ford rd haru haruss bena benar-b r-ben enar ar teli teliti. ti. Ting Tingka katt kete ketelit litia ian n akan akan memengaruhi keakuratan hasil. Selain itu, alat-alat yang digunakan harus steril serta sampel yang digerus benar-benar halus agar hasilnya juga akurat.
DAFTAR PUSTAKA
Bradford, MM. 1976. A rapid and sensitive for the quantitation of microgram quantitites of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72: 72: 248-254. Martoharsono, S. 1998. Biokimia 1998. Biokimia Jilid I . Yogyakarta: Gadjah Mada University Press. Robinson, T. 1995. Kandungan 1995. Kandungan Organik Organik Tumbuhan Tinggi Tinggi . Bandung: Penerbit ITB. Siswoyo, T.A. dan Handoyo, T. 2012. Petunjuk 2012. Petunjuk Praktikum Biokimia Tanaman Tanaman (Tidak Diterbitkan). Jember: Universitas Negeri Jember
