Practica Pruebas Bioquimicas 2012 Completa

Pruebas Bioquímicas: Productos químicos y biológicos biológicos para el diagnóstico UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA - FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS DEPARTAMENTO DE PATOLOGÍA VETERINARIA - CATEDRA DE MICROBIOLOGÍA E INMUNOLOGÍA

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA GENERAL

PRUEBAS BIOQUÍMICAS: PRODUCTOS QUÍMICOS QUÍMICOS Y BIOLÓGICOS PARA EL DIAGNÓSTICO.

INTRODUCCIÓN La identificación de una bacteria es su asignación a un taxón según una clasificación dada. Consiste en la determinación de las características fenotípicas y/o genotípicas y la comparación de estas características con los diferentes taxones de la clasificación considerada. Las características a determinar y su número depende principalmente del tipo de bacteria y del fin que se se persigue en la identificación. Los pasos a seguir seguir para una perfecta identificación bacteriana son:

1.- Obtener un cultivo puro 2.- Examen microscópico de células vivas y de frotis teñido por coloración Gram. Se determina así la forma y el Gram del microorganismo en estudio. También es importante determinar la agrupación y la presencia de esporas y otras caracterís ticas morfológicas de interés. 3.- Determinar las características nutricionales (en general se desprenden de los métodos empleados en el aislamiento y cultivo anteriores); fotoautótrofos, fotoheterótrofos, quimioautótrofos, quimioheterótrofos. 4.- Realización Realización de pruebas primarias (Gram, morfología, morfología, catalasa, oxidasa, OF, fermentación de glucosa, esporas, crecimiento en aerobiosis y anaerobiosis y movilidad. 5.- Realización de pruebas secundarias y terciarias a efectos de llegar a especie. Estas dependerán del género o familia determinado. (ej: producción de pigmentos, producción de indol a partir de triptofano, producción de coagulasa, de fenilalanina deaminasa, etc.). Además de los nutrientes básicos y específicos, específicos, que le son proporcionados a las especies de interés, para que puedan desarrollarse plenamente a nivel de laboratorio, en la fórmula de algunos medios de cultivo empleados al efecto, se incluyen determinados compuestos con el objetivo de favorecer su desarrollo en detrimento de otras especies contaminantes o no, o para distinguir di stinguir y diferenciar las colonias producidas. producidas. Una vez aisladas, las especies deben ser identificadas, para lo cual se emplean indistintamente productos químicos, principalmente carbohidratos, para conocer su capacidad metabólica frente a esos sustratos o se enfrentan a otros tipos de compuestos para determinar su resistencia, así como a diversos productos biológicos para evidenciar sus reacciones.

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Pruebas Bioquímicas: Productos químicos y biológicos biológicos para el diagnóstico

1.- OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA a. Entender, comprender y aplicar las técnicas adecuadas para la realización de pruebas bioquímicas empleadas rutinariamente en los procedimientos de identificación bacteriana. b. Adquirir conciencia de la importancia que tiene la correcta realización de las pruebas bioquímicas convencionales convencionales en el proceso de i dentificación bacteriana. c. Reconocer la necesidad de emplear cultivos puros como sustrato para la realización de pruebas bioquímicas requeridas en el proceso de identificación bacteriana. d. Adquirir conocimientos básicos teóricos y prácticos de la siembra, aislamiento y proceso de identificación de bacterias realizando las diferentes pruebas bioquímicas de uso rutinario en el laboratorio de diagnóstico bacteriológico.

2.- ACTIVIDADES DEL INSTRUCTOR: a. Explicación sobre las pruebas bioquímicas de uso rutinario en el diagnóstico bacteriológico, los métodos de siembra y sus aplicaciones en el proceso de identificación bacteriana. b. Demostración de las técnicas de siembra y los pasos a seguir para la correcta realización de las pruebas bioquímicas empleadas en diagnóstico bacteriológico

3.- ACTIVIDADES DE LOS ALUMNOS: a- Aplicando técnicas asépticas, siembre los diferentes medios de cultivo diferenciales líquidos a partir del tubo con el medio de cultivo líquido que se le suministra. Emplee el esquema de diseminación del inoculo indicado. Marque el tubo, incube el tubo en estufa a 37ºC. b- Aplicando técnicas asépticas, siembre el medio de cultivo sólido en tubo (medio con bisel) que se le suministra. Emplee el esquema de diseminación diseminación del inoculo indicado. i ndicado. Marque el tubo, incube el tubo en estufa a 37ºC.

PRUEBAS BIOQUÍMICAS: ASPECTOS GENERALES Los ensayos bioquímicos tradicionalmente utilizados (las llamadas pruebas bioquímicas convencionales), generalmente determinan la actividad de una vía metabólica de la bacteria (conjunto de reacciones químicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no. Obviamente, en la identificación bacteriana hay que partir de un cultivo puro obtenido en el aislamiento, sub-cultivado de una colonia bien aislada. Es aconsejable realizar una comprobación efectuando una siembra en placa en la que crezcan únicamente colonias del mismo tipo. La identificación de un aislamiento bacteriano puede realizarse utilizando diferentes combinaciones de características y diferentes criterios criterios en la evaluación evaluación de similitudes. similitudes. Los ensayos bioquímicos tradicionalmente utilizados, llamadas pruebas bioquímicas convencionales, generalmente determinan la actividad de una vía metabólica (conjunto de reacciones químicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al 2


crecer transforma o no. Existen diferentes sistemas que facilitan la realización de tales ensayos, porque proponen el mejor conjunto de pruebas bioquímicas para la identificación de un grupo bacteriano, porque simplifican la interpretación de un resultado utilizando un valor numérico, porque proveen los reactivos listos para su uso o porque son totalmente automatizables. Las pruebas o ensayos bioquímicos, son pruebas simples que se han desarrollado para demostrar en forma clara una determinada característica bioquímica como presencia o ausencia de una determinada actividad enzimática, grupo de enzimas o determinada vía metabólica, crecimiento a una determinada temperatura, crecimiento en presencia de inhibidores, etc. No significan de ninguna manera un estudio profundo del metabolismo bacteriano. Para llevarlas a cabo, se pueden pueden utilizar diferentes sistemas de trabajo (medio de cultivo, indicador, revelador, etc.) que puede p uede ser diferente aún para el mismo ensayo si se trata de diferentes microorganismos. Por ejemplo se debe suplir con factores de crecimiento el medio de cultivo para estudiar la fermentación de distintos azúcares cuando se sabe que el microorganismo en estudio es exigente. A la determinación de la especie se puede llegar según diversos sistemas (manuales de identificación, comerciales, etc.).

HIDRATOS DE CARBONO Los carbohidratos comúnmente empleados son diversos. Los más utilizados son los monosacáridos como: glucosa, manosa, galactosa y fructuosas, entre otros y los disacáridos como: lactosa, sacarosa, maltosa y celobiosa. También algunos trisacáridos, entre los que se encuentra la rafinosa r afinosa y polisacáridos como la celulosa cel ulosa y el almidón. Uno o varios de estos carbohidratos suelen formar parte, como fuente de carbono, de la composición de diversos medios, para el cultivo primario o las resiembras, así como, de los medios bioquímicos destinados para el diagnóstico di agnóstico de las especies. El objetivo de su empleo, es determinar, si el microorganismo en estudio, fermenta "in vitro" el carbohidrato con formación de sustancias ácidas, como por ejemplo: el ácido láctico, lo cual será detectado por la acción del indicador presente en el medio de cultivo al variar el pH.

INDICADORES Los indicadores son compuestos químicos elaborados con ácidos o bases débiles, que se caracterizan por dar lugar al cambio de color de la disolución o sustancia donde se encuentran al variar el pH, debido a su capacidad de ionización mediante la cual, a determinado nivel de la escala de pH, transforman los iónes o moléculas y viceversa. Los indicadores son de dos colores pudiendo ser uno de ellos incoloro. Cuando el indicador está cambiado de color, la mitad se encuentra en estado iónico y la otra mitad en estado molecular, por lo que el color en esta fase no será definido, sino más bien un color intermedio entre ambos. Los indicadores que forman parte de la fórmula del medio de cultivo, deben estar en concentraciones muy bajas, para que la determinación del pH se deba exclusivamente a los cambios que tiene lugar en la solución. En el siguiente cuadro se citan ejemplos de indicadores de pH: 3


Cuadro. Colores a los que dan lugar los indicadores en su rango de pH INDICADOR ROJO FENOL AZUL BROMOTIMOL BROMOTIMOL ROJO DE METILO ROJO NEUTRO FENOLFTALEINA ROJO CRESOL PÚRPURA DE BROMOCRESOL

COLOR ACIDO BASE

Amarillo Amarillo Rojo Rojo Incoloro Amarillo Amarillo

Rojo Azul Amarillo Amarillo Rojo Rojo púrpura Rojo

RANGO DE pH

6.4 - 8.2 6.0 - 8.0 4.0 - 6.0 7.0 - 8.0 8.0 - 10.0 7.2 - 8.3 5.2 - 6.8

Los indicadores presentes en los medios de cultivo, cambian el color del medio o de las colonias, en correspondencia con las variaciones del pH.

SANGRE Y HEMODERIVADOS La sangre se emplea en la elaboración de algunos medios de cultivo, no teniendo como única finalidad proporcionar un nutriente esencial para el desarrollo de determinadas especies, sino además, el permitir evidenciar y diferenciar la actividad hemolítica de algunas de ellas. Por ejemplo, cuando se desarrollan en el medio "Agar sangre", colonias correspondientes a especies productoras de hemolisinas, éstas actúan sobre la sangre que se encuentra en sus inmediaciones, hemolizando a los hematíes total o parcialmente. Si el tipo de hemolisina, destruye a los eritrocitos, el efecto se evidenciará por la formación de un halo incoloro alrededor de la colonia. Este tipo de hemólisis total se clasifica como "betha". En cambio, si el tipo de hemolisina no destruye a los hematíes, pero actúa sobre la hemoglobina que porta, reduciéndola a biliverdina, el efecto se evidenciará por la presencia de un halo de color verde alrededor de la colonia. Este tipo de hemólisis se clasifica como "alpha". Tanto los eritrocitos de sangre humana, como los obtenidos de diversas especies de animales, como por ejemplo: carneros, conejos, cabras, etc., son utilizadas en diferentes pruebas de hemaglutinación hemaglutinación o para detectar diversas reacciones hemolíticas. El suero sanguíneo se emplea comúnmente para serodiagnósticos y el plasma (sin preservo) es utilizado regularmente para poner en evidencia la capacidad enzimática de especies productoras de coagulosa, una enzima que utiliza como sustrato el plasma sanguíneo, provocando la formación de coágulos.

COLORANTES La edición de determinados colorantes a la fórmula del medio de cultivo, tiene como objetivo, inhibir el desarrollo de las especies más sensibles, que interfieren el estudio, favoreciendo de esta manera el desarrollo de otras más resistentes de interés en la investigación, como por ejemplo: el "Verde brillante" que forma parte de la composición del medio de cultivo del mismo nombre, utilizado para aislar algunas especies del género Salmonella, al interferir total o parcialmente el desarrollo de otras especies presentes en la muestra. Las colonias de Salmonella se observan además en este 4


medio con un color, rosado o casi blancas, dependiendo de las condiciones de cultivo y el tiempo de incubación. i ncubación. Otro ejemplo lo constituye la siembra en el medio "Eosina-Azul de Metileno Agar". Estos colorantes inhiben el desarrollo de los gérmenes gramnegativos y al mismo tiempo permiten diferenciar a las especies de Enterobacterias fermentadoras de lactosa, la sacarosa o ambos azúcares, de los que no las fermentan. Por ejemplo, las colonias de E. coli, Citrobacter y P. vulgaris , adquieren un color azul oscuro, con aspecto metálico (que se evidencia con luz indirecta), en tanto que las Salmonella spp. y las Shigella spp., se mantienen incoloras o ligeramente teñidas, mientras que las del resto de los coliformes se tiñen con un tono parduzco.

PRODUCTOS QUÍMICOS Teniendo en cuenta, la información genética de que dispone cada especie bacteriana, que la capacita para actuar metabólicamente sobre determinados sustratos, es parcial o totalmente diferente entre sí, se emplean para su diagnóstico diversos sustratos, la mayoría de naturaleza química, cuyas reacciones específicas, nos aportan información acerca de su identidad. Entre los productos químicos, empleados con mayor frecuencia se encuentran los siguientes: Urea, citrato, malonato, nitrato, KCN, así como diversos tipos de aminoácidos, entre otros. El producto químico que se vaya a emplear, formará parte de la fórmula de un medio de cultivo, que contiene además los nutrientes necesarios para el desarrollo de la especie en estudio. Al actuar la bacteria sobre el producto químico en cuestión, generalmente lo degradan por acción enzimática a productos más simples, caracterizados por tener un ph diferente al del producto reaccionante, lo cual se pondrá en evidencia por la acción del indicador que forma parte del medio de cultivo, que proporcionará el cambio de color del medio, haciendo factible la lectura de esa prueba.

AMINOÁCIDOS Los aminoácidos: lisina, ornitina y arginina son utilizados corrientemente en el laboratorio, como parte de las pruebas que se realizan a una cepa en estudio, para determinar la identidad de la especie. De manera similar a la empleada con los productos químicos para igual propósito, cada uno de estos aminoácidos es adicionado por separado, en una proporción del 1 % a un caldo base que contiene los nutrientes necesarios para el desarrollo del germen ger men y un indicador. El principio de estas pruebas radica en la capacidad de algunos microorganismos para decarboxilar uno o varios de estos aminoácidos formando una amina con la consiguiente alcalinidad, lo que será puesto de manifiesto por la acción del indicador, al producirse el cambio de pH.

ANTIBIÓTICOS Para medir la sensibilidad o resistencia de un microorganismo en estudio a los antibióticos, se realiza una técnica denominada antibiograma con el empleo de discos de papel de filtro estériles de unos 5 ó 6 mm de diámetro, impregnados por separado 5


con una carga en g o unidades de un antibiótico determinado, equivalente a la concentración sérica media, obtenida en el pico de una terapéutica a dosis habituales. Estos discos (desecados) se colocan con todas las precauciones de asepsia sobre la superficie del cultivo, tan pronto se realiza la siembra, siendo incubada de inmediato. Transcurridas 24 horas, un halo de inhibición alrededor de cada disco, en dependencia del tamaño del diámetro, será indicativo de la sensibilidad o resistencia del microorganismo en estudio a cada uno de los antibióticos empleados. Basado en el mismo principio y por un procedimiento similar, se realizan pruebas específicas con el empleo de un solo disco, impregnado en este caso con bacitracina u optoquina. La bacitracina inhibe el crecimiento de más del 95 % de los Estreptococos del grupo A, en tanto que la optoquina inhibe el desarrollo del S. pneumoniae (Neumococos), por lo que, la lectura de estas pruebas aportaran un importante dato para sus respectivos diagnósticos. Otras pruebas de resistencia, se realizan con el empleo de productos químicos como: el cianuro de potasio o el desoxicolato de sodio, así como mediante la exposición del microorganismo a sustancias de secreción orgánica como la bilis. La interpretación de los resultados se sustentará en el hecho de que los microorganismos sean o no capaces de desarrollarse en presencia de estos compuestos.

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1ra SESIÓN PRÁCTICA METABOLISMO METABOLISMO PROTEICO Licuefacción de gelatina (lenta y rápida) Fenilalanina desaminasa Indol Ureasa Lisina descarboxilasa PRUEBAS DE TOLERANCIA T OLERANCIA BHI con cloruro de sodio al 6,5% BHI con pH 9,6 Bilis esculina 2da SESIÓN PRÁCTICA METABOLISMO METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS Oxidación Fermentación de carbohidratos - glucosa Hidrólisis de carbohidratos: Medio CTA, Caldo Base Rojo de fenol y/o Bromocresol purpura con tubos durhan Manitol Movilidad Rojo de Metilo Voges-Proskauer: Acetoina 3ra SESIÓN PRÁCTICA METABOLISMO METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS Kliger Hidrólisis de almidón ENZIMAS SISTEMA TRANSPORTE ELECTRONES Catalasa Oxidasa Reducción de Nitratos COMPUESTOS COMO FUENTE ÚNICA DE CARBONO Utilización de Citrato OTRAS PRUEBAS Prueba de cloroformo

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METABOLISMO PROTEICO

LICUEFACCIÓN DE GELATINA (LENTA) Detectar la producción producción de de una enzima proteolítica extracelular extracelular por parte de las bacterias que es la “GELATINASA”. Permite diferenciar géneros productores de Gelatinasa, que hidrolizan la Gelatina tales como: como: Staphylococcus: (+ muy rápida) Bacillus (+) Micrococcus : (+ lenta) Clostridium (+ lenta) Streptococcus - (negativos) Listeria - (negativos)

FUNDAMENTO:

Gelatinasa(Proteasa) Gelatinasa(Prot easa) Gelatinasa (Peptidasa)

Gelatina + Agua Peptonada + bacteria

Polipeptidos Polipeptidos

aa

(Proteina + agua)

PROCEDIMIENTO: 1) Siembra del m.o. en medio rico en Gelatina por punción profunda Ej. Agua Peptonada + 12% gelatina Caldo nutritivo + 12% gelatina (esterilizados previamente) 2) Incubar por varios días (20 días) a 20-22ºC 3) Colocar en nevera 30’ antes de la interpretación RESULTADOS Medio se derrite (líquido) Gelatinasa + (bacteria hidrolizó gelatina) Gelatinasa - (bacteria no hidrolizó gelatina) Medio está sólido

PRUEBA DE LICUEFACCIÓN DE GELATINA (LENTA)

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FENILALANINA DESAMINASA FUNDAMENTO: Esta prueba determina la capacidad de un organismo para desaminar el aminoácido fenilalanina en ácido fenilpirúvico por su actividad enzimática de fenilalanina desaminasa, con la consiguiente acidez resultante. Esta actividad enzimática es característica de todas las especies del género Proteus y del grupo Providencia por lo que se usa para separar ambos géneros de otras enterobacterias

PROCEDIMIENTO Se cultiva el microorganismo en agar fenilalanina sembrando la superficie del bisel con abundante inóculo e incubando durante 12-16 horas. Seguidamente se añade 0,2ml de una solución de cloruro férrico al 10% de manera que inunde todo el crecimiento.

RESULTADO La presencia de ácido fenilpirúvico (prueba positiva) se manifiesta por la aparición de un color característico verde oscuro o verde-azulado.

PRUEBA DE FENILALANINA DESAMINASA

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PRODUCCIÓN DE INDOL Esta prueba se realiza para determinar la capacidad de las bacterias para producir indol a partir del triptófano. MEDIO DE CULTIVO Y REACTIVO 



Caldo triptonado + Triptona 10,0 g + Cloruro de sodio 5,0 g + agua destilada 1000,0 ml pH 7,1

Disuelva los ingredientes, reparta en tubos y esterilice en autoclave 15 minutos a 121°C (15 libras de presión).

Reactivo de Kovac Para-dimetil-aminobenzaldehído 10,0 g Alcohol amílico o isoamílico isoamílico 150,0 mL Acido clorhídrico concentrado 50,0 mL Se prepara disolviendo el aldehído en el alcohol y añadiéndole el ácido lentamente. Se reparte en pequeñas cantidades y se almacena en el refrigerador cuando no esté en uso.

PROCEDIMIENTO Se inocula un tubo del medio con el asa de platino, transfiriendo una porción del cultivo puro y se incuba a 37°C por 40 a 48 horas. Luego se añaden 0,5 mL del reactivo de Kovac y se agita suavemente. RESULTADOS Una reacción positiva es indicada por la aparición de un anillo rojo en la superficie del medio (capa alcohólica).

PRUEBA DE PRODUCCIÓN DE INDOL

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UREASA Esta prueba se utiliza para determinar la capacidad de los microorganismos para hidrolizar la úrea, formando dos moléculas de amoníaco por la acción de la enzima ureasa. MEDIO DE CULTIVO Caldo úrea Extracto de levadura 0,1 g Fosfato monopotásico 9,1 g Fosfato disódico 9,5 g Úrea 20,0 g Rojo fenol 0,01 g Agua destilada 1000,00 mL pH 6,7-6,9        

Disuelva y esterilice por filtración.

PROCEDIMIENTO Con el asa de platino transfiera una porción de cultivo puro proveniente de un medio sólido. Incube a 37°C por 24 horas. RESULTADOS Una reacción positiva (hidrólisis de la urea) u rea) es indicada por un cambio de color del amarillo (pH 6,8) al rojo cereza (pH 8,1 o más alcalino).

PRUEBA DE UREASA

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DESCARBOXILACIÓN DESCARBOXILACIÓN DE LA L A LISINA MEDIO DE CULTIVO Caldo Lisina Peptona 5,0 g Extracto de levadura 3,0 g Glucosa 1,0 g Lisina 5,0 g Púrpura de bromocresol 0,02 g Agua destilada 1000,00 mL pH 6,8        

Disuelva y caliente a ebullición por 2 ó 3 minutos, reparta en tubos y esterili ce en el autoclave por 10 minutos a 121°C (15 libras de presión).

PROCEDIMIENTO Con el asa de platino transfiera una porción de cultivo puro al caldo li sina. Incube a 37°C por 24 horas. Cubra los tubos inoculados con una capa de 4-5 mm de parafina estéril. RESULTADO Las enterobacterias, por fermentación de la glucosa producen ácido, el cual hace virar el indicador a color amarillo. Si la bacteria posee una lisina descarboxilasa, descarboxilasa, por la descarboxilación de la lisina li sina se producirá una amina, la l a cual neutralizará el ácido producido por la fermentación de l a glucosa retornando el medio a su color original violeta.

A tubo sin inocular

B resultado resultado positivo positivo

C resultado resultado negativo negativo

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PRUEBAS DE TOLERANCIA T OLERANCIA BHI CON CLORURO DE SODIO AL 6,5% Se estudia sembrando el microorganismo en un medio capaz de soportar su desarrollo, al cual se le ha agregado NaCl en la concentración referida. El medio puede usarse solo, en cuyo caso se lee simplemente por observación de crecimiento o no, o puede adicionarse con glucosa al 1% y un indicador de pH, como el rojo fenol, para facilitar la lectura. En este último caso, los microorganismos capaces de fermentar la glucosa, y tolerar la concentración salina del medio, desarrollan y acidifican, con el consiguiente viraje de color en el medio

RESULTADOS Crecimiento: Tolera la concentración de sal No crecimiento: no tolera la condición

BHI CON pH 9,6 Puede usarse el caldo nutritivo como base, ajustando el pH a 9,6 antes de su esterilización. Puede adicionarse glucosa y un Indicador de pH, como se indicó en el caso anterior, para facilitar la l a lectura de resultados

RESULTADOS Crecimiento: Tolera el nivel de pH a 9,6 No crecimiento: no tolera la condición

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BILIS ESCULINA Medio utilizado para el aislamiento e identificación presuntiva de estreptococos del grupo D. FUNDAMENTO Los estreptococos del grupo D crecen rápidamente en el agar bilis esculina e hidrolizan la esculina, que en presencia de iones hierro forman un compuesto de color verde oliva hasta negro. Las sales biliares presentes inhiben el desarrollo de la flora acompañante. MEDIO DE CULTIVO Fórmula (en gramos por litro) Extracto de carne 3 g Peptona de carne 5 g Esculina 1 g Citrato férrico 0.5 g pH final: 6.6 ± 0.2

Bilis de buey 40 g Agar 15 g

Suspender 64,5 g en un litro de agua destilada. Dejar reposar 5 minutos. Calentar a ebullición hasta su completa disolución. Distribuir en tubos o frascos y esterilizar 15 minutos a 121°C.

PROCEDIMIENTO Sembrar el material en estudio, en tubo o placa según la preferencia. Incubación Hasta 3 días a 35-37 °C, en aerobiosis. RESULTADOS Microorganismos Crecimiento Hidrólisis de la Esculina Oscurecimiento

Enterococcus faecalis ATCC 29212 Bueno +

Proteus mirabilis ATCC 43071 Bueno -

Streptococcus pyogenes ATCC 19615 Inhibido Inhibi do Inhibido

+

-

Inhibido

CARACTERÍSTICAS DEL MEDIO: Medio preparado: ámbar u oscuro ligeramente opalescente. El medio con esculina tiene un leve tinte azulado.

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METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS

OXIDACIÓN FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS – (GLUCOSA) FUNDAMENTO: Determinan el metabolismo oxidativo o fermentativo de un hidrato de carbono o su falta de utilización. Se usa el medio OF de Hugh y Leifson que contiene peptonas e hidratos de carbono en una relación 1:5. Al ser menor la concentración concentración de peptonas, hay menor producción de productos de oxidación a partir de los AA que tienden a elevar el pH y pueden neutralizar los ácidos débiles producidos por los microorganismos no fermentadores. fermentadores. El medio medio posee posee azul azul de bromotimol como indicador de pH. El test es útil en la diferenciación de los Géneros incluidos en la Familia Micrococcaceae como para diferenciar miembros de la Familia Enterobacteriaceae de las Pseudomonas . PROCEDIMIENTO: Se utilizan 2 tubos con el medio O-F glucosa o lactosa o cualquier otro carbohidrato por cada agente a estudiar. Se hace la siembra profunda con aguja de platino. Uno de los tubos queda expuesto al aire, y el otro se cubre con parafina estéril (1,5 a 2 cm de alto) para crear condiciones anaerobias. Se incuba a 37°C por 24 horas y hasta 14 días dependiendo del microorganismo. microorganismo. Los organismos oxidativos y fermentativos utilizan el carbohidratos tanto el tubo aeróbico (sin parafina) como en el anaeróbico, acidifican el medio y provocan el viraje del color del indicador de verde a amarillo. Los microorganismos oxidativos sólo podrán utilizar el carbohidrato en el tubo aeróbico. Como la producción de ácido en algunas especies puede ser lenta, se recomienda incubar el medio por 7-14 días, a menos que se observe cambio con anterioridad.

INTERPRETACIÓN: Microorganismos oxidativo: producen ácido solo en el tubo expuesto al O 2 atmosférico. Por lo que solamente el tubo expuesto al aire atmosférico cambia su color original a amarillo. Microorganismos fermentadores fermentadores: producen ácido en los 2 tubos. O sea que los dos tubos viran del verde al amarillo. Bacterias sacarolíticas : son inertes a este medio que conserva su pH alcalino después de la incubación, conservando su color original.

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POSITIVO

POSITIVO

NEGATIVO

POSITIVO

NEGATIVO

NEGATIVO

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HIDRÓLISIS DE CARBOHIDRATOS La mayoría de las bacterias utiliza un cierto número de carbohidratos como fuente de energía, ya sea por vía oxidativa, fermentativa o ambas, provocando acidificación del medio que se pone de manifiesto por el viraje de un indicados de pH incorporado al mismo. Algunas bacterias, producen también gas como producto de la fermentación del carbohidrato, lo que es también una característica de interés para su identificación. i dentificación. La investigación de la hidrólisis de distintos carbohidratos se realiza utilizando un medio basal como por ejemplo el Cysteina Trypticase Agar (medio o agar CTA), que es un medio semisólido, el Caldo Base Rojo de Fenol (rojo en medio neutro o alcalino; amarillo en medio ácido), el caldo base Púrpura Bromo Cresol (Violeta en medio neutro o alcalino y amarillo en medio ácido), etc. A los medios basales, conteniendo un indicador indicador de pH, se añade el azúcar a una concentración concentración final del 1%. a.- Medios líquidos: Cuando el medio basal es líquido, se reparte en tubos 12x120 mm o mayores, dentro de los cuales se introduce un tubo de pequeño diámetro o tubo de Durham, en posición invertida. Este tubo se llena completamente durante la esterilización, pues por efecto de la temperatura y la presión, se desplaza el aire contenido dentro de el. Procedimiento: El medio se siembra con el microorganismo en prueba, se incuba por 24-48 horas y se procede a la lectura, observando viraje del indicador y presencia o no de gas en el tubo Durham. b.- Medios semisólidos y sólidos: se procede igual, excepto que no requiere introducir tubos Durham, pues el gas que se pueda generar queda atrapado en el agar y se observa desplazamiento del mismo.

HIDRÓLISIS DE CARBOHIDRATOS (BROMOCRESOL PURPURA CON TUBOS DURHAN)

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HIDRÓLISIS DE CARBOHIDRATOS (CYSTEINA TRYPTICASE AGAR - CTA)

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MANITOL MOVILIDAD MOVILIDAD Se incluyen en este apartado 2 pruebas debido a que pueden realizarse cultivando el microorganismo en un único medio (el Manitol Movilidad), que se prepara en tubo con agar en taco y se siembra en picadura, incubándose a 37ºC durante 24 horas. También existe la posibilidad de hacer las pruebas en medios separados. l os gérmenes son capaces de fermentar Prueba del Manitol: Sirve para detectar si los el manitol liberando productos ácidos que serán detectados gracias al indicador rojo de fenol que cambiará a color amarillo. Para esta prueba el medio manitol movilidad incluye 7,5 g/l de D-Manita. Bacterias manitol (-) son, dentro de las enterobacterias, Proteus mirabilis , Proteus vulgaris y Shigella dysenteriae . Entre las bacterias de importancia clínica, la prueba del manitol sirve para Staphylococcus aureus (+) de Staphylococcus epidermidis (-). diferenciar Staphylococcus

Prueba de la Movilidad: Sirve para determinar si un organismo es móvil o inmóvil. Las bacterias tienen movilidad por medio de sus flagelos que se encuentran principalmente entre los bacilos aunque existen algunas for mas de cocos móviles. El medio manitol movilidad permite la realización de esta prueba gracias a ser semisólido ya que presenta solamente 3,5 g/l de agar. En estas condiciones, las bacterias móviles producirán un enturbiamiento homogéneo del medio debido a la distribución aleatoria de los microorganismos. Por el contrario, las bacterias inmóviles permanecerán en la misma línea de la l a picadura en que se sembraron. Entre las Enterobacterias, la movilidad nos permite diferenciar el género Klebsiella (-) de las restantes que suelen poseer movilidad (+). Dentro del género Bacillus , nos permite diferenciar B.anthracis (-) de otras especies generalmente (+).

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ROJO DE METILO FUNDAMENTO: La prueba del rojo de metilo (RM) se basa en el empleo de un indicador de pH, rojo de metilo, para determinar la concentración de iones hidrógeno presente cuando una bacteria cataboliza la glucosa. Con esta prueba se investiga si el microorganismo actúa por la vía ácido mixta sobre los azúcares, ésta es una vía metabólica en la que se producen ácidos del tipo fórmico, acético, láctico y succínico (ácidos muy fuertes dentro de la debilidad de los ácidos orgánicos). PROCEDIMIENTO: Se utiliza el medio de cultivo Caldo Rojo de Metilo/Voges-Proskauer (RM/VP), cuya composición es la siguiente: Peptona 7g Glucosa 5g K2HPO4 5g Agua destilada 1000 ml Este medio es líquido y se prepara y distribuye a razón de 5 ml por tubo de ensayo y se esteriliza en autoclave a 121ºC durante 15 minutos. La lectura se realiza agregando solución de rojo de metilo, en solución alcohólica al 0,2% (p/v). Una vez que se siembra y se deja incubar por 48 horas, se leen los resultados. RESULTADOS: Si el microorganismo ha producido ácidos a partir de la glucosa, se mantendrá rojo el indicador. Medio ácido indicador rojo RM (+) (Escherichia coli) Medio neutro indicador amarillo naranja. RM (-) (Klebsiella)

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VOGES-PROSKAUER: VOGES-PROSKAUER: ACETOINA FUNDAMENTO: La reacción de VP se basa en la detección del acetilmetilcarbinol (acetoína) a partir de le fermentación butanodiólica de la glucosa. Las bases bioquímicas de la prueba consideran que a partir del ácido pirúvico, una bacteria puede seguir vías metabólicas diferentes para la obtención de energía, según la composición de sus sistemas enzimáticos. Una de estas vías es la fermentación butanodiólica, cuyo producto final es el 2,3 butanodiol, en que la acetoína es su precursor. La prueba de VP se basa en la detección de este último metabolito. La acetoína que se produce en la fermentación cuando reacciona con el hidróxido de potasio (al 40% p/v) es oxidada a diacetilo, el que a su vez reacciona con los grupos guanidínicos de la arginina, que está presente en las peptonas que constituyen el medio, dando una coloración rojiza. PROCEDIMIENTO Para esta prueba se utiliza el mismo medio que se usa para la prueba del rojo de metilo. Se siembra el microorganismo problema y se incuba a 37ºC durante 48 horas. La lectura se realiza agregando el cultivo 6 a 8 gotas de una solución de KOH al 40% y luego 1 ml de solución alcohólica del alfa naftol al 5% (p/v). Se debe esperar hasta 20 minutos para realizar la lectura, tiempo en el cual se deja en la estufa, el cultivo con los reactivos agregados. RESULTADOS (NTERPRETACIÓN) (NTERPRETACIÓN) La formación de un anillo rosa fluorescente en la superficie del tubo indica que la prueba es positiva. Escherichia coli es VP Klebsiella sp es VP +

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KLIGER FUNDAMENTO: Permite determinar la capacidad de un microorganismo de metabolizar un hidrato de carbono específico incorporado a un medio de crecimiento básico así como la de producir gas y ácido sulfhídrico. Se utiliza para identificar diferentes especies bacterianas pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae . MATERIALES: - cultivos puros de bacterias crecidos 18-24 horas en agar nutritivo. - tubos en pico de flauta con agar hierro de Kligler, Kligl er, pH=7,4. PROCEDIMIENTO: 1.- Inocular cada uno de los l os microorganismos aislados por punción y por estría en el mismo tubo de medio agar hierro de Kligler. 2.- Incubar a 37 °C durante 18-24 horas. 3.- Observar entre las 18 horas y las 24 horas de cultivo (ni antes ni después). INTERPRETACIÓN INTERPRETACIÓN DE D E RESULTADOS: La utilización de un hidrato de carbono implica la liberación al medio de productos ácidos capaces de ser detectados por un indicador de pH. Si el microorganismo es incapaz de utilizar el hidrato de carbono, consume las peptonas del medio liberando productos que alcalinizan el medio. Cuando se interpretan los resultados de esta prueba deben analizarse los l os siguientes aspectos: A) Utilización del hidrato de carbono: - Si el microorganismo microorganismo en estudio sólo fermenta la glucosa: a) en superficie: reacción alcalina, color rojo. b) en profundidad: reacción ácida, color amarillo. - Si el microorganismo en estudio es capaz de fermentar tanto la glucosa como la lactosa: a) en superficie: reacción ácida, color amarillo. b) en profundidad: reacción ácida, color amarillo. - Si el microorganismo en estudio no es capaz de fermentar la glucosa ni la lactosa (no entérico): a) en superficie: reacción alcalina, color rojo. b) en profundidad: si el microorganismo es aerobio no se observa crecimiento ni cambio de color; si el microorganismo es facultativo, reacción alcalina, color rojo. - Si el microorganismo en estudio no es capaz de fermentar la glucosa pero si de oxidarla: a) en superficie: reacción ácida a tiempos t iempos cortos y luego alcalina, color rojo. b) en profundidad: no se observa crecimiento ni cambio de color.

B) Producción de gas: Si el microorganismo en estudio es aerogénico, la producción de H2 y CO2 se manifiesta mediante la formación de una o varias burbujas o el desprendimiento desprendimiento del medio del fondo del tubo dejando un área clara. 22


Si el microorganismo microorganismo en estudio es anaerogénico, no hay producción de gases.

C) Producción de ácido sulfhídrico (SH2): Si el microorganismo microorganismo en estudio produce este ácido, se manifestará por la presencia de un precipitado negro de sulfuro de hierro en la parte profunda del tubo. Si el microorganismo en estudio no produce este ácido, se manifestará por la ausencia de dicho precipitado.

1.- Glucosa (+), Lactosa (-), H 2S (-), Gas (-) 2.- Glucosa (+), Lactosa (+), H 2S (-), Gas (-) 3.- Glucosa (-), Lactosa (-), H 2S (-), Gas (-) 4.- Glucosa (+), Lactosa (+), H 2S (-), Gas (+) 5.- Glucosa (+), Lactosa (-), H 2S (-), Gas (+) 6.- Glucosa (+), Lactosa (-), H 2S (+), Gas (+) 7.- Glucosa (+), Lactosa (+), H 2S (+), Gas (+) 8.- Glucosa (-), Lactosa (-), H 2S (+), Gas (-) 9.- Glucosa (+), Lactosa (+), H 2S (+), Gas (+)

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HIDRÓLISIS DE ALMIDÓN Permite investigar la presencia en el microorganismo en estudio de una enzima capaz de hidrolizarel almidón. Esta enzima es muy común en distintos miembros del género Bacillus .

MATERIALES: - Cultivos puros de bacterias crecidos 18-24 horas en agar nutritivo. - Placas de Petri con agar almidón. - Lugol. PROCEDIMIENTO: 1.- Sembrar el microorganismo microorganismo en estudio por estría estr ía en una placa con agar almidón. 2.- Incubar a 37 °C hasta observar desarrollo. desarrollo. 3.- Inundar la placa con lugol. 4.- Dejar actuar 10 minutos. 5.- Observar la coloración. INTERPRETACIÓN INTERPRETACIÓN DE D E RESULTADOS: Prueba positiva: halos de degradación (marrones o transparentes) alrededor de las colonias sobre fondo azul. Prueba negativa: ausencia de halos; coloración azul alrededor de las colonias (presencia de complejo Iodo-almidón). 

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ENZIMAS SISTEMA TRANSPORTE ELECTRONES CATALASA La catalasa es una enzima respiratoria, es una porfirina de hierro cuya funcion es desdoblar los peroxidos en H2O y O2. Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra en la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. La principal excepción es Streptococcus . Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar los géneros: Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+). Bacillus (+) de Clostridium (-). Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+)de Erysipelothrix (-)   

Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede hacerse siguiendo dos técnicas:

1. Método del portaobjetos (recomendado): (recomendado): 

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Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio. Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H 2O2 al 30% sobre el microorganismo sin mezclarlo con el cultivo. Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo). Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante. Si se invierte el orden del método (extender la colonia sobre el agua oxigenada) pueden producirse falsos positivos.

2. Método del tubo de ensayo: ensayo: 

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Agregar 1ml de H2O2 al 3% directamente a un cultivo puro de agar en bisel densamente inoculado. Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).

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Precauciones: Si se utilizan para esta prueba cultivos procedentes de agar sangre, se debe tener la precaución de no retirar algo de agar con el asa al retirar la colonia ya que los eritrocitos del medio contienen catalasa y su presencia dará un falso resultado positivo.

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OXIDASA FUNDAMENTO: La Prueba de la Oxidasa hace una diferenciación inicial de las bacterias Gram. negativas. Se basa en que determinadas bacterias poseen las enzimas citocromo oxidasa o indofenol oxidasa, que catalizan el transporte de electrones. En esta prueba, un tinte incoloro, como el dihidrocloruro de p-fenilendiamina sirve como un aceptor artificial de electrones para la enzima oxidasa. El tinte es oxidado y forma el compuesto coloreado, azul de indofenol. Permite

diferenciar enterobacterias, distintas especies de Streptococcus , Staphylococcus y Micrococcus (-) de algunas especies de Pseudomonas u Aeromonas (+).

MATERIALES: - Cultivos puros de bacterias crecidos 18-24 horas en agar nutritivo. - Tiras de papel de filtro impregnadas en reactivo de Kovacs (1 naftol + dimetilparafenilendiamina). PROCEDIMIENTO: 1.- Levantar con el asa de platino una colonia del cultivo puro. 2.- Aplicar dicha colonia sobre la tira de papel de filtro embebida con el reactivo de oxidasa, asegurándose de extender bien el material. 3.- Esperar 5-10 segundos y observar la coloración. INTERPRETACIÓN INTERPRETACIÓN DE D E RESULTADOS: Prueba positiva: la tira de papel de filtro embebida en reactivo de oxidasa vira al color azul por oxidación de dicho compuesto a azul de indofenol. Prueba negativa: el color de la tira de papel de filtro embebida en reactivo de oxidasa no se modifica.

A

A: oxidasa positivo

B

B: oxidasa negativo 27


REDUCCIÓN DE NITRATOS Se determina la capacidad de un organismo de reducir el nitrato a nitrito o en nitrógeno libre. Muchos organismos pueden llevar a cabo una reducción no asimiladora del nitrato, que actúa como aceptor final de electrones. Este proceso es facultativo y se produce cuando hay disponibilidad de oxígeno muy baja o nula. Corresponde a una respiración anaerobia, es un proceso de oxidación por el cual las sustancias inorgánicas, especialmente el nitrato que proporciona el oxígeno para que sirva como aceptor de electrones para suministrar energía. La reducción del nitrato da lugar a nitrito como producto final, que a su vez puede ser reducido hasta la producción pr oducción de derivados gaseosos (desnitrificación). La presencia de nitritos en el medio de cultivo, originados por la reducción de los nitratos, puede detectarse con reactivos adecuados. El caldo base se debe ajustar a un pH = 7.0. Extracto de carne 3g Peptona 5g KNO3 1g Agua destilada 1L Una vez preparado el medio se coloca en tubos que deben contener campanas Durham para detectar producción de gases. Luego se esteriliza el medio a 121ºC durante 20 minutos.

PROCEDIMIENTO: Después de inocular los tubos, estos deben ser incubados a 37°C durante al menos 24 horas y hasta cinco días. Luego se procede a la lectura, observándose en primer lugar la presencia o no de gases. Luego se adicionan los reactivos de nitratos, un ml de solución A y un ml de solución B, a cada tubo. La aparición de un color rojo intenso indica la l a presencia de nitritos en el medio y por tanto la positividad de la reacción. A los casos que resulten negativos se les debe agregar granalla de zinc para determinar si los nitratos han sido reducidos, si aparece una coloración roja es debido a que en el medio existen nitratos; una ausencia ausencia de color color rojo indicaría que no hay nitratos en el el medio (estos han sido reducidos inicialmente a nitritos, y después a gas), siendo en este caso la prueba considerada como positiva. Reactivo A: Solución al 0,8% de ácido sulfanílico en ácido acético 5N. Reactivo B: Solución al 0,5% de alfa-naftilamina en ácido acético 5N. Ambas soluciones se se disuelven por calentamiento calentamiento suave. Esta prueba ayuda a la identificación de Enterobacterias que por lo general reducen los nitratos.

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COMPUESTOS COMO FUENTE ÚNICA DE CARBONO UTILIZACIÓN DE CITRATO Con esta prueba se determina si un microorganismo es capaz de utilizar el citrato como única fuente de carbono para el metabolismo, metabolismo, provocando una alcalinización en el medio. Los microorganismos que utilizan el citrato tienen la enzima citrato permeasa, que permite el paso del citrato a través de la membrana celular. El medio a utilizar para esta prueba es el Kocer Citrato (líquido) o Citrato de Simons (sólido e inclinado en tubo). Estos medios contienen citrato como única fuente de carbono, sales minerales, y además un indicador de pH, el azul de bromotimol.

INTERPRETACIÓN INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS: El medio en un principio es de color verde y cuando un microorganismo utiliza el citrato ocurre una alcalinización del medio, variando de verde a azul. Color azul en el medio, prueba del citrato + Color verde en el medio, prueba del citrato –

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OTRAS PRUEBAS PRUEBA DE EXTRACCIÓN DE PIGMENTO CON CLOROFORMO Esta prueba bioquímica permite investigar los pigmentos producido por cepas de Pseudomonas .

MATERIALES: - cultivos puros de bacterias crecidos 18-24 horas en agar nutritivo. - tubos con caldo nutritivo. - cloroformo PROCEDIMIENTO: 1.- Sembrar el microorganismo microorganismo en estudio en caldo nutritivo. 2.- Incubar a 37 °C. 3.- Agregar 1 ml de cloroformo al contenido del tubo y agitar. 4.- Observar los resultados. INTERPRETACIÓN INTERPRETACIÓN DE D E RESULTADOS: Prueba positiva: La fase f ase clorofórmica toma color azul verdoso por extracción de piocianina. Prueba negativa: La fase clorofórmica clorofórmica permanece amarilla (no ( no se extrajo pigmento).

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Practica Pruebas Bioquimicas 2012 Completa

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