2010
Pruebas Bioquímicas
ROJAS MORALES ALBERTO
Equipo 6
Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Estudios Superiores Zaragoza Laboratorio de Microbiología I 1651
UTILIDAD DEL MEDIO Es un medio semisólido destinado a verificar la movilidad, producción de indol y de sulfuro de hidrógeno en un mismo tubo. Es útil para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.
FUNDAMENTO El triptófano es un aminoácido constituyente de muchas peptonas, y particularmente de la tripteína, que puede ser oxidado por algunas bacterias para formar indol. En el proceso interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa. El indol producido se combina con el aldehido del reactivo de Kovac´s o de Erlich, para originar un compuesto de color rojo. Las cepas móviles pueden apreciarse en este medio, por la turbidez que producen alrededor de la punción de siembra, mientras que aquellas cepas productoras de sulfhídrico se distinguen por la formación de un precipitado negro de sulfuro de hierro a partir del tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2.
SIM, Medio SIEMBRA A partir de un cultivo de 18-24 horas en medio sólido, sembrar por punción profunda con aguja de inoculación recta (no usar ansa con anillo). Se debe inocular el centro del tubo, y la punción debe abarcar 2 tercios de profundidad del medio de cultivo desde la superficie. Es importante que la siembra se realice en línea recta.
INCUBACION Durante 24 horas, a 35-37 °C, en aerobiosis. Luego de la incubación, agregar 3-5 gotas de reactivo de Kovac´s o de Erlich.
RESULTADOS Cepas móviles: producen turbidez del medio, que se extiende mas allá de la línea de siembra. Cepas inmóviles: el crecimiento se observa solamente en la línea de siembra. Cepas SH2 positivas: ennegrecimiento a lo largo de la línea de siembra o en todo el medio. Cepas SH2 negativas: el medio permanece sin cambio de color. Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar el reactivo de Kovac´s o de Erlich. Cepas indol negativas: sin cambio de color.
Limitaciones -En las bacterias aerobias estrictas, que sólo crecen en superficie, la movilidad puede ser difícil de observar. -Algunas bacterias productoras de melanina como M. morganii, pueden dar un color parduzco, que no debe confundirse con el color negro debido a la producción de ácido sulfhídrico.
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Bacteria (medio ácido) + tiosulfato de sodio --------------SH2 + iones férricos------------- sulfuro ferroso (pp. negro)
gas SH2
Simmons Citrato Agar UTILIDAD DEL MEDIO Medio utilizado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la capacidad de usar citrato como única fuente de carbono y energía.
FUNDAMENTO
SIEMBRA
INCUBACION
RESULTADOS
En el medio de cultivo, el fosfato monoamónico es la única fuente de nitrógeno y el citrato de sodio es la única fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimático. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino. El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar citrato como única fuente de carbono, usan sales de amonio como única fuente de nitrógeno, con la consiguiente producción de alcalinidad. El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a través del ciclo del ácido tricarboxílico. El desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este último, en presencia de un medio alcalino, da origen a ácidos orgánicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la producción de citrato permeasa.
A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, sembrar en superficie un inóculo ligero , usando una ansa sin arrastrar el agar.
A 35-37 ºC, durante 24-48 horas, en aerobiosis. Algunos microorganismo s pueden requerir hasta 4 días de incubación.
-Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad. -Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo bacteriano y no hay cambio de color.
Limitaciones -Si se usa un inóculo denso para sembrar el medio de cultivo, puede variar el color del pico del verde al amarilloamarronado. Esto no afecta el color verde del resto del medio de cultivo, pero puede afectar la visualización azul de un resultado positivo. -Inóculos muy densos, pueden originar resultados falsos positivos. -Cuando se siembra una serie de pruebas bioquímicas a partir del mismo cultivo, se debe esterilizar la aguja de inoculación antes de inocular la prueba del citrato o sino inocularla primero. Cualquier arrastre de materia orgánica puede originar resultados falsos positivos.
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UTILIDAD DEL MEDIO Medio de cultivo frecuentemente usado en microbiología de alimentos para la diferenciación de enterobacterias, en base a la fermentación de glucosa y lactosa, y a la producción de ácido sulfhídrico.
FUNDAMENTO
Kligler Hierro Agar SIEMBRA
En el medio de cultivo, la peptona de carne y la tripteína, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa y la glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de ácido sulfhídrico, el citrato 3+ de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe , los cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico. El agar es el agente solidificante. Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio ácido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el típico sulfuro de hierro de color negro.
A partir de un cultivo puro del microorganismo en estudio, sembrar el medio de cultivo, picando el fondo y extendiendo sobre la superficie del medio.
INCUBACI ON A 35-37°C durante 24 horas, en aerobiosis.
RESULTADOS
1-Pico alcalino/fondo ácido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo solamente fermenta la glucosa. 2-Pico ácido/fondo ácido (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo fermenta glucosa, y lactosa. 3-Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es no fermentador de azúcares. 4-La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el microorganismo produce gas. 5-El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce ácido sulfhídrico.
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UTILIDAD DEL MEDIO Medio universalmente empleado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la fermentación de glucosa, lactosa, sacarosa y a la producción de ácido sulfhídrico.
FUNDAMENTO
Hierro y Triple Azúcar, Agar SIEMBRA
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de ácido sulfhídrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+ , los cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico. Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol,el cual vira al color amarillo en medio ácido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el típico sulfuro de hierro de color negro.
A partir de un cultivo puro, sembrar en TSI, picando el fondo y extendiendo sobre la superficie del medio.
INCUBACI ON A 35-37°C durante 24 horas, en aerobiosis.
RESULTADOS 1-Pico alcalino/fondo ácido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo solamente fermenta la glucosa. 2-Pico ácido/fondo ácido (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa. 3-Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es no fermentador de azúcares. 4-La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el microorganismo produce gas. 5-El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce ácido sulfhídrico.
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UTILIDAD DEL MEDIO Se emplea en estudios de microorganismos proteolíticos que degradan la gelatina por la producción de gelatinasa.
FUNDAMENTO
SIEMBRA
Antes de emplear el agar como agente gelificante en la elaboración de los medios de cultivo se empleaba la gelatina. No obstante, presentaba inconvenientes tales como la presencia de determinados microorganismos que eran capaces de utilizar la gelatina, el medio se licuaba debido a la producción de gelatinasa. Actualmente, la capacidad de degradar la gelatina por parte de algunos microorganismos se utiliza como carácter en la determinación e identificación oficial.
Sembrar la muestra por picadura.
Gelatina Nutritiva INCUBACION Incubar el medio con el microorganismo a estudio a 20-22°C, o bien a la temperatura óptima para el microorganismo. Si la incubación se realiza a temperatura superior a los 20-22°C (la gelatina será líquida) antes de proceder a la lectura los cultivos deben enfriarse en la nevera para no dar falsos positivos. Por regla general se aconsejan incubaciones máximas de 14 días con lecturas cada 3, pero debe tenerse en cuenta que ciertos organismos pueden tardar hasta varios meses en licuar la gelatina.
RESULTADOS Positivo si hay licuefaccion de la gelatina despues de enfriarse. Negativo si la gelatina continua solida despues de enfriarse
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UTILIDAD DEL MEDIO
FUNDAMENTO
HIDRÓLISIS DEL ALMIDÓN. comprobar qué bacterias producen amilasa y son por tanto capaces de utilizar el almidón como nutriente
Las bacterias pueden usar alimentos macromoleculares; para ello, es necesario una hidrólisis extracelular preliminar, igual que sucede en los animales superiores. Las distintas bacterias elaboran para este fin una cierta variedad de enzimas extracelulares que se segregan al medio. El objetivo de esta práctica es comprobar qué bacterias producen amilasa y son por tanto capaces de utilizar el almidón como nutriente.
Agar almidon SIEMBRA Inocular en tres puntos equidistantes de la superficie de las placas (tocando suavemente con el asa un punto de dicha superficie) con las bacterias de prueba.
INCUBACION
RESULTADOS
Incubar a 35ºC durante 24-48 horas.
Inundar las placas con lugol. La presencia de un halo transparente alrededor de la colonia indica que la prueba es positiva, es decir que la bacteria ha hidrolizado el almidón mediante la amilasa.
las bacterias del género bacillus (B. thuringiensis y B. subtilis) producen amilasa.
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UTILIDAD DEL MEDIO Medio utilizado para diferenciar microorganismos en base a la actividad ureásica. Se utiliza para identificar bacterias que hidrolizan urea, tales como Proteus spp., otras enterobacterias y estafilococos.
FUNDAMENTO
Christensen Medio (Urea Agar Base). SIEMBRA
En el medio de cultivo, la tripteína y la glucosa, aportan los nutrientes para el desarrollo de microorganismos. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el rojo de fenol es el indicador de pH. Algunas bacterias hidrolizan la urea por medio de la enzima ureasa liberando amoníaco y dióxido de carbono. Estos productos alcalinizan el medio haciendo virar el rojo de fenol del amarillo al rojo. En este medio, la fermentación de la glucosa activa la enzima ureasa, acelerando la velocidad del metabolismo en aquellos organismos que hidrolizan lentamente la urea, como especies de Enterobacter o Klebsiella.
A partir de un cultivo puro de 1824 horas, estriar la superficie del pico de flauta. Algunos microorganismos pueden requerir mayor tiempo de incubación. Se recomienda no punzar la capa profunda para controlar el color.
INCUBACION
RESULTADOS
En aerobiosis, durante 24-48 horas a 35-37 °C.
En el proceso de degradación de la urea se produce amoníaco, éste hace variar el color del indicador Rojo de Fenol (de amarillo a rojo) poniéndose así de manifiesto la actividad ureasa.
Limitaciones -Bacterias que hidrolizan lentamente la urea, como ser Klebsiella, Enterobacter y Citrobacter, viran al color rojo-rosado de todo el medio de cultivo luego de varios días de incubación. -No calentar o sobrecalentar el medio de cultivo porque la urea se descompone facilmente.
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UTILIDAD DEL MEDIO El Caldo Rojo de Fenol y Sacarosa es utilizado para la diferenciación de cultivos puros, en base a su capacidad para fermentar la sacarosa.
FUNDAMENTO
CALDO ROJO DE FENOL Y SACAROSA SIEMBRA
La capacidad de las bacterias de fermentar carbohidratos es utilizada como un criterio para su identificación. El medio provee los requerimientos nutricionales para el crecimiento de los microorganismos y contiene Rojo de Fenol como indicador de pH. Este indicador fue utilizado por Vera obteniéndose resultados altamente confiables. La peptona provee la fuente de nitrógeno para el buen desarrollo de los microorganismos, el Cloruro de Sodio mantiene el balance osmótico del medio y el Rojo de Fenol actúa como indicador, virando de color rojo-naranja a amarillo en presencia del ácido producido por la fermentación del azúcar.
Inocular el medio con una gota de una suspensión hecha con un cultivo puro
INCUBACION
RESULTADOS
Incubar a 35 ± 2°C durante 4-18 horas con las tapas flojas. Examinar los tubos para evaluar crecimiento, producción de ácido y producción de gas
La presencia de un color amarillo indica la una reacción positiva para la fermentación de la Sacarosa. La presencia de una o más burbujas en la campana de Durham indica una reacción positiva para la producción de gas.
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UTILIDAD DEL MEDIO Medio de cultivo utilizado para diferenciar Morganella morganii biogrupo 1 y 2, Proteus spp. y Providencia spp., de la mayoría de otros miembros de la familia Enterobacteriaceae, en base a la presencia de la enzima fenilalanina deaminasa.
Fenilalanina Agar. FUNDAMENTO SIEMBRA En el medio de cultivo, el extracto de levadura aporta A partir de un los nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo cultivo puro de bacteriano. 18-24 horas, El aminoácido fenilalanina sufre la desaminación sembrar un oxidativa catalizada por la enzima fenilalanina inóculo denso deaminasa (es una flavoproteína), para producir ácido estriando la fenilpirúvico y amoníaco. La presencia del ácido superficie del fenilpirúvico se demuestra con el agregado de cloruro medio. férrico en medio ácido, con el cual se forma un quelato de color verdoso entre el ácido fenil pirúvico y los iones Fe3+. Además, en este medio se suele poner en evidencia la producción de pigmentos melánicos, como en el caso de Morganella morganii, Pseudomonas aeruginosa, etc.
INCUBACION Incubar de 18 a 24 horas a 3537 °C, en aerobiosis. Luego, se debe realizar el revelado: agregar unas gotas de una solución acuosa de cloruro férrico al 10% (código B15504-61).
RESULTADOS El análisis de los resultados debe realizarse dentro de los primeros 5 minutos. Positivo: desarrollo de color verde pálido a intenso en el pico de flauta y en el líquido de condensación. Negativo: sin cambios de color. El medio permanece amarillo debido al color del reactivo cloruro férrico.
Limitaciones No se recomienda realizar la lectura de la prueba después de los 5 minutos, debido a que disminuye la intensidad del color verde.
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Lisina Hierro Agar. UTILIDAD DEL MEDIO Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganism os, especialmente Salmonella spp., basado en la decarboxilació n/ desaminación de la lisina y en la producción de ácido sulfhídrico.
FUNDAMENTO En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa. El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la producción de ácido sulfhídrico. El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8. Por decarboxilación de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta. La decarboxilación de la lisina, tiene lugar en medio ácido, por lo que es necesario que la glucosa sea previamente fermentada. Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24 hs de incubación se observa el pico de color violeta debido al consumo de las peptonas, y el fondo amarillo. La producción de sulfuro de hidrógeno, se visualiza por el ennegrecimiento del medio debido a la formación de sulfuro de hierro. Las cepas de los géneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella, desaminan la lisina, esto produce un ácido alfa-cetocarbónico, el cual, con la sal de hierro y bajo la influencia del oxígeno forma un color rojizo en la superficie del medio.
SIEMBRA
INCUBACION
RESULTADOS
Por punción profunda con aguja de inoculación.
En aerobiosis, durante 24 horas a 3537 °C.
1- Decarboxilación de la lisina: -Prueba Positiva: Pico violeta/fondo violeta. -Prueba Negativa: Pico violeta/fondo amarillo. 2-Desaminación de la lisina: Pico rojizo/fondo amarillo. Esto sucede con cepas del género Proteus, Providencia y alguna cepas de Morganella spp. 3-Producción de ácido sulfhídrico: -Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio (especialmente en el límite del pico y fondo)
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UTILIDAD DEL MEDIO Medio utilizado para la realización del ensayo de Rojo de Metilo y Voges Proskauer. Es particularment e útil para la clasificación de enterobacteria s.
FUNDAMENTO En el medio de cultivo, la pluripeptona aporta los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano y la glucosa es el hidrato de carbono fermentable. La glucosa puede ser metabolizada por los microorganismos, a través de distintas vías metabólicas. Según la vía utilizada, se originarán productos finales ácidos (ácido láctico, ácido acético, ácido fórmico), o productos finales neutros (acetil metil carbinol). Esta diferencia en el metabolismo bacteriano, podría ser reconocida por la adición de un indicador como rojo de metilo, para revelar la presencia de productos ácidos, y por la adición de alfa naftol e hidróxido de potasio para evidenciar la presencia de productos finales neutros. Voges y Proskauer, describieron una coloración rojiza que aparecía después de adicionar hidróxido de potasio a los cultivos de ciertos microorganismos en medio con glucosa. Esta coloración se debe a la oxidación del acetilmetil carbinol a diacetilo el cual reacciona con la peptona del medio para dar un color rojo.
MR-VP Medio SIEMBRA Por inoculación directa, a partir del cultivo en estudio.
INCUBACION
RESULTADOS
En aerobiosis, a 35-37°C por 3 días.
a-Prueba del rojo de metilo: Añadir unas gotas de una solución de rojo de metilo al 0.04%, observar el color del medio. b-Prueba del Voges Proskauer: Añadir 0,6 ml de alfa naftol al 5% en alcohol etílico absoluto y 0.2 ml de hidróxido de potasio al 40% a 2.5 ml de cultivo. Agitar vigorosamente el tubo, y dejar a temperatura ambiente durante 10-15 minutos. Observar el color de la superficie del medio. Resultados 1-Prueba del rojo de metilo: Positivo: color rojo. Negativo: color amarillo.
2-Prueba de Voges Proskauer: Positivo: desarrollo de un color rojo en pocos minutos después de una completa agitación del tubo. Negativo: ausencia de color rojo. Limitaciones En algunas cepas positivas para la prueba VP, pueden no desarrollar el color rojo en la superficie mediante el revelado por la metodología descripta anteriormente. En estos casos, se recomienda calentar el medio de cultivo para favorecer el desarrollo de color rojo.
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UTILIDAD DEL MEDIO Medio para la diferenciación de bacilos Gramnegativos, basado en la determinación del metabolismo oxidativo y/o fermentativo de los carbohidratos
FUNDAMENTO
OF, Medio Basal SIEMBRA
La peptona de caseína y el azúcar añadido constituyen la base nutritiva y energética del medio. El Azul de Bromotimol permite identificar las variaciones del pH. El di-Potasio Hidrógeno Fosfato actúa como regulador del pH y el Sodio Cloruro aporta la salinidad necesaria para el buen crecimiento de los gérmenes. Los ensayos se hacen por duplicado en dos tubos, uno cubierto con aceite de vaselina (F) y otro sin (O). Además del cambio de color del indicador (de verde a amarillo) es necesario observar la producción de gas y el tipo de crecimiento obtenido.
Sembrar un tubo (O) y otro (F) por picadura a partir de un cultivo puro de la cepa que se desea estudiar.
INCUBACION
RESULTADOS
Incubar a 35±2ºC de 48 horas a 7 días.
. Los microorganismos fermentadores dan reacción en los dos tubos. Los oxidativos sóloen el tubo sin vaselina. La degradación oxidativa (color amarillo) sólo se observa en la parte más cercana a la superficie del tubo mientras que en la fermentativa, se observa el color amarillo, en toda la columna del medio. Los inactivos no provocan cambio en ningún tubo. También puede observarse si la cepa en estudio es inmóvil (crecimiento sólo en el canal de picadura) o móvil, (turbidez en toda la columna con medio)
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Glucosa Nitrato Agar. UTILIDAD DEL MEDIO Medio desarrollado por Casellas, para estudiar simultáneamente la reacción de oxidación o fermentación de glucosa y la reducción de nitratos a nitritos, por bacilos Gram negativos de fácil desarrollo. Esta prueba es útil para diferenciar especies bacterianas.
FUNDAMENTO
SIEMBRA
INCUBACION
RESULTADOS
En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de carne aportan nutrientes para el desarrollo bacteriano. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, la glucosa es la fuente de energía y el azul de bromotimol es el indicador de pH. El nitrato de potasio es el sustrato de la enzima nitrato reductasa. El contenido de agar, otorga la propiedad de ser un medio semisólido, que permite determinar la movilidad y la distribución de los productos ácidos sobre la superficie o en el medio de cultivo. Algunas bacterias pueden fermentar anaeróbicamente la glucosa, otras la oxidan y algunas pueden metabolizarla por ambos métodos, mientras que otras son incapaces de usarla. Asimismo, las bacterias muestran diferencias en los ciclos utilizados para esos procesos finales. Estas diferencias ayudan a la identificación bacteriana. La hidrólisis de la glucosa acidifica el medio, haciendo virar el azul de bromotimol de verde a amarillo. Si este viraje ocurre solo en la parte superior del tubo, indica oxidación de la glucosa; si todo el medio vira al amarillo, hay reacción fermentativa, y si no vira o adquiere un color azulado, se presume que el gérmen no utiliza glucosa. En este medio, además, puede detectarse la movilidad observando si el crecimiento se aleja de la línea de punción, enturbiando el medio. La reducción del nitrato a nitrito o gas nitrógeno por medio de la enzima nitrato reductasa, es un proceso de oxidación por el cual el nitrato proporciona oxígeno para ser usado como aceptor de electrones. El nitrito presente en el medio puede detectarse con el reactivo de Griess A (B15-501-61) y Griess B (B15-502-61) Britania, dando un compuesto diazoico coloreado. Si se observan burbujas en el medio, éstas son de gas nitrógeno, ya que el nitrito intermediario inhibe las decarboxilaciones.
Por punción en profundi dad con ansa recta, a partir de un cultivo puro de 24 horas.
Durante 48 horas, a 3537 ºC, en aerobiosis. Algunos microorganis mos requieren hasta 4 días, y otros hasta 14 días de incubación.
1-Metabolismo de la glucosa: -Microorganismos oxidativos: color amarillo en la parte superior del tubo. -Microorganismos fermentadores: color amarillo en todo el medio de cultivo. -Microorganismos que no fermentan y no oxidan la glucosa: el medio permanece verde o adquiere un color azulado. 2-Movilidad: -Positiva: presencia de turbidez que se extiende mas allá de la línea de siembra. -Negativa: solo se observa turbidez en la línea de siembra. 3-Reducción de nitratos: -Positiva: desarrollo de color rosado-rojo luego del agregado de los reactivos Griess A y B. - Negativa: ausencia de color rosado rojo luego del agregado de los reactivos Griess A y B. . -Prueba Positiva: ausencia de color rosado rojo luego del agregado de Zinc. -Prueba Negativa: desarrollo de color rosado-rojo luego del agregado de Zinc.
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Notas: Los microorganismos que al reducir los nitratos a través de la enzima nitrato reductasa, liberan gas nitrógeno, producen un resultado falso negativo con la metodología detallada previamente. Por eso, ante un resultado negativo, agregar unas granallas de Zinc y observar el color desarrollado. Esto permitirá dar el resultado definitivo de la prueba de reducción de los nitratos Notas: frecuentemente, en la reducción de nitratos a nitritos, los productos finales pueden ser nitritos (NO 2), amoníaco (NH3), nitrógeno molecular (N2), óxido nítrico (NO), oxido nitroso (N22) o hidroxilamina (R-NH-OH).
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CATALASA UTILIDAD DEL MEDIO Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra el la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. La principal excepción es Streptococcus
FUNDAMENTO
INDICACIONES
los microorganismos que requieren la presencia de oxigeno para llevar a cabo sus reacciones metabólicas es decir como aceptor final de electrones, invariablemente se encontraran, con productos tóxicos derivados del oxigeno, como radicales superóxido y peróxido cuya acumulación es fatal en estos microorganismos, sin mencionar además de que neutrofilos y macrófagos tienen estas mismas sustancias toxicas para lisar y destruir a los microorganismos patógenos. Por lo que es de vital importancia que las bacterias aerobias y anaerobias facultativas dispongan de las enzimas necesarias para eliminar estas sustancias nocivas; como la catalasa , que a la vez resulta beneficiosa porque evita que diversos grupos de glóbulos blancos la fagociten y lisen, siendo este un factor de virulencia.
Método del portaobjetos (recomendado): Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio. Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre el microorganismo sin mezclarlo con el cultivo.
RESULTADOS 1.
Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).
Precauciones: Si se utilizan para esta prueba cultivos procedentes de agar sangre, se debe tener la precaución de no retirar algo de agar con el asa al retirar la colonia ya que los eritrocitos del medio contienen catalasa y su presencia dará un falso resultado positivo.
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