Informe de Laboratorio “Microbiología Ambiental” PRÁCTICA Nº 05 PREPARACIÓN EXTRACTO SUELO I.
INTRODUCCIÓN Para estudiar debidamente los microorganismos se necesita como requisito previo el cultivarlos en condiciones de laboratorio. Para lograr esto es preciso conocer cuáles son los nutrientes y las condiciones físicas que requieren. Mediante investigaciones extensas se han determinado, las necesidades nutricionales de los microorganismos, y esta información ha sido causa del desarrollo de numerosos medios de cultivo. Ya que las necesidades nutricionales de los microorganismos varían de manera muy amplia, existen diferencias muy importantes en cuanto a la composición de los medios empleados. Los microorganismos también tienen diferencias notables en lo que se respeta a las condiciones del ambiente que favorece su proliferación. Por ejemplo, algunas bacterias prosperan bajo 0ºC y pueden producirse aun a 700ºC. También para que un organismo crezca es necesario suplirlo con nutrientes y para los microorganismos es no es diferente. La mayoría de ellos necesita de ambientes específicos y nutrientes complejos para crecer y reproducirse. Por lo tanto durante el desarrollo de la microbiología, se torno claro que el cultivo y la preservación de microorganismos requieren medio de cultivo adecuado para cada género y especie. Algunos medios de cultivo mimetizan el ambiente natural el cual el microorganismo fue aislado y otros suplementos con ingredientes altamente nutritivos como sangre, tejidos y extractos de levadura. Algunas necesitan atmosfera de oxígeno, en cambio otras inhiben con el oxígeno o bien este elemento les es indiferente. Existen gran variedad de medios de cultivo en los cuales las diferentes especies en una muestra natural pueden ser aisladas y desarrollarse como cultivo puro, entre ellos tenemos: Agar Mac Conkey, Agar SS y Agar Extracto de Levadura.
II.
OBJETIVOS Preparación del extracto suelo. Utilización de autoclave.
III.
FUNDAMENTO TEÓRICO EL AGAR-AGAR Es un ficocoloide extraído principalmente, de las algas rojas o Rodoficeas, de las especies aragophytas. Es una sustancia amorfa, que en el comercio se encuentra en forma de polvo, escamas, bloques rectangulares y haces de tiras delgadas.
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Informe de Laboratorio “Microbiología Ambiental” La forma seca del Agar-Agar se conoce de mediados del siglo XVIII, cuando un japonés descubrió, accidentalmente, la manera de purificarlo y secarlo. Fue llevado de China a Europa y traído a América a mediados del siglo XIX, para utilizarse, principalmente, como substituto de la gelatina en la confección de postres gelatinosos. Químicamente, el Agar-Agar es una mezcla compleja de sales de polisacáridos, fundamentalmente, galactósidos. Las grandes moléculas que lo constituyen determinan sus cualidades sobresalientes, como coloides y espesantes, que lo han hecho hasta ahora insustituible. Además de los polisacáridos, el Agar-Agar contiene numerosos cationes asociados, tales como sodio, potasio, calcio, magnesio, etc. De los cuales no esta, claramente, establecida su influencia sobre las propiedades de este producto. Características Físicas del Agar-Agar En Estado Sólido: En este estado, el Agar-Agar es poroso, translucido y membranoso, se le encuentra, generalmente, presentando un color blanco- amarillento. En Solución: En solución se puede romper su equilibrio eléctrico, agregando sales como sulfato de magnesio, de sodio o de amonio, lo que produce la precipitación parcial de la agaropectina, siendo este método muy utilizado para la obtención de derivados. La viscosidad de las dispersiones de Agar-Agar es altamente influida por el tipo de alga y las condiciones del proceso utilizado. La viscosidad de una dispersión de Agar a 45ºC permanece relativamente constante, entre pH 4,9 y 9,0, que no es muy afectada por el tiempo, ni por la fuerza iónica, cuando el pH está entre 6,0 y 8,0 Como Gel: Por sus propiedades de acción protectora, su textura, elasticidad, transparencia relativa y reversibilidad es muy empleado como agente de suspensión, estabilización y espesamiento. Por existir muy pocos microorganismos que metabolizan el Agar-Agar o que elaboran enzimas capaces de degradarlo, le confiere una mayor estabilidad, con respecto a geles de otros coloides naturales, que lo hacen muy útil cuando es usado como mezcla con otros geles, polisacáridos y proteínas, en el sentido que la degradación marcada no ocurre cuando sus dispersiones son mezcladas. La temperatura de fusión de un gel es función de la concentración y del peso molecular. Un gel con una concentración de 1,5% en peso, funde entre 60ºC y 97ºC. Una característica muy importante en la calidad del Agar-Agar, es su resistencia a ser vencido, en estado de gel, por la presión. Esta fuerza de gel debe ser medida bajo ciertas condiciones y se define como la presión en gr/cm2 de superficie que resiste un gel, de concentración 1,5% en peso y durante 20 segundos a 20ºC. Ingeniería Ambiental
Informe de Laboratorio “Microbiología Ambiental” PEPTONA La peptona es una mezcla compleja de productos de la hidrólisis de la carne, obtenida por acción de diversos fermentos, especialmente la pepsina y la pancreatina. Descripción Se presenta como un polvo amorfo, o bien como escamas o masas irregulares, esponjosas, de color blanco amarillento o amarillo parduzco; con olor característico que recuerda al de la carne asada; de sabor amargo (peptona pancreática) o amargo y salado (peptona pépsica). Es muy higroscópica y por tanto se altera con facilidad en contacto con aire húmedo. Existen dos tipos de peptona: • Peptona pépsica, obtenida a Ph 2 por acción de la pepsina. • Peptona pancreática, obtenida a Ph 8 por acción de la pancreatina. Ambas están constituidas por mezclas de polipeptidos de diversos pesos moleculares, entre lo que se encuentran proteasas, peptonas, polipéptidos y aminoácidos libres EXTRACTO DE LEVADURA. Es un extracto soluble en agua de un autolisado de células de levaduras seleccionadas. Es una excelente fuente de nutrientes. El extracto de levadura es una rica fuente de vitaminas, especialmente vitaminas del complejo B, proporción de minerales y tiene baja cantidad de carbohidratos.
AGAR BACTERIOLÓGICO Es un agar procesado especialmente para ser utilizado como agente solidificante en medios de cultivo microbiológico. Sirve para el cultivo de microorganismo anaerobios o microaerofílicos, este ultimo debido a que el agar en pequeñas concentraciones restringe la convección de corrientes y permite tener diferentes grados de tensión de oxigeno.
Agar extracto de levadura: Medio nutritivo empleado para el recuento de microorganismos en aguas. AUTOCLAVE Una autoclave es un recipiente metálico de paredes gruesas con un cierre hermético que permite trabajar a alta presión para realizar una reacción Ingeniería Ambiental
Informe de Laboratorio “Microbiología Ambiental” industrial, una cocción o una esterilización con vapor de agua. Su construcción debe ser tal que resista la presión y temperatura desarrollada en su interior. La presión elevada permite que el agua alcance temperaturas superiores a su punto de ebullición. La temperatura y el vapor actuando conjuntamente producen la coagulación de las proteínas de los microorganismos, entre ellas las esenciales para la vida y la reproducción de estos, llevando así a su destrucción. La palabra autoclave no se limita a los equipos que funcionan con vapor de agua ya que los equipos utilizados para esterilizar con óxido de etileno se denominan de la misma forma. Funcionamiento. Las autoclaves funcionan permitiendo la entrada o generación de vapor de agua pero restringiendo su salida, hasta obtener una presión interna de 103 kPa, lo cual provoca que el vapor alcance una temperatura de 121 grados centígrados. Un tiempo típico de esterilización a esta temperatura y presión es de 15-20 minutos. Las autoclaves más modernas permiten realizar procesos a mayores temperaturas y presiones, con ciclos estándares a 134 °C a 200 kPa durante 5 min para esterilizar material metálico; llegando incluso a realizar ciclos de vacío para acelerar el secado del material esterilizado. El hecho de contener fluido a alta presión implica que las autoclaves deben ser de manufactura sólida, usualmente en metal, y que se procure construirlas totalmente herméticas. Las autoclaves son ampliamente utilizadas en laboratorios, como una medida elemental de esterilización de material. Aunque cabe notar que debido a que el proceso involucra vapor de agua a alta temperatura, ciertos materiales no pueden ser esterilizados en autoclave, como el papel y muchos plásticos (a excepción del polipropileno). Debido a que el material a esterilizar es muy probablemente de uso grabable, se requiere de métodos de testificación de la calidad de dicha esterilización, esto quiere decir que la presión y temperatura aplicadas serán distintas para cada uno de los productos autoclavados. Las autoclaves suelen estar provistas de medidores de presión y temperatura, que permiten verificar el funcionamiento del aparato. Aunque en el mercado existen métodos testigo anexos, por ejemplo, testigos químicos que cambian de color cuando cierta temperatura es alcanzada, o bien testigos mecánicos que se deforman ante las altas temperaturas. Por este medio es posible esterilizar todo tipo de materiales a excepción de materiales volátiles, por lo que se debe tener gran precaución. Usos Autoclave de uso médico. Usado para esterilizar instrumental y otro producto sanitario. Autoclave de laboratorio usado para esterilizar material de laboratorio. Autoclave industrial como los que se usan por ejemplo para el tratamiento de la madera expuesta a la intemperie, laminación de vidrio o tratamiento de composites.
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Informe de Laboratorio “Microbiología Ambiental” Autoclave de materiales compuestos usado para curar y conformar laminados de materiales compuestos poliméricos. Ventajas de una autoclave a vapor: El vapor saturado tiene algunas características, las cuales se convierten en ventajas; estas son: Calentamiento y penetración rápida de los textiles o telas. La destrucción de las esporas bacteriales más resistentes en un breve intervalo de exposición. El control fácil de la calidad y letalidad para los materiales y suministros. No deja residuo tóxico en los materiales después del proceso de esterilización. Es el agente esterilizador más económico. Son rápidas. Son seguras, ya que los autoclaves cuentan con medidores de Presión, Temperatura y Nivelado de Agua.
Manejo del Autoclave. Agregamos H2O destilada hasta la cintura.
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Luego colocamos la tapa interior y el agua debe sobre ella.
Colocamos la canastilla
Procedemos a poner la o las muestras, pero es recomendable rotular.
Cerramos en la forma que nos dan en las indicaciones.
Ponemos la perilla en 15 minutos y la temperatura a 121ºC
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Precauciones: - Tener en cuenta que el botón de vapor debe estar abierto para que salga el aire que se encuentra al interior.
IV.
-
Cuando el vapor empieza salir por el tubo de escape, que se encuentra en la parte inferior, entonces cerramos el botón de vapor.
-
También se debe mantener cerrado la perilla del agua.
-
También se observara la medición de la atmosfera, la aguja se pondrá en el color azul y cuando esta termine empezara a bajar hasta llegar al color amarillo.
MATERIAL Y MÉTODOS IV.1
MATERIALES
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Informe de Laboratorio “Microbiología Ambiental” IV.2
Peptona 5g Extracto de levadura Cloruro de Sodio Almidón soluble Agar bacteriológico Extracto de suelo 1000ml con pH=7 Agua destilada. Cocina eléctrica Balanza analítica. Espátula Matraz de 1000ml Bureta.
PROCEDIMIENTO
o
Primero tomamos la muestra del suelo y pesamos 50g sin partículas gruesas.
o
Una vez pesado el suelo se coloca en el matraz y aforamos con agua destilada (500mL) y procedemos a homogenizar haciendo movimientos circulares.
o
Luego se procede a filtrar para limpiar las impurezas que quedaron y procedemos a regresar nuevamente al matraz.
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o
Y finalmente tapamos el matraz con algodón y colocamos en el autoclave por 15 minutos a 121ºC x 1 Atm.
o
Una vez cumplido el tiempo en el autoclave, recién se empieza a pesar las siguientes sustancias. Pesamos la peptona 2.5g.
Extracto de Levadura 1.5g
Cloruro de sodios 1.5g
Almidón soluble 1g
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V.
Agar bacteriológico 7.5g
o
Luego procedemos a depositar todas las sustancias pesadas en el matraz con extracto de suelo. Homogenizamos en una cocina para diluir bien las sustancias.
o
Una vez homogenizada se procede a colocar nuevamente en el autoclave por 15 minutos a 121ºC x 1 Atm.
RESULTADOS.
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Informe de Laboratorio “Microbiología Ambiental” Se obtuvo extracto de suelo, listo para servir en las placas petri o tubos de ensayo, para posteriormente realizar el sembrado de microorganismos del suelo.
VI.
CONCLUSIONES Se puede concluir que la preparación de extracto de suelo son importantes debido los microorganismos que se desarrollan en el nos permiten identificarlos sin son útiles o dañinos para el desarrollo de las plantas o animales. Por otro lado una buena elaboración de extracto de suelo dará mejores resultados cuando se aplica la adecuada técnica de esterilización para no encontrar microorganismos contaminantes en el. El estudio de microorganismos, aislados a partir de muestras de suelo tienen una gran importancia, debido de que algunos de éstos se utilizan en la industria, para aislarlos se emplean métodos distintos dependiendo de las condiciones y características de los microorganismos. Según los resultados obtenidos se puede inferir que el suelo es la única fuente que contiene un sinnúmero de bacterias productoras de amilasa, pues otros productos o materiales tienen bacterias productoras de amilasa en pocas cantidades. La siembra en agar extracto de levadura es una medio de cultivo muy imprescindible porque nos permite hacer una primera selección de bacterias afines a dicho agar.
VII.
CUESTIONARIO IMPORTANCIA DE LOS MICROORGANISMOS DEL SUELO. Los microorganismos del suelo, son los componentes más importantes de este. Constituyen su parte viva y son los responsables de la dinámica de transformación y desarrollo. En un solo gramo de tierra, encontramos millones de microorganismos beneficiosos para los cultivos. Estos microorganismos beneficiosos que se encuentran en el suelo, son bacterias, actinomicetos, hongos, algas y protozoarios. Un suelo fértil es aquel que contiene una reserva adecuada de elementos nutritivos disponibles para la planta, o una población microbiana que libere nutrientes que permitan un buen desarrollo vegetal. Cuando se quema un bosque, observamos la importancia de todo lo que estamos diciendo, ya que muere toda la plantación, pero muere también el suelo de esta, por lo que tardará mucho tiempo en recuperarse.
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Informe de Laboratorio “Microbiología Ambiental” En la agricultura tradicional, se alternaban las líneas de cultivo en el suelo, o bien se dejaba descansar la tierra durante un tiempo. Actualmente, en la agricultura intensiva, el suelo apenas está sin cultivo, y se planta siempre en la misma línea de terreno, por lo degradamos el suelo rápidamente. Por todas estas razones, se está empleado lo que se denomina “Biofertilización”, que consiste en aumentar el número de microorganismos de un suelo, para de esta forma, acelerar todos los procesos microbianos, aumentar la cantidad de nutrientes asimilables por la planta, etc. Una biofertilización correcta, ayuda a una fertilización tradicional, reduciendo el uso de energía de la planta a la hora de absorber los distintos nutrientes, disminuye la degradación del agroecosistema y reduce la pérdida de nutrientes del suelo por lixividados, sobre todo de nitrógeno. Pero estos microorganismos actúan a la vez como agentes de control biológico, con lo que reducimos aquellos microorganismos indeseables en el suelo y favorecemos los organismos útiles para los cultivos, con lo que aumentamos la producción de la planta. Existen muchos hongos en el suelo que son beneficiosos para las plantas. Un hongo, está constituido por una serie de filamentos más o menos anchos, que se les denomina hifas. Al conjunto de hifas del hongo, se le denomina micelio. La forma de reproducción de los distintos hongos se realiza mediante las esporas, que se producen en los cuerpos fructíferos. La espora para un hongo, es algo similar a la semilla para una planta. El ciclo de vida de los distintos hongos que producen enfermedades en las plantas, es muy diferente de unos a otros. Todos comienzan con una espora que al germinar, produce una serie de hifas, que producirán una serie de cuerpos fructíferos, generándose nuevas esporas. Nos centraremos en unos hongos que son beneficiosos para el suelo y para la planta, y que se engloban dentro del Género Trichoderma. HONGOS DEL GÉNERO TRICHODERMA. El género Tricoderma está compuesto por hongos que se encuentran presentes en forma natural, en casi todos los suelos y hábitats del planeta. Es un Deutoromiceto perteneciente al grupo de los Hifomicetos, y se caracteriza porque se desarrolla rápidamente y emite gran cantidad de esporas verdes. Es un hongo que frecuentemente se encuentra sobre madera y tejidos vegetales en descomposición. Es un organismo dominante en los suelos, debido a su naturaleza agresiva y su capacidad metabólica para competir con la abundante microflora circundante. Al introducir en el suelo algún producto con este hongo, las cepas de Trichoderma germinarán y desarrollarán un micelio óptimo y necesario para
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Informe de Laboratorio “Microbiología Ambiental” actuar frente a los patógenos, que estén presentes en el suelo o que pudieran llegar a aparecer. Este hongo es fácil de aislar y reproducir, por lo que muchas empresas están apostando por su comercialización, ya que al aplicarlo al suelo beneficia a la planta como veremos posteriormente, y no la perjudica, ya que no puede penetrar en las raíces. VIII.
BIBLIOGRAFÍA Michael T. Madigan, John M. Martinko, Jack Parker; Biología de los Microorganismos; 8ª edición. Tay J, Gutiérrez QM, Rodríguez M, López R, Romero CR. Microbiología y Parasitología Médicas. Méndez Editores, 2ª. Ed. 1995: 850. Sánchez VJT, Tay ZJ, Robert GL, Romero CR, Ruiz SD, Rivas GC. Frecuencia de parasitosis intestinales en asentamientos humanos irregulares. Rev Fac Med UNAM 2000; 43(3): 80-84. Besednjak Dietrich, Alejandro (2005). « Autoclave». Materiales compuestos: procesos de fabricación de embarcaciones. Ediciones UPC. pp. 132.
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