Practica 2 UAM energia y consumo de sustancias fundamentales

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA METROPOLITANA TRONCO COMUN DIVISIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS  Y DE LA SALUD. SALUD. MODULO: MODULO: ENERGIA Y CONSUMO DE SUSTANCIAS SUSTANCIAS FUNDAMENTALES. PRACTICA No. 2 DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS. METODO DE BIURET INTEGRANTES:

Feria Zarate Nataly Citlalli Hernández García Juan Carlos Martínez Martínez Sharon Elideth Martínez Zamora Eugenia Aleandra !"rez #íos $aniela %izeth

1

OBJETIVO: • •

Manejar en el laboratorio el método de Biuret para determinar proteínas. Observar y determinar experimentalmente el efecto del pH sobre las proteínas de la leche.

GENERALIDADES: •

nvesti!aci"n biblio!r#$ca de los estudiantes sobre colorimetría y punto isoeléctrico de proteínas.

MATERIAL POR EQUIPO:           

1 probeta de %& ml 2 !radillas 2 pipetas de 1& ml ' pipetas de % ml 1 pipeta de 1 ml  (ubos de 1% x 1&& ) 12 pie*as 1 vaso de precipitados de 1&& ml 12 tubos de 1+ x 1%& 1 balan*a !ranataria ,apel para$lm para 1& tubos -i es necesario 1 embudo y papel $ltro.

REACTIVOS POR EQUIPO:   

/!ua destilada. -oluci"n de #cido acético &.1 0 -oluci"n de acetato de sodio &.1 0 -oluci"n de caseína concentraci"n  m!3ml4 5eactivo de Biuret %& ml.

APARATOS POR EQUIPO:    

1 centrífu!a clínica 1 balan*a !ranataria 2 espectrofot"metros  celdas

LOS ALUMNOS DEBERAN TRAER POR EQUIPO:    

+ !r. /proximadamente de leche en polvo descremada 1 plum"n indeleble Mas6in! tape.  7ab"n y franela para limpiar.

DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICO.

2

,unto isoeléctrico8 9l punto isoeléctrico es el pH al :ue un poli anfolito tiene car!a neta cero. 9l concepto es particularmente interesante en los amino#cidos y también en las proteínas. / este valor de pH la solubilidad de la sustancia es casi nula. ,ara

calcularlo se deben utili*ar los p; a.

,ara la determinaci"n del punto isoeléctrico se prepar" en una serie de tubos soluci"n amorti!uadora de acetatos junto con #cido acético y acetato de sodio a la si!uiente concentraci"n8  (
-oluci"n #cido acético &.1 0 % ml  ml ' ml 2 ml 1 ml

-oluci"n acetato de sodio &.1 0 1 ml 2 ml ' ml  ml % ml

,osteriormente se prepar" la me*cla de leche en polvo descremada y a!ua destilada para la determinaci"n del punto isoeléctrico la concentraci"n $nal de la leche diluida es de 18% / la soluci"n preparada anteriormente (ubos 1=+4 se le a!re!o a cada tubo 1ml de la leche diluida 18%4 y se me*cl" por inversi"n cada tubo dej#ndolo reposar por 1& minutos 9n este punto se observa el aspecto de las me*clas preparadas se nota :ue el tubo >' presenta !rumos de leche suspendidos en la soluci"n esto se debe a :ue las proteínas de la leche se han insolubili*ado debido al pH de la soluci"n este pH es nuestro punto isoeléctrico. ,unto soeléctrico8 Tubo !

So"u#$%& '#$(o )#*+$#o ,.- N: !".

So"u#$%& )#/+)+o (/ 0o($o ,.- N: 2".

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS CON EL METODO DE BIURET. Método de Biuret8

'

-e basa en la formaci"n de un complejo coloreado entre el ?u2@ y los !rupos 0H de los enlaces peptídicos en medio b#sico. 1?u2@ se acompleja con  0H. Aa intensidad de coloraci"n es directamente proporcional a la cantidad de proteínas enlaces peptídicos4 y la reacci"n es bastante especí$ca de manera :ue pocas sustancias inter$eren. Aa sensibilidad del método es muy baja y s"lo se recomienda para la cuanti$caci"n de proteínas en preparados muy concentrados en este caso la disoluci"n de leche en polvo. ,ara esta determinaci"n la soluci"n preparada anteriormente y pasado los 1& minutos de reposo se centrifu!aron los tubos a 2%&& r.p.m. durante 1& minutos y se separ" el sobrenadante trans$riéndolos a tubos limpios de 1% x 1&& rotulados con el nmero de tubo :ue les corresponde. /parte se preparan tubos numerados del  al C se aDaden los reactivos como se indica en la si!uiente tabla  (ubo

&





C

C

1

2

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

%

+

&. E m l &

1 ml

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  &. + m l &

& ml

&.  ml

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Sob1/&)()

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&. 2 m l &

Sob1/&)()

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Sob1/&)()

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Sob1/&)() /!ua

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1 ml

&. E

&. +

&. 

&. 2

& ml

&. %

&. %

&. %

&. %

&. %

&. %

So"u#$%& P)+1%&  34"

R/)#+$5o (/ B$u1/+

.& ml a todos los tubos

-e mescla cuidadosamente cada reactivo y se deja en reposo '& minutos para favorecer el desarrollo de color. ,osteriormente se calibra el espectrofot"metro con el tubo & y se dispone a calcular la absorbancia o densidad "ptica a cada tubo obteniendo así los si!uientes resultados8 RESULTADOS

TUBO I II III IV 1 2 3 4 D.O &.&1E &.&% &.&E &.11E &.&+F &.&E2 &.&2 &.& &. &.+ &.E 1 & &.F &.E Gr DE &.2

5 &.'1 &

6 &.2G &



PROTEIN  A Proteína

M34"

M34-,,"

Sobrenadante 1

&.&2

2.

Sobrenadante 2

&.&2'

2.'

Sobrenadante 3

&.&G

2.

Sobrenadante 4

&.&2%

2.%

Sobrenadante 5

&.&'

'

Sobrenadante 6

&.2'%

2.'%

,osterior se calcula el ,H del tubo con mayor precipitaci"n de caseína usando la ecuaci"n de Heenderson=Haselbach. ECUACIÓN DE 8ENDERSON98ASSELBALC8 esarrollo8 -up"n!ase un #cido AH con disociaci"n parcial. 9l e:uilibrio es8

 I la constante de disociaci"n asociada ser#8

espejando

de la constante de disociaci"n8

 (omando lo!aritmos a ambos lados y aplicando la propiedad de los lo!aritmos para un producto se lle!a a8

9 invirtiendo el cociente8

%

5esultado P); .!< !=-,>94 =-,>9 ? ,.@< "o3; 9,.-2.!<; .22 8; .22 ,H resultante8 ,H Jcido LEY DE RAMBERT9BEER “La absorbancia ! raiaci"n !#!c$ro%a&n'$ica (ro)cia (or )na !s(!ci! absorb!n$! !s ir!c$a%!n$! (ro(orciona# a #a $ra*!c$oria ! #a raiaci"n a $ra+'s ! #a iso#)ci"n * a #a conc!n$raci"n !n 's$a ! #a s)s$ancia ,)!  (ro)c! #a absorci"n-.

Aa absorbancia de una soluci"n es directamente proporcional a su concentraci"n a mayor nmero de moléculas mayor interacci"n de la lu* con ellas4K también depende de la distancia :ue recorre la lu* por la soluci"n a i!ual concentraci"n cuanto mayor distancia recorre la lu* por la muestra m#s moléculas se encontrar#4K y por ltimo depende de L una constante de

proporcionalidad denominada coe$ciente de extinci"n4 :ue es especí$ca de cada crom"fobo. →

→ →

aconstante de proporcionalidad absortividad es una propiedad intensiva de la materia y por tanto relacionada nicamente con la naturale*a de la misma. btrayectoria de la radiaci"n a través de la muestra cm4 cconcentraci"n !3l4  entonces a tiene unidades de lN!=1 Ncm =1

Aa absortividad pasa a denominarse absortividad molar y se expresa con el símbolo L cuando la concentraci"n est# en moles3litro4 y b en cm4 siendo sus unidades lNmol=1 Ncm =1. ?omo / es adimensional las dimensiones de L dependen de las de c y l. Aa se!unda ma!nitud l4 se expresa siempre en cm mientras :ue la primera c4 se hace siempre :ue sea posible en M con lo :ue las dimensiones de L resultan ser M=1Ncm=1. 9ste coe$ciente así expresado en términos de unidades de concentraci"n molar o un submltiplo apropiado4 se denomina coe$ciente de extinci"n molar LM4. ?uando por desconocerse el peso molecular del soluto +

la concentraci"n de la disoluci"n se expresa en otras unidades distintas de M por ejemplo !NA=1 las dimensiones de L resultan ser distintas por ejemplo != 1NANcm=1 y al coe$ciente así expresado se denomina coe$ciente de extinci"n específico Ls4. Aimitaciones8 Aa ley de Aambert=Beer se encuentran frecuentes desviaciones con relaci"n a la proporcionalidad directa entre absorbancias y concentraciones :ue limitan la aplicaci"n de la ley. Aas principales causas son8 





 

Aa concentraci"n. -"lo es aplicable a disoluciones diluidas menor 1&=2 M4K en disoluciones concentradas la distancia entre partículas absorbentes es tan pe:ueDa :ue se produce una modi$caci"n en la distribuci"n de car!as de las mismas lo :ue se traduce en una alteraci"n en la capacidad de absorci"n a una lon!itud de onda determinada. 9ste efecto se puede eliminar mediante diluci"n. Aa interacci"n entre el soluto y la radiaci"n debida a mecanismos diferentes a la absorci"n pero :ue producen alteraciones en la intensidad de la lu* tales como la dispersi"n reexi"n la uorescencia etc.
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