LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA “ PENENTUAN KADAR KOLESTEROL DENGAN METODE CHOD-PAP “
Disusun oleh: Hayu Ajeng Anggana Raras (098114004) Amelia Felicia Cornelius Putri (098114005) Kenny Ryan Limanto (098114006)
LABORATORIUM BIOKIMIA FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2010
PERCOBAAN V PENENTUAN KADAR KOLESTEROL DENGAN METODE CHOD-PAP
A. TUJUAN Menentukan kadar kolesterol dalam serum tikus dengan metode CHOD-PAP
B. DASAR TEORI Kolesterol adalah salah satu jenis lemak atau senyawa lipid di dalam tubuh. Tubuh memeperoleh kolesterol dari sumber makanan eksogen (diet) dan sintesis lemak endogen (diproduksi oleh tubuh). Kolesterol dalam beberapa lemak di dalam darah seperti trigliserida dan fosfolipid merupakan senyawa organic yang tidak larut di dalam plasama (cairan) darah, tetapi terikat oleh sutau protein yang disebut lipoprotein. Ada 5 jenis protein, yaitu kilomikron, very low density lipoprotein (VLDL), intermediet density lipoprotein (IDL), low density lipoprotein (LDL), dan high density lipoprotein (HDL). Kelima jenis lipoprotein tersebut, kilomikron dan VLDL lebih banyak mengandung porsi trigliserida, sedangkan LDL dan HDL lebih banyak mengandung porsi kolesterol (Mayes, 1995). Kolesterol adalah salah satu sterol yang penting dan terdapat banyak di alam. Dari rumus kolesterol dapat dilihat bahwa gugus hidroksil yang terdapat pada atom C nomor 3 mempunyai posisi β oleh karena itu dihubungkan dengan garis penuh.
H
H
H
HO
cholesterol
Kolesterol terdapat pula pada hampir semua sel hewan dan semua manusia. Pada manusia kolesterol terdapat dalam darah, empedu, kelenjar adrenal bagian luar (adrena kortex) dan jaringan syarat (Poedjiadi, 1994).
Serum adalah cairan tubuh yang mengandung system kekebalan terhadap suatu kuman. Serum terdapat dalam darah berupa cairan bening pada darah yang membeku (Seda, 2008). Biosintesis kolesterol dapat dibagi menjadi 5 tahap: i. Sintesis mevalonat, suatu senyawa 6- karbon dan asetil Ko-A. ii. Enam isoprenoid mengadakan kondensasi untuk membentuk senyawa skualena. iii. Unit isoprenioid dibentuk dari mevalonat melalui pelpasan CO2. iv. Skualena mengalami siklisasi untuk mengahsilakn senyawa steroid induk. v. Kolesterol dibenruk dari kolesterol setelah melewati beberapa tahap selanjutnya termasuk pelepasan 3 gugus metil. Sementara itu, pemeriksaan kadar kolesterol total menggunakan penetapan kadar kolesterol serum dengan metode enzimatik Fotometrik test CHOD-PAP (Cholesterol Oxidase Phenol Aminoantipyrin). Prinsip metode ini adalah penguraian kolesterol dan esternya menjadi peroksida dengan hidrolisa dan oksidasi enzimatik.
kolesterol ester
enzimkolesterol esterase
kolesterol (bebas + ester)
enzimkolesterol oksidase
H2O2 + fenol + 4-aminofenon
enzimperoksidase
O2
kolesterol + asamlemak
- 4 - kolestenon + H2O2
4-(p-benzoquinonemonoimin) fenazon
(Anonim, 2007).
C. ALAT DAN BAHAN Alat: 1. 2. 3. 4.
Mikrolab – 200 Sentrifuge Mikropipet Tabung reaksi
Bahan: 1. Serum/plasma darah tikus 2. Reagen: Buffer fosfat pH 6,5 Fenol
100 mmol/l 5 mmol/l
-
4-aminoantipirin
0,25 mmol/l
-
Kolesterol esterase
≥150 kU/l
-
Kolesterol oksidase
≥100 kU/l
-
Peroksidase
≥ 5 kU/l
D. SKEMA KERJA Ambil serum sebanyak 10 µl , ditambah reagen sebanyak 1 ml, divortex
Diamkan selama operating time (10 menit)
Ukur aktivitas serum dengan mikrolab-200 (λ= 505 nm)
Ukur serapan blanko dan standar sebelum melakukan pengukuran sampel
E. DATA DAN ANALISA Keterangan Standar 1 Standar 2 Standar 3 Sampel 1.1 Sampel 1.2 Sampel 2.1 Sampel 2.2 Sampel 3.1 Sampel 3.2
Kadar (mg/ dL) 187 612 27 11 57 46 61 73
∑(x − x̅)2 = n−1
SD =
Absorbansi 1,420 abs 0,474 abs 0,650 abs -
2660,834
n−1
Rerata
45,833
SD x
Larutan standar
x100% =
(x - ̅ )2
-18.833 -34,833 11,167 0,167 15,167 27,167
354,682 1213,338 124,702 0,028 230,038 738,046
∑(x − ̅ ) = 2660,834
= 23,069
Range ∶ x ± SD = 45,833 ± 23,069 = 68,902 CV =
(x - )
23,069 x100% = 50,333% 45,833
serum 1
mg
dL − 22,764
serum2
mg
dL
F. PEMBAHASAN Tujuan dari praktikum kali ini adalah untuk menetapkan kadar kolesterol dalam serum tikus menggunakan metode CHOD-PAP. Prinsip pengukurannya adalah kolesterol diukur setelah melalui proses oksidasi dan hidrolisis enzimatik. Indikator kuinonimin dibentuk dari hidrogen peroksida dan 4-aminofenanzon yang berasal dari fenol dan peroksidase. Reaksi : O
+ O C R
H2O air
Cholesterol Esterase / CHE
+
C
HO
O
kolesterol
kolesterolester
+
Cholesterol Oxidase / CHO
O2
+
HO
O
HO
kolesterol OH
hidrogen peroksida
+
OH
hidrogen peroksida
oksigen
HO
OH
R
asamlemak
cholestene-3one
N NH2
N O
4-aminofenanzon
+
OH Peroxidase/ POD
NH
+ O
kuinonimin
H2O air
Pertama-tama, darah tikus diambil pada bagian pembuluh darah sekitar mata tikus menggunakan jarum berongga. Kemudian darah tikus ditampung di dalam tabung sentrifuge dan kemudian di-sentrifuge dengan kecepatan 3000 rpm, selama 15 menit (ini merupakan waktu dan kecapatan yang optimum dalam memisahkan antara plasma darah dan serumnya). Prinsip dari sentrifuge adalah memisahkan serum dan plasma berdasarkan prinsip BJ, dimana plasma berwarna lebih merah tua pekat, sehingga berada pada bagian bawah tabung (BJ besar), sedangkan serum yang berwarna merah bening (BJ kecil) akan berada pada bagian atas tabung. Pada percobaan ini, reaksi yang terjadi adalah enzim kolesterol esterase akan memperantarai hidrolisis kolesterol ester menjadi kolesterol bebas dan asam lemak. Kemudian kolesterol bebas ini akan dioksidasi oleh enzim kolesterol oksidase yang akan menghasilkan kolestenon dan hidrogen peroksida. Pada tahap selanjutnya, hidrogen peroksida inilah yang akan bereaksi dengan 4-aminofenanzon dan fenol membentuk kompleks kuinonimin yang berwarna merah muda. Reaksi ini akan menimbulkan zat warna yang intensitasnya sebanding dengan kadar glukosa, yang kemudian dapat diukur secara fotometrik. Prinsip dari pengujian ini adalah dengan menembakkan panjang gelombang tertentu (dalam percobaan ini, digunakan λ = 546 nm) pada suatu senyawa. Karena cahaya yang ditembakkan mengandung energi ( = ℎ ), hal ini akan membuat λ elektron dari senyawa tersebut akan tereksitasi ke orbital yang lebih tinggi. Setelah mengalami eksitasi, elektron tersebut akan turun kembali ke ground state (keadaan dasar), sambil melepaskan emisi yang kemudian dapat diukur oleh Microlab-200. Salah satu yang memegang peran dalam pengujian ini adalah gugusan kromofor (ikatan rangkap terkonjugasi), yang dapat menangkap panjang gelombang tertentu. Setelah serum didapat , diambil sebanyak 10 µL dan ditambahkan reagen sebanyak 1000 µL dan di-gojog dengan tujuan agar serum dan reagen homogen. Larutan direplikasi sebanyak 2, sehingga masing-masing tabung berisi 10 µL serum dan 1000 µL reagen. Larutan blanko dibuat dengan mengambil aquadest sebanyak 10 µL. Tujuan dari pembuatan larutan blanko adalah untuk membuktikan bahwa aquadest (pelarut) yang digunakan tidak memiliki daya absorbansi (sama dengan nol)
sehingga ketika kita mengukur sampel, hanya kadar yang ingin kita ukur saja (kadar kolesterol) saja yang terbaca. Kemudian dibuat juga larutan standard yang berisi 1000 µL reagen dan 10 µL larutan standard kolesterol. Larutan standard ini sebagai pembanding kedua sampel yang ada. Kemudian campuran tersebut didiamkan selama 10 menit (operating time). Hal ini dimaksudkan agar supaya didapatkan hasil optimal di mana reagen dan serum bereaksi optimal. Setelah itu, dilakukan pengukuran aktivitas serum dengan Microlab-200 pada panjang gelombang 546 nm. Pada panjang gelombang inilah, diharapkan dihasilkan daya absorbansinya optimal. Pada saat akan menggunakan Microlab, pipa perlu dicuci dengan aquadest dengan tujuan supaya tidak terkontaminasi senyawa/ bahan-bahan sebelumnya karena dapat mengganggu dalam pembacaan selanjutnya. Pada data percobaan, standar 1 tidak dapat diukur kadarnya, karena larutan yang digunakan telah habis. Hal ini dikarenakan pipeting dari praktikan yang salah. Pada perhitungannya, didapatkan range kadar kolesterol sebesar 24,824 mg/ dL – 66,892 mg/dL. Dari range tersebut, angka yang tidak masuk dalam range data adalah sampel 1.2 (11 mg/ dL) dan sampel 3.2 (73 mg/ dL). Berdasarkan dengan pustaka yang diperoleh, dikatakan bahwa tikus putih mempunyai kadar kolesterol normal sebesar 10-54 mg/dL (Kotiah, 2007). Dari percobaan ini, ada angka-angka yang tidak sesuai dengan kadar kolesterol normal pada tikus putih. Hal ini mungkin disebabkan pengerjaan praktikan yang tidak teliti, sehingga angka yang dihasilkan tidak pada range hitung. Dari percobaan ini, didapatkan nilai presisi (akurasi) sebesar 50,333%. Hal ini menandakan percobaan yang dilakukan oleh praktikan tidak valid. Untuk mendapatkan nilai yang valid, angka CV/ presisi harus kurang dari sama dengan 2%. Hal ini mungkin dikarenakan pipeting dari praktikan yang tidak tepat, maupun pencucian alat yang tidak bersih, sehingga dimungkinkan tertinggalnya zat pengotor yang mengacaukan nilai kadar kolesterol yang didapatkan dengan alat Microlab-200. Fungsi dari kolesterol adalah memebentuk membrane-membran sel prekusor hormone steroid, pembentukan vitamin D, dan hormron-hormrno reproduksi.
G. KESIMPULAN 1. Dari percobaan yang telah dilakukan didapatkan data sebagai berikut: a. Range kadar kolesterol yang didapat sebesar 22,764 mg/ dL – 68,902 mg/ dL, b. Kadar rata-rata dari kolesterol yang diuji sebesar 45,833 mg/ dL. 2. Kadar kolesterol terbesar sebesar 73 mg/ dL, kadar kolesterol terkecil sebesar 11 mg/ dL. 3. Reaksi dalam percobaan ini adalah
H. DAFTAR PUSTAKA Anonim,
2007, http://cantik-sehat.com/news/2007/02/20/perasan-segar-buncis/, diakses pada tanggal 26 april 2010 Kotiah, A., PENGARUH PEMBERIAN EKSTRAK LIDAH BUAYA TERHADAP KADAR KOLESTEROL HDL DAN LDL SERUM TIKUS PUTIH HIPERKOLESTEROLEMI , http://digilib.unnes.ac.id/gsdl/collect/ skripsi/archives/HASH0172/9cec3420.dir/doc.pdf, diakses pada tanggal 26 April 2010 Mayes, D., 1995, Biokimia Harper edisi 22, 302-303, EGC, Jakarta Poedjiadi, 1994, Dasar-Dasar Biokimia, 74-75, Erlangga, Jakarta
Yogyakarta, 25 April 2010 Praktikan
Hayu Ajeng Anggana R (098114004)
Amelia Felicia C (098114005)
Kenny Ryan L (0988114006)
