PENENTUAN KADAR PROTEIN DALAM SAMPEL PUTIH PUTIH TELUR MELALUI METODE LOWRY
LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA Oleh Ni PutuCandraMahayani
NIM !!"!"#
Ni Made Willy Lara$hati Ana$ta$ia
NIM !!"!"%
I &u$tiAyuDe'iA(riyanti
NIM !!"!"))
I Putu Pandu Setia'an
NIM !!"!")*
+URUSAN PENDIDIKAN KIMIA ,AKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PEN&ETAHUAN ALAM UNI-ERSITAS PENDIDIKAN &ANESHA SIN&ARA+A )"%
PENENTUAN KADAR PROTEIN DALAM SAMPEL PUTIH TELUR MELALUI METODE LOWRY I.
TU+UAN
1. Membuat kurva hubungan antara konsentrasi protein standar dengan absorbansinya. 2. Menentukan kadar protein yang terdapat dalam putih telur dengan menggunakan metode Lowry.
II.
DASAR TEORI
Protein tersusun atas asam-asam amino yang dihubungkan dengan ikatan peptida. Asam amino merupakan molekul organik dengan massa molekul rendah (antara 100-200 a! yang mengandung setidak-tidaknya satu gugus karboksil (-"##$! dan satu gugus amino (-%$2!. (&ika'2010!. &elur merupakan salah satu sumber protein hewani yang banyak dikonsumsi masyarakat. alam protein (albumin! telur ini terkandung beberapa asam
amino
seperti
tirosin
dan
triptoan
()irahadikusumah'
1*+*!.
,omposisiputihtelurkandungan total protein 10-11 dasarbasah' ovalbulmin 0 dari total protein' /analbumin * dari total protein' ovoummu/oid 1 dari total protein. edangkankuningtelurterdiriatashipovitelindanhipotellenin. Penentuan konsentrasi proteinasam amino merupakan proses rutin yang digunakan dalam analisis kimia. alah satu tu3uan dari penentuan konsentrasi proteinasam amino ini adalah untuk mengetahui nilai gi4i dari suatu bahan makanan. Ada beberapa metode yang biasa digunakan dalam rangka menentukan konsentrasi protein' salah satunya adalah metode Lowry. Pemilihan metode yang baik dan tepat untuk suatu pengukuran tergantung pada beberapa aktor' seperti banyaknya material atau sampel yang tersedia' waktu yang tersedia untuk melakukan pengukuran' alat spektrootometer yang tersedia untuk melakukan pengukuran (5edhana' 2006!. 5eagen pendeteksi gugus-gugus enolik' seperti reagen 7olin-"io/alteu telah digunakan dalam penentuan konsentrasi protein oleh Lowry (1*81! yang kemudian dikenal dengan metode Lowry. alam bentuk yang paling sederhana' reagen 7olin"io/alteu dapat mendeteksi residu tirosin (dalam protein! karena kandungan enolik dalam residu tirosin yang mampu mereduksi reagen osotungstat dan osomolibdat men3adi tungstat dan molibdenum yang berwarna biru.5eagen osotungstat dan osomolibdat ini merupakan konstituen utama reagen 7olin-"io/alteu. $asil reduksi ini menun3ukkan
pun/ak absorpsi yang lebar pada daerah merah dari spektrum sinar tampak (900-+00 nm! (&ika' 2010!. ensitivitas dari metode 7olin-"io/alteu ini mengalami perubahan yang /ukup signiikan apabila digabung dengan ion-ion "u 2: (metode ;iuret!. ,ompleks "u-protein yang dihasilkan oleh reagen ;iuret akan menyebabkan reduksi pula pada os otungstat dan osomolibdat dalam reagen 7olin-"io/alteu. ,ira-kira 8 dari reduksi yang ter3adi diakibatkan oleh adanya kompleks "u-protein tersebut' sementara residu-r esidu tirosin dan triptoan mereduksi 28 sisanya (&ika' 2010!. 5eagen 7olin-"io/alteu merupakan suatu komposisi kompleks yang diperoleh dengan /ara pemanasan reluks dari %a-tungstat dan %a-molibdat dengan asam ortoosat. elain itu' disertakan pula komponen-komponen lain untuk meningkatkan kestabilan reagen yang dalam kondisi normal berwarna kuning pu/at (&ika' 2010!. Pada saat menentukan konsentrasi protein dalam suatu sampel' harus dilakukan pula pengukuran terhadap beberapa larutan protein standar yang memiliki rentang konsentrasi tertentu di mana konsentrasi sampel protein berada di dalam rentang tersebut (&ika' 2010!. Protein dimasukkan pertama kali ke dalam tabung reaksi' kemudian ditambahkan air. eluruh tabung harus mempunyai volume akhir yang sama dan dilakukan pengadukan atau pen/ampuran yang baik setelah penambahan 4at atau reagen. 5eagen penghasil warna selalu ditambahkan terakhir dan biasanya diperlukan selang waktu tertentu untuk ter3adinya reaksi yang sempurna (5edhana' 2010!. Pengukuran yang dilakukan terhadap larutan protein standar dan sampel menggunakanspektrootometer. Melalui pengukuran ini akan diperoleh absorbansi dari larutan standar dan sampel. pektrosotometri merupakan salah satu metode analisis instrumental yang didasarkan pada interaksi energi dan materi. pektrootometri mempunyai aplikasi yang /ukup luas pada analisis se/ara kuantitati. $asil pengukuran se/ara kuantitati menggunakan metode ini mempunyai akurasi yang tinggi' walaupun tidak seakurat metode instrumentasi serapan atom atau sinar gamma. Prinsip dasar pengukuran se/ara kuantitati adalah menggunakan hukum Lambert-;eer (&ika' 2010!. Langkah-langkah umum dalam analisis dengan spetrootometer adalah< 1! pembentukan molekul yang dapat menyerap /ahaya pada daerah => atau tampak? 2! pembuatan spektrum dan pemilihan pan3ang gelombang? ! pembuatan kurva kalibrasi? dan 6! pengukuran absorbansi /uplikan (Muderawan' 200*!.
$ukum Lambert-;eer men3abarkan pengurangan eksponensial dari intensitas radiasi yang diteruskan karena peningkatan aritmatik dari kadar 4at penyerap' sehingga diperoleh persamaan berikut (&ika' 2010!. log
I 0 I
=
A
1 = − log T = log T
@o@ disebut optical density (#! atau absorbansi (A!' sedangkan @@ o disebut transmitan (&!' yaitu proporsi radiasi yang diteruskan. ;ila & dikalikan dengan 100 disebut persen transmitansi (&!. engan menggunakan notasi-notasi yang merupakan penggabungan $ukum ;eer dengan $ukum ;ouguer' maka $ukum ;eer dapat dituliskan sebagai berikut< ABb" imana B merupakan absorptivitas molar yang nilainya tergantung pada pan3ang gelombang dan 3enis 4at' b merupakan tebal medium penyerap yang biasanya dinyatakan dalam sentimeter (/m!' " merupakan konsentrasi molar. elan3utnya konsentrasi molar larutan protein dapat dihitung melalui persamaan berikut< y mC : b dimana< y absorbansi C konsentrasi m kemiringan b intersep
III.
ALAT DAN BAHAN !. Alat Ta/el . atar Alat N0
Na1a Alat 2:
1 2 6 8 9
pektoronik 20 Delaskimia ;atangpengaduk Delasukur 8 mL Pipettetes Pipet volume 8 mL &abungreaksi
+u1lah 1 1 2 2 1 1
!.) Bahan Ta/el ). atar ;ahan N0
Na1a Bahan
+u1lah
1 2 6 8 + I-.
,ertas aring %a2"# %a#$ 0'1 % "u8$2# 0'8 %a-tartarat Larutan ;A Larutan Albumin &elur
e/ukupnya e/ukupnya e/ukupnya e/ukupnya e/ukupnya e/ukupnya e/ukupnya
PROSEDUR KER+A DAN HASIL PEN&AMATAN Ta/el !. Prosedur ,er3a dan $asil Pengamatan
N0 1
Pr0$edurKer2a
5eagen
biuret -
Ha$ilPen3a1atan 5eagen A dibuat dari 8 gram %a 2"# yang
dibuatdenganmen/ampurkanreagen
dilarutkan dalam 280 mL larutan %a#$ 0'1 %
A sebanyak 80 mL danreagen ; -
5eagen A tidakberwarna
sebanyak 1 mL
5eagen ; dibuatdari 0'29 gram "u#6. 8$2# dan
-
%a-tartarat yang dilarutkandalam 80 mLaguades -
5eagen ; berwarnabiru
-
Larutanreagen
buretdibuat
dengan
men/ampurkan reagen A (280 mL! dan reagen ; sebanyak 8 mL. 2
Larutan
5eagen buret berwarna biru Larutan albumin telurdibuatdenganmelarutkan
telurdibuatdenganmelarutkan 10 mL
10 mL albumin telurdalam *0 mLaEuades
albumin
mL -
Albumin
mL
setelahditambahaEuadeslarutanmen3adikeruh
aEuades'
telurkedalam 10
*0
telurberwarnakuning'
dari/ampuraninidien/erkanlagiseban -
"ampurandiambilsebanyak
yak 10 mL (pengen/eransampai 100
mLdandien/erkansampai 100 Ml
kali!
albumin -
-
10
Larutan ;A dibuat dengan 0'0 gram ;A dan
dilarutkan dalam 100 mL aEuades Larutan protein standar (;A! Penambahan 7enomena &abung 1 2 6 8 9 di/ampurdengan air (mL! "4 "4 "4 tandar hinggavolumenyamen3adi 1'0mL. - "4 "4) 5 % * (;A! $al yang tandar sama3ugadilakukanpadalarutansampe protein l protein. AEuades "47 "4* "4 "4 "4 %
Larutan berwarna bening
5
)
4 "
6
+ 6 4 " "4 7
2
ebanyak
8
mL
reagen
;iuret
dimasukkankedalammasingmasingtabung
yang
Penambahan (mL! 5eagen buret Larutan
berisilarutanstandardansampel. ,emudian/ampuraninidiinkubasisela
1
7enomena &abung 2 6 8 9
+
8
8
8
8
berwarna
8 bening.
8
8
8
Larutan
tersebut
diinkubasi selama F10menit
ma 10 menitpadasuhukamar.
etelah 10 menit' sebanyak 0'8 mL
Penambahan
reagenenol
(mL! 5eagen
(enolik-/io/elteu!
ditambahkankedalammasingmasingtabungreaksikemudiandiko/o k. &abung-tabunginidiinkubasiselama 0
enol Larutan
1 "4
7enomena &abung 2 6 8 9 "4#
# berwarna biru
"4#
"4
"4
"4
+
"4
"4
#
# # # # tua. Larutan tersebut
diinkubasi selama F0menit pada suhu kamar
menitpadasuhukamar.
)aktuinkubasidimulaisetelahpenamb ahanreagenenolik/io/elteukedalamtabungterakhir. Absorbansidarimasing-
6
&abung 1 2 6 8 9 +
masinglarutantersebutdiukurdengans pektronik 20:denganpan3anggelombang
00
nm.
-.
Absorbansi 0'828 0'68 0'6+8 0'680 0'660 0'20 0'2*0 0'260
ANALISIS DAN PEMBAHASAN
alam praktikum ini dilakukan analisis kadar protein dalam sampel larutan kuning telur dengan menggunakan metode Lowry. Prinsip metode Lowry adalah menentukan konsentrasi protein yang didalamnya terdapat asam amino yang mengandung gugus enolik seperti tirosin dan triptoan dengan menggunakan reagen pendeteksi gugus-gugus enolik' yaitu reagen 7olin-"io/alteu.imana salah satu residu dari asam amino yang memiliki gugus enolik adalah asam amino tirosin dan triptopan. Langkah pertama yang dilakukan adalah menyiapkan reagen 7olin-"io/alteu dan reagen ;iuret. etelah larutan ;iuret disiapkan selan3utnya dilakukan pembuatan larutan
sampel
protein
dengan
melarutkan
sebanyak
10
mL
albumin
telurdalamaEuadessampai volume 100 mL.kemudiansebanyak 10 mL larutan albumin telurtersebutdien/erkanlagidenganmenggunakanaEaudessampai 10 kali pengen/eran (volume 100 mL!. etelah dilakukan pengen/eran larutan albumin telur berubah dari bening tidak berwarna men3adi keruh. &u3uan dari pengen/eran ini yaitu untuk memperke/il konsentrasi sampel. #leh karena itu' dengan adanya pengen/eran' larutan sampel yang diukur akan mempunyai absorbansi diantara kurva kalibrasi' sehingga konsentrasi protein yang terkandung dalam kuning telur dapat diketahui. Langkah selan3utnya yaitu memasukan larutan standar ;A dan larutan albumin ke dalam tabung reaksi' larutan standar ;A yang diisi pada masing-masing tabung berbeda-beda' sesuai dengan prosedur ker3a. Pengisian tabung dengan volume berbeda beda ini bertu3uan untuk memberi variasi konsentrasi larutan standar protein (;A!' sehingga konsentrasi masing-masing tabung berbeda satu dengan lainnya. Pembuatan larutan
standar
dengan
konsentrasi
yang berbeda-beda
ini
bertu3uan
mempermudah pembuatan kurva kalibrasi. ,onsentrasi dari masing-masing tabung dapat dihitungdengan persamaan berikut< >1M1 >2M2 ,eterangan < >1 volume putih telur sebelum pengen/eran M1 konsentrasi putih telur sebelum pengen/eran >2 volume putih telur setelah pengen/eran M2 konsentrasi putih telur setelah pengen/eran ,onsentrasi dari masing-masing tabung dapat dihitungdengan persamaan berikut< >1M1 >2M2 ,eterangan < >1 volume putih telur sebelum pengen/eran M1 konsentrasi putih telur sebelum pengen/eran >2 volume putih telur setelah pengen/eran M2 konsentrasi putih telur setelah pengen/eran ,onsentrasi larutan standar protein putih telur ada lah 00 GgmL Tabung 1 : M2 =
&abung 2 < M 2
=
V1 M1 V2
>1 M 1 >2
=
0 mL x 300 µg/mL = 0 µg/mL 1,0 mL
0'1 mL C 00GgmL =
1'0 mL
=
0GgmL
untuk
&abung < M 2
=
&abung 6 < M 2
=
&abung 8 < M 2
=
&abung 9 < M 2 =
>1 M 1 >2 >1 M 1 >2 >1 M 1 >2 >1M1 >2
Tabung7 : M2 =
0'2 mL C 00GgmL =
0'6 mL C 00GgmL =
90GgmL
=
1'0 mL
=
1'0 mL
120GgmL
0'9 mL C 00GgmL =
=
=
1'0 mL
0'+ mL C 00GgmL
V1 M1 V2
1'0 mL
=
1+0GgmL
= 260GgmL
1,0 mL x 300 µg/mL =300 µg/mL 1,0 mL
Langkah selan3utnya' masing-masing tabung diisi dengan reagen ;iuret. etelah ditambahkan reagen ;iuret ter3adi perubahan warna larutan' warna larutan men3adi bening kebiruan. $al ini disebabkan karena terbentuknya kompleks "u 2: dengan asam amino pada larutan albumin.,ompleks yang terbentuk adalah sebagai berikut.
#
"
"
%$
$% "$5 #
#
"u2:
" $% "$5
5$" "
#
%$ 5$"
&a1/ar . truktur ,ompleks "u 2:
Pada saat larutan ditambahkan reagen ;iuret' larutan diaduk kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama F10 menit. &u3uan larutan diinkubasi adalah agar reaksi berlangsung sempurna dan tidak ter3adi penggumpalan pada larutan protein. etelah itu 7olin-"io/alteu dimasukan sebanyak 0'8 mL kedalam masingmasing
tabung.
etelah
"io/alteutampakter3adiperubahanpadalarutan'
penambahan
reagen
7olin-
dimanalarutanpadatabungberwarnabiru
tua. 5eagen 7olin-"iao/alteu dapat mendeteksi residu tirosin dalam larutan protein karena kandungan enolik dalam residu tirosin mampu mereduksi reagen 7olin"iao/alteu yang terdiri dari osotungstat dan osomolibdat men3adi tungstat dan molibdenum yang berwarnabiru.)arna ini dapat menyerap /ahaya pada daerah sinar tampak' sehingga transmitansi dan absorbansinya dapat diukur. )arna yang ditimbulkansetelahpenambahanreagen7olin-"io/alteumengindikasikan
terbentuknya
tungstat dan molibdenum.engan reaksi yang ter3adi adalah sebagai berikut<
$ 2 % #
# Mo
#
#
"
"
$ 2 %
#$
"$ 2
-
P
$
$
#
"
"
"$ 2 : $ P#6
Mo# 2 :
:
$# #$ 12 #$ kuning pu/at ( osomolibdat!
molibdenum (berwarna biru!
#
#$ $#
$2 %
#$
$
#
"
"
$2 %
#$
#
$
#
"
"
#$
"$2
"$2 )# 62- : tungstat (ion berwarna biru!
-
P)12# 60 : kuning pu/at (ion osotungstat! #$
: $ P#6
$#
#
&a1/ar ).5esidu &irosin Mereduksi 5eagen 7olin-"iao/alteu yang &erdiri ari
7osotungstat dan 7osomolibdat Men3adi &ungstat dan Molibdenum yang ;erwarna;iru
imana
kompleks
"u-protein
yang
dihasilkan
oleh
reagen
;iuret
3ugamenyebabkan reduksi pada osotungstat dan osomolibdat. Adanya ion-ion "u2:darireagen ;iuretmenyebabkan sensitiitas dari reagen 7olin-"io/alteu ini mengalami perubahan yang /ukup signiikan. $al inidapatdilihat dariwarna yang dihasilkankepekatannya meningkat dari tabung 1-+.
Langkahselan3unya' setelah penambahan reagen 7olin-"io/alteu' kemudian larutan diinkubasi selama 0 menit. )aktu inkubasi dimulai setelah penambahan reagen 7olin-"io/alteu ke dalam tabung terakhir. elan3utnya dilakukan pengukuran absorbansi masing-masing larutan. Pada metode ini digunakan alat spektronik 20: untuk menganalisis absorbansi larutan sampel dan larutan standar. ;erdasarkan hasil pengukuran' diperoleh nilai absorbansi sampel sebagai berikut. Ta/el 5. Absorbansi Larutan pada &iap &abung Ta/un3 &abung 1 &abung 2 &abung &abung 6 &abung 8 &abung 9 &abung &abung + (sampel!
A/$0r/a$i 8A9 0'88 0'68 0'6+8 0'680 0'660 0'20 0'2*0 0'260
;erdasarkan data di atas' dapat dibuat kurva kalibrasi sebagai berikut.
f(x) = - 0x + 0.52 R² = 0.83
A/$0r/an$i 8A9
20 0
60 40
80
100 140 180 220 260 300 120 160 200 240 280 320
Konsentrasi µg/mL
&a1/ar !. ,urva $ubungan Antara Absorbansi dengan ,onsentrasi Larutan tandar
Protein (;A!
Persamaan garis yang diperoleh dari kurva di atas adalah y -0'000C : 0'8196' dimana y adalah absorbansi (A! dan C adalah konsentrasi ("!' sehingga persamaan di atas 3uga dapat ditulis sebagai berikut. y -0'000C : 0'8196 A -0'000" : 0'8196 ;erdasarkan pengukuran dengan spektronik 20 :' diperoleh absorbansi sampel yaitu sebesar 0'26. ,onsentrasi sampel dapat ditentukan atau dihitung dengan /ara mensubstitusikan nilai absorbansi sampel ke dalam persamaan garis di atas' sehingga diperoleh< y
m" : b
0'26
-0'000" : 0'8196
-0'000" 0'26 H 0'8196 -0'000" 0'26 H 0'8196 "
*6'+9 GgmL
Iadi' kadar protein dalam sampel setelah dien/erkan (pada tabung +! adalah *6'+9. =ntuk kadar protein sebelum pengen/eran dapat ditentukan dengan rumus sebagai berikut< >1.M1 >2.M2' dimana >1 >olume sampel sebelum pengen/eran M1 ,adar sampel sebelum pengen/eran >2 >olume sampel setelah pengen/eran M2 ,adar sampel setelah pengen/eran >1.M1
>2.M2
0'1 mL C M 1 1'0 mL C*6'+9 GgmL 1'0 mL x *6'+9 GgmL 0'1 mL
M1 *6+'9 GgmL '*6+ mgmL ,onsentrasi tersebut adalah hasil pengen/eran 10 kali' sehingga kadar protein pada sampel putih telur awal adalah<
'*6+ GgmL
M
=
M
= *6'+mgmL
×100 mL
1 mL
ehingga kadar protein dalam sampel albumin telur tersebut adalah *6'+ mgmL.
-I.
SIMPULAN
;erdasarkan data hasil pengamatan dan pembahasan di atas' maka dapat disimpulkan sebagai berikut. G 1. ,urva hubungan antara absorbansi (A! dengan konsentrasi (
gmL! adalah
mendekati linear dengan 5 2 0'+29*' dengan persamaan garis dari kurva adalah y -0'000C : 0.8196. 2. ,adar protein dalam sampel albumin telur adalah sebesar *6'+ mgmL.
-II.
DA,TAR PUSTAKA
Muderawan' @ )ayan. 200*. Analisis @nstrumen. ingara3a<=%@,$A P5J
5edana' @ )ayan. 2006. Buku Ajar Biokimiajilid I. Singaraja< @,@P %egeriingara3a. 5edana' @ )ayanKiti Maryam. 200. PenuntunPraktikumBiokimia. ingara3a< @,@P %egeriingara3a. &ika'
@
%yoman.
2010.
=niversitasPendidikan Danesha
PenuntunPraktikumBiokimia.
ingara3a<
LAMP@5A% 1. DAM;A5
Dambar 1. 5eagen ;
Dambar 2. 5eagen ;iuret
Dambar . Larutan tandar ;A
Dambar 8. pektrootometer
Dambar 6. Proses @nkubasi
Dambar 9. Larutan Albumin &elur
