PENENTUAN KADAR KLOROFIL DENGAN SPEKTROFOTOMETER
LAPORAN PRAKTIKUM FISIOLOGI TUMBUHAN UNTUK MEMENUHI TUGAS MATA KULIAH FISIOLOGI TUMBUHAN Yang dibimbing oleh Drs.Sarwono M.Pd Oleh : Offering C/ Kelompok 4 1. 2. 3. 4. 5. 6.
Hanifa Fitria R. Herliza Basyarotun A. Kiki Elita Silviana Mayang Puspa Rena Sasti Alvionita Shinta Kumalasari
(130341614781) (130341614782) (130341614850) (130341614833) (130341614828) (130341614836)
The Learning University
UNIVERSITAS NEGERI MALANG FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM JURUSAN BIOLOGI NOVEMBER 2014 Topik
: Kadar klorofil
Tanggal
: 12 November 2014
Tujuan
:
Diharapkan terampil dalam : 1. Mengukur kadar klorofil dari daun suatu tanaman yang umurnya berbeda-beda
Data Daun
Nilai absorbansi 665nm
649nm
Daun muda
A = 0,152 T = 70,4
A = 0,181 T = 73,7
Daun setengah tua
A = 0,166 T = 68,4
A = 0,147 T = 71,4
Daun tua
A = 0,480 T = 33,2
A = 0,496 T = 32,0
Kadar klorofil daun muda o Klorofil total = 20 (OD649) + 6,1 (OD665) = 20 (0,152) + 6,1 (0,131) = 3,04 + 0,7991 = 3,8391mg/L o Klorofil a =13,7 (OD 665) – 5,76 (OD649) = 13,7 (0,131) – 5,76 (0,152) = 1,7947 – 0,87552 = 0,91918mg/L o Klorofil b =25,8 (OD649) – 7,7 (OD665) = 25,8 (0,152) – 7,7 (0,131) = 3,9216 – 1,0087 = 2,9129mg/L Kadar klorofil daun setengah tua o Klorofil total=20 (OD649) + 6,1 (OD665) =20 (0,147) + 6,1 (0,166) =2,94 + 1,0126 =3,9526mg/L o
Klorofil a
=13,7 (OD665) – 5,76 (OD649) =13,7 (0,166) – 5,76 (0,147) =2,2742 – 0,84672 =1,42748mg/L
=25,8 (OD649) – 7,7 (OD665) =25,8 (0,147) – 7,7 (0,166) =3,7962 – 1,2782 =2,5144mg/L Kadar klorofil daun tua : o Klorofil total = 20 (OD 649) + 6,1 (OD 665) = 20 (0,496) + 6,1 (0,480) = 12,848mg/L o Klorofil a = 13,7 (OD 665) – 5,76 (OD649) =13,7 (0,480) – 5,76 (OD 649) =6,576 – 2,85696 =3,71904 mg/L o Klorofil b = 25,8 (OD 649) – 7,7 (OD 665) = 25,8 (0,496) – 7,7 (0,480) =12,7968 – 3,696 =9,1008mg/L o
Klorofil b
Pembahasan
Warna daun berasal dari klorofil, pigmen warna hijau yang terdapat di dalam
kloroplas.
menggerakkan
Energi
sintesis
cahaya
molekul
yang
diserap
makanan
dalam
klorofil
inilah
kloroplas.
yang
Kloroplas
ditemukan terutama dalam sel mesofil, yaitu jaringan yang terdapat di bagian dalam daun. Karbon dioksida masuk ke dalam daun, dan oksigen keluar, melalui pori mikroskopik yang di sebut stomata (Campbell., et al, 2002). Fotosintesis adalah suatu proses yang hanya terjadi pada tumbuhan yang berklorofil dan bakteri fotosintetik, dimana energi matahari ( dalam bentuk foton ) ditangkap dan diubah menjadi energi kimia ( ATP dan NADPH ). Energi kimia ini akan digunakan untuk fotosintesa karbohidrat dari air dan karbon dioksida. Jadi, seluruh molekul organik lainnya dari tanaman disintesa dari energi dan adanya organisme hidup lainnya tergantung pada kemampuan tumbuhan atau bakteri fotosintetik untuk berfotosintesis ( Devlin, 1975 ) . Klorofil adalah senyawa ester dan larut di dalam solvent organik. Ekstraksinya dilakukan dengan menggunakan pelarut organik polar, khususnya acetone dan alkohol. Kandungan klorofil bersifat tidak stabil dan lebih mudah rusak bila terkena sinar, panas, asam dan basa ( Abdul, 2008 ).
Klorofil adalah pigmen hijau fotosintetis yang terdapat dalam tanaman, Alga dan Cynobacteria. Fungsi krolofil pada tanaman adalah menyerap energi dari sinar matahari untuk digunakan dalam proses fotosintetis yaitu suatu proses biokimia dimana tanaman mensintesis karbohidrat ( gula menjadi pati ), dari gas karbon dioksida dan air dengan bantuan sinar matahari. Klorofil pada tumbuhan ada dua macam yaitu klorofil a dan klorofil b ( Santoso, 2004). Faktor-faktor yang mempengaruhi pembentukan klorofil adalah faktor pewarnaan, faktor cahaya, faktor oksigen, faktor air, faktor karbohidrat, dan faktor temperatur (Dwidjosoeputro, 1985). Klorofil pada tumbuhan ada dua macam, yaitu klorofil a dan klorofil b. Perbedaan kecil antara struktur kedua klorofil pada sel keduanya terikat pada protein. Sedangkan perbedaan utama antar klorofil dan heme ialah karena adanya atom magnesium (sebagai pengganti besi) di tengah cincin profirin, serta samping hidrokarbon yang panjang, yaitu rantai fitol (Santoso, 2004). Salah satu cara untuk dapat menentukan kadar klorofil adalah dengan metoda spektofotometri (Dwijoseputro, 1985). Spektrofotometri sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri dari spektrofotometer dan fotometer
akan
menghasilkan
sinar
dari
spektrum
dengan
panjang
gelombang energi secara relatif. Jika energi tersebut ditransmisikan maka akan ditangkap oleh klorofil yang terlarut tersebut. Pada fotometer filter sinar dari panjang gelombang yang diinginkan akan diperoleh dengan berbagai
filter
yang
punya
spesifikasi
melewati
banyaknya
panjang
gelombang tertentu (Noggle, 1979). Sebagian dari cahaya tersebut akan diserap dan sisanya akan dilewatkan. Nilai absorbansi dari cahaya yang dilewatkan akan sebanding dengan konsentrasi larutan di dalam kuvet (Cairns 2009). 1. Daun muda Pada perlakuan pertama daun yang digunakan dalam praktikum penentuan kadar klorofil dengan spektofotometer adalah dengan
daun
muda diambil dari bagian pucuk. Daun mudayang diambil kemudian
ditimbang sampai 1 gram setelah itu daun dipotong kecil-kecil, diekstrak dengan menggunakan alkohol 96% dengan cara digerus didalam mortar sampai seluruh klorofil larut. Selanjutnya menyaring ekstrak klorofil, kemudian dimasukkan dalam labu takar 100 ml, jika ekstrak belum mencapai volume 100 ml ditambahkan alkohol 96% hingga 100 ml. pada praktikum ini menggunakan alkohol karena alkohol mampu melarutkan klorofil, Menurut Rozak M. (2008) Klorofil adalah senyawa ester dan larut di dalam solvent organik. Ekstraksinya dilakukan dengan menggunakan pelarut organik polar, khususnya acetone dan alkohol. Kandungan klorofil bersifat tidak stabil dan lebih mudah rusak bila terkena sinar, panas, asam dan basa. Dan Menurut Tjitrosomo (1990) Klorofil mudah larut dalam pelarut-pelarut seperti aseton dan alkohol. Dalam larutan, klorofil menunjukkan sifat fluoresensi berwarna merah yang artinya warna larutan itu hijau pada cahaya yang diteruskan tetapi merah tua pada cahaya yang dipantulkan. Setelah itu blanko diatur absorbansinya 0 (T 100%), Menurut Day dan Underwood (1998) Larutan pembanding dalam spektrofotometri pada umumnya adalah pelarut murni atau suatu larutan blanko yang mengandung sedikit zat yang akan ditetapkan atau tidak sama sekali. Larutan blanko digunakan sebagai kontrol dalam suatu percobaan sebagai nilai 100% transmittans. Menurut Beran (1996) Pengukuran parameter-parameter ini sangat penting, karena data yang diperoleh nantinya tidak hanya sebagai ukuran angka-angka biasa namun juga baik kualitatif maupun kuantitatif dengan dapat menunjukkan nilai besaran yang sebenarnya. Setting nilai absorbansi = 0. Setting nilai transmitansi = 100%. Selanjutnya menukur nilai absorbansi larutan ekstrak klorofil daun setengah tua dengan panjang gelombang 665 nm dan 649 nm. Setelah itu mencatat nilai absorbansinya dan menghitung kadar klorofil dengan rumus dari wintermans dan de mots. Menurut Suyitno (2008) Metode Wintermans and De Mots (1965), menggunakan palarut ethanol (ethyl alchohol) 96 % dan
mengukur absorbansi (A) larutan klorofil pada panjang gelombang (λ) = 649 dan 665 nm. Nilai absorbansi yang diperoleh pada panjang gelombang 665 adalah 0,152 dan transmitannya adalah 70,4 sedangkan nilai absorbansi pada panjang gelombang 649 adalah 0,181 dan transmitannya adalah 73,7
Berikut perhitungan kadar klorofil : Klorofil total = 20 (OD649) + 6,1 (OD665)
Klorofil b
Klorofil a
=13,7 (OD 665) – 5,76 (OD649)
= 20 (0,152) + 6,1 (0,131)
= 13,7 (0,131) – 5,76 (0,152)
= 3,04 + 0,7991
=1,7947 – 0,87552
= 3,8391mg/L
= 0,91918mg/L
= 25,8 (OD649) – 7,7 (OD665) =25,8 (0,152) – 7,7 (0,131) = 3,9216 – 1,0087 = 2,9129mg/L
Dari percobaan dan penghitungan tersebut diketahui bahwa pada daun muda tersebut memiliki klorofil a dan klorofil b. Namun pada daun tersebut klorofil b lebih banyak dari pada klorofil a. Hal ini kurang sesuai dengan pernyataan Subandi (2008) bahwa Semua tanaman hijau mengandung klorofil a dan krolofil b. Krolofil a terdapat sekitar 75 % dari total klorofil. Sedangkan dari jumlah klorofil total daun muda ini memiliki kadar klorofil yang paling rendah dari pada daun setengah tua dan daun tua. Hal ini sesuai dengan teori menurut Sutrisno ( 2013 ), klorofil total lebih banyak pada daun tua karena kadar klorofil berdasarkan tiap-tiap umur daun yakni daun muda dan daun tua disebabkan oleh
beberapa faktor diantaranya faktor internal dan faktor eksternal. Kandungan klorofil pada suatu daun akan meningkat sejalan dengan bertambahnya umur daun. Peningkatan ini terjadi sejalan dengan pertumbuhan dari daun muda menjadi daun tua, tanaman masih melakukan biosintesis klorofil. Berdasarkan struktur dan kandungan dari daun tua lebih banyak membutuhkan nutrisi untuk keperluan hidup yakni sebagai sumber energi, maka dapat dikatakan bahwasanya daun tua masih melakukan biosintesis klorofil. Sedangkan pada daun yang masih muda, kandungan klorofilnya masih sedikit, karena daun ini 2. Daun setengah tua Daun yang digunakan dalam praktikum penentuan kadar klorofil dengan spektofotometer adalah dengan
daun setengah tua diambil dari
daun nomer 3 dari pucuk. Daun setengah tua yang diambil kemudian ditimbang sampai 1 gram setelah itu daun dipotong kecil-kecil, diekstrak dengan menggunakan alkohol 96% dengan cara digerus didalam mortar sampai seluruh klorofil larut. Menyaring ekstrak klorofil, kemudian dimasukkan dalam labu takar 100 ml, jika ekstrak belum mencapai volume 100 ml ditambahkan alkohol 96% hingga 100 ml. pada praktikum ini menggunakan alkohol karena alkohol mampu melarutkan klorofil, Menurut Rozak M. (2008) Klorofil adalah senyawa ester dan larut di dalam solvent organik. Ekstraksinya dilakukan dengan menggunakan pelarut organik polar, khususnya acetone dan alkohol. Kandungan klorofil bersifat tidak stabil dan lebih mudah rusak bila terkena sinar, panas, asam dan basa. Dan Menurut Tjitrosomo (1990) Klorofil mudah larut dalam pelarut-pelarut seperti aseton dan alkohol. Dalam larutan, klorofil menunjukkan sifat fluoresensi berwarna merah yang artinya warna larutan itu hijau pada cahaya yang diteruskan tetapi merah tua pada cahaya yang dipantulkan. Setelah itu blanko diatur absorbansinya 0 (T 100%), Menurut Day dan Underwood (1998) Larutan pembanding dalam spektrofotometri pada umumnya adalah pelarut murni atau suatu larutan blanko yang mengandung sedikit zat yang akan ditetapkan atau tidak sama sekali. Larutan blanko
digunakan sebagai kontrol dalam suatu percobaan sebagai nilai 100% transmittans. Menurut Beran (1996) Pengukuran parameter-parameter ini sangat penting, karena data yang diperoleh nantinya tidak hanya sebagai ukuran angka-angka biasa namun juga baik kualitatif maupun kuantitatif dengan dapat menunjukkan nilai besaran yang sebenarnya. Setting nilai absorbansi = 0. Setting nilai transmitansi = 100%. Selanjutnya menukur nilai absorbansi larutan ekstrak klorofil daun setengah tua dengan panjang gelombang 665 nm dan 649 nm. Setelah itu mencatat nilai absorbansinya dan menghitung kadar klorofil dengan rumus dari wintermans dan de mots. Menurut Suyitno (2008) Metode Wintermans and De Mots (1965), menggunakan palarut ethanol (ethyl alchohol) 96 % dan mengukur absorbansi (A) larutan klorofil pada panjang gelombang (λ) = 649 dan 665 nm. Nilai absorbansi yang diperoleh pada panjang gelombang 665 adalah 0,166 dan transmitannya adalah 68,4 sedangkan nilai absorbansi pada panjang gelombang 649 adalah 0,147 dan transmitannya adalah 71,4
Berikut perhitungan kadar klorofil : Klorofil Total = 20 (OD649) + 6,1
Klorofil b = 25,8 (OD649) - 7,7
(OD665)
(OD665) = 20 (0,147) + 6,1
(0,166) = 2,94 + 1,0126 = 3,9526 Klorofil a
= 13,7 (OD665) - 5,76
OD649) = 13,7 (0,166) – 5,76 (0,147) = 2,2742 - 0,84672 = 3,12092
= 25,8 (0,147) – 7,7 (0,166) = 3,7926 - 1,2782 = 5,0708
Kemampuan bersaing tumbuhan untuk cahaya tergantung luas daun yang berada pada saat tumbuh dan struktur tubuh tumbuhan tersebut. Makin tinggi intensitas cahaya mencapai tumbuhan dimana daunnya makin jauh cahaya maka laju fotosintesis menjadi maksimum (Dwidjoseputro, 1985). Umur daun dan tahapan fisiologis suatu tanaman merupakan faktor yang menentukan kandungan klorofil. Tiap spesies dengan umur yang sama memiliki kandungan kimia yang berlainan dengan jumlah genom yang berlainan pula. Hal ini mengakibatkan metabolisme yang terjadi juga berlainan terkait dengan jumlah substrat maupun enzim metabolismenya (Setiari, 2009). 3. Daun tua Pada praktikum ini adalah uji penentuan kadar klorofil dimana kita dapat menghitung dari kadar klorofil total, klorofil a dan klorofil b pada daun yang memiliki umur yang berbeda dengan menggunakan alat sprektrofotometer yang panjang gelombangnya 649 dan 665 nm. Pada perlakuan ini digunakan daun yang tua yaitu dau yang diambil dari nomor 5 dari bawah. Daun tua yang diambil kemudian ditimbang sampai 1 gram setelah itu daun dipotong kecil-kecil, dan digerus dengan mortar sampai daun lembut, kemudian menyaring ekstrak klorofil, dan selanjutnya dimasukkan dalam labu takar 100 ml, jika ekstrak belum mencapai volume 100 ml ditambahkan alkohol 96% hingga 100 ml. Kemudian ekstrak klorofil tersebut dihitung dengan spektrofotometer dengan blanko yang nilai absorbandnya 0 ( T 100% ) dengan panjang gelombang 649 dan 665 nm. Dari hasil praktikum, kadar klorofil pada daun tua diperoleh hasil, klorofil total 12,848 mg/L , klorofil a 3,71904 mg/L , dan klorofil b 9,1008 mg/L . Pada setiap sampel daun tua, klorofil b memiliki kadar yang lebih tinggi yaitu 9,1008 mg/L, dibandingkan kadar klorofil a yaitu 3,71904 mg/L. Hal ini tidak sesuai dengan pendapat Suyitno ( 2006 ), bahwa pada semua tanaman hijau, sebagian besar klorofil berada dalam dua bentuk, yaitu klorofil a dan klorofil b dengan perbandingan 3:1. Klorofil a bersifat kurang polar dan berwarna biru-hijau, sedangkan klorofil-b lebih polar dan berwarna kuning-hijau. Pada praktikum jika dibandingkan dengan daun muda dan daun setengah tua, daun tua kadar klorofilnya paling tinggi. Pada hasil pengamatan yang dilakukan, hasil menunjukkan
bahwa daun muda dengan klorofil total yaitu 3,8391 mg/L, daun setengah tua dengan klorofil total yaitu 3,9526 mg/L, dan daun tua dengan klorofil total yaitu 12,848 mg/L . berdasarkan hal tersebut, jumlah klorofil total lebih besar pada daun tua. Hal ini sesuai dengan teori menurut Sutrisno ( 2013 ), klorofil total lebih banyak pada daun tua karena kadar klorofil berdasarkan tiap-tiap umur daun yakni daun muda dan daun tua disebabkan oleh beberapa faktor diantaranya faktor internal dan faktor eksternal. Kandungan klorofil pada suatu daun akan meningkat sejalan dengan bertambahnya umur daun. Peningkatan ini terjadi sejalan dengan pertumbuhan dari daun muda menjadi daun tua, tanaman masih melakukan biosintesis klorofil. Berdasarkan struktur dan kandungan dari daun tua lebih banyak membutuhkan nutrisi untuk keperluan hidup yakni sebagai sumber energi, maka dapat dikatakan bahwasanya daun tua masih melakukan biosintesis klorofil. Sedangkan pada daun yang masih muda, kandungan klorofilnya masih sedikit, karena daun ini masih belum banyak melakukan biosintesis klorofil. Dalam hal ini selain faktor internal, perbedaan kandungan klorofil juga dapat di pengaruhi faktor eksternal diantaranya intensitas cahaya, naungan, morfologi dan luas permukaan daun. Besar intensitas cahaya yang diterima atau diabsorpsi daun bergantung dari jumlah klorofil yang dimiliki oleh daun tersebut. Namun ada pendapat lain menurut Lakitan ( 2007 ) bahwa umur daun sangat mempengaruhi proses fotosintesis, dimana proses penuaan akan berdampak pada kelambanan proses fotosintesis. Sehingga daun yang telah tua memiliki kadar klorofil yang lebih rendah. Namun dalam beberapa kondisi seringkali nutrisi yang jumlahnya terbatas lebih sering didistribusikan ke daun yang lebih tua daripada ke daun yang lebih muda, sehingga kadar klorofil lebih tinggi daun setengah tua lebih tinggi dibandingkan pada daun muda. Dari praktikum ini hasil menunjukkan bahwa daun muda memiliki kadar klorofil yang paling rendah, kemudian daun setengah tua dan daun tua. Hal ini menunjukkan bahwa semakin tua umur suatu tanaman maka semakin tinggi kadar klorofilnya, hal ini merujuk pada pernyataan Setiari (2009) yang menyatakan bahwa berdasarkan faktor umur tanaman, maka dapat dikatakan bahwa makin tua umur tanaman akan menghasilkan kandungan klorofil yang semakin tinggi.
Kesimpulan
Dari pembahasan praktikum pengukuran kadar klorofil dari daun yang umurnya berbeda-beda diatas dapat diambil kesmpulan yaitu:
Daun muda memiliki kadar klorofil yang paling rendah, kemudian daun setengah tua dan daun tua. Hal ini menunjukkan bahwa semakin tua umur suatu tanaman maka semakin tinggi kadar klorofilnya.
Yang menyebabkan perbedaan kadar klorofil tersebut adalah karena pengaruh faktor umur tanaman, faktor pewarnaan, faktor cahaya, faktor oksigen, faktor air,
faktor karbohidrat, dan faktor temperatur.
Daftar Rujukan Abdul. 2008. Ekstraksi Klorofil dari Daun Pepaya dengan Solvent 1-Butanol. Semarang: Universitas Dipenogoro. Beran, J.A. 1996. Chemistry in The Laboratory. Hoboken : John Willey & Sons Cairns D. 2009. Intisari Kimia Farmasi Edisi Kedua. Penerjemah : Puspita Rini. Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC.
Campbell, Neil A., Jane B. Reece., Lawrence G. Mitchell. 2002. Biologi
Edisi
ke 5 Jilid 1. Jakarta : Erlangga Day, R dan Underwood A. 2002. Analisis Kimia Kuantitatif Edisi Keenam. Penerjemah : Sopyan Iis. Jakarta : Erlangga. Devlin. 1975. Plant Physiology Third Edition. New York: D. Van Nostrand. Dwijoseputro, D. 1985. Fisiologi Tumbuhan. Jakarta : Gramedia. Lakitan. 2007. Dasar-Dasar Fisiologi Tumbuhan. Jakarta: PT. Raja Grafindo Persada. Noggle, Ray, R dan Fritzs, J. George. 1979. Introductor Plant Physiology. New Delhi : Mall of India Private Ilmited. Santoso. 2004. Fisiologi Tumbuhan. Bengkulu : Universitas Muhammadiyah Bengkulu. Setiari, Nintya dan Yulita Nurchayati. 2009. Eksplorasi Kandungan Klorofil pada beberapa Sayuran Hijau sebagai Alternatif Bahan Dasar Food Supplement.
(Online)
http://eprints.undip.ac.id/1989/1/Bioma_Nintya_Juni_2009.pdf
Diakses
Pada 13 November 2014 Subandi, Aan. 2008. Metabolisme. http://metabolisme.blogspot.com/2007/09. (Diakses pada 17 Mei 2012).Sutrisno, Risfi Pratiwi. 2013. Penentuan Kadar
Klorofil
Secara
Spektroskopi.
Pontianak
:
Universitas
Tanjungpura Sutrisno, Risfi Pratiwi. 2013. Penentuan Kadar Klorofil Secara Spektroskopi. Pontianak : Universitas Tanjungpura Suyitno. 2008. Modul Pengayaan Materi Projek Pendampingan. Yogyakarta : Universitas Negeri Yogyakarta Rozak M, Abdul dan Hartanto, Unggul. 2008. Ekstraksi Klorofil Dari Daun Pepaya Dengan Solvent 1-Butanol (Online)
http://eprints.undip.ac.id/3737/1/MAKALAH_SEMINAR_Unggul.pdf Diakses Pada 13 November 2014 Tjitrosomo, Siti Sutarmi., et al. 1983. Botani Umum Jilid 2. Bandung : Angkasa
