METODE PARAFIN
Metode parafin adalah suatu cara pembutan sediaan baik itu tumbuhan ataupun hewan dengan menggunakan parafin. Kebaikan-kebaikan metode ini ialah irisan jauh lebih tipis dari pada menggunakan metoda beku atau metoda seloidin. Dengan metoda beku, tebal irisan ratarata diatas 10 mkron, tapi dengan metode parafin tebal irisan dapat mencapai rata-rata 6 mikron. Irisan-irisan yang bersifat seri dapat dikerjakan dengan mudah bila menggunakan metode ini. Kelemahan dari metode ini ialah jaringan menjadi keras, mengerut dan mudah patah. Jaringan jaringan yang besar tidak dapat dikerjakaan, bila menggunakan metode ini. Sebagian besar enzim-enzim yang terdapat pada jaringan akan larut dengan menggunakan metode ini (Rina, 2010). Prosedur pembuatan sediaan menggunakan metode parafin pada umumnya sama baik pada jaringan hewan maupun tumbuhan yaitu yaitu diseksi, diseksi, fiksasi, pencucian dan dehidrasi, dealkoholisasi, infiltrasi, embedding, penyayatan, affixing, pewarnaan, penutupan dan pemberian nama atau pelabelan (Hasan, 2010). 2010). Diseksi merupakan proses pengambilan jaringan atau bagian jaringan dari sumber alami baik berupa tumbuhan ataupun hewan yang akan digunakan sebagai bahan dasar dalam mikroteknik. Fiksasi adalah usaha yang dapat mempertahankan elemen-elemen sel atau jaringan agar tetap berada pada tempatnya dan tidak mengalami perubahan bentuk maupun ukuran. Tujuan dilakukan fiksasi dalam pembuatan preparat dengan menggunakan metode paraffin adalah: 1. mematikan (menghentikan proses-proses metabolisme)jaringan dengan cepat, sedangkan keadaan sedikit banyaknya mendekati keadaan semula. 2. mencegah terjadinya kerusakan jaringan yang disebabkan oleh mikroorganisme ataupun kerusakan oleh jenis enzim yang terkandung oleh jaringan itu sendiri, yang dikenal dengan autoloisis. 3. Meningkatkan daya pewarnaan karena adanya bahan-bahan keras (mordant) yang merupakan komponen jaringna fiksatif. Dehidrasi adalah proses penarikan air dari dalam jaringan dengan menggunakan bahan bahan kimia tertentu. Dehidrasi bertujuan untuk mengeluarkan air dari dalam jaringan yang telah difiksasi. Dealkoholisasi merupakan proses harus segera dilakukan setelah dehidrasi. Tujuan dari
penjernihan ini adalah menggantikan tempat alcohol sementara dalam jaringan yang telah mengalami proses dehidrasi dengan suatu solven atau medium penjernih sebelum proses penanaman dalam paraffin. Infiltrasi adalah suatu usaha menyusupkan media penanaman (embedding media) ke dalam jaringan dengan jalan menggantikan kedudukan dehidran dan bahan penjernih (clearing agents). Media penanaman yang digunakan dalam infiltrasi ini adalah paraffin. Proses infiltrasi ini umumnya dilakukan di dalam oven yang suhunya dapat diatur sesuai titik leleh jenis paraffin yang digunakan. Pada jaringan Embedding atau penanaman merupakan proses memasukan atau penanaman jaringan ke dalam balok-balik paraffin (cetakan) sehingga memudahkan proses penyayatan dengan bantuan mikrotom. Tujuan dari tahap ini adalah untuk membuat balok paraffin yang berisi jaringan yang akan dibuat preparat permanen. Proses penyayatan adalah pembuatan sayatan atau pita dari balok parafin yang telah terbentuk dengan menggunakan mikrotom, yang bertujuan untuk membuat sayatan jaringan dan dapat dilihat jelas dari dalam mikroskop. Pembuatan irisan dengan metode parafin memiliki beberapa keuntungan, Affixing adalah proses pelekatan atau penempatan sayatan jaringan pada kaca objek dengan bantuan media pelekat tertentu. Tujuan penempelan ini adalah untuk menempelkan pita paraffin yang sudah berisi sayatan jaringan pada kaca objek. Deparafinasi adalah suatu tahap menjelang proses pewarnaan dengan menggunakan xilol untuk membersihkan paraffin dari jaringan dan kaca objek I. II.
TUJUAN : Untuk mengetahui bahan, alat dan cara pembuatan sediaan irisan jaringan tumbuhan dengan metode parafin. ALAT & BAHAN 1. ALAT Nama alat a. b. c. d. e.
Wadah untuk proses dehidrasi-clearing Staining jar Label Pinset Kotak parafin
Jumlah secukupnya secukupnya secukupnya secukupnya secukupnya
f. g. h. i. j.
Rotary mikrotome Hot plate Waterbath Objek glass Deg glass
secukupnya secukupnya secukupnya secukupnya secukupnya
2. BAHAN Nama bahan a. b. c. d. e. f. g. h. i. j. k. l.
Akar kaktus Akar Enceng Gondok ( Eichornia crassipes) Batang Seledri ( Apium graveolens) Batang Bayam ( Amaranthus sp) Daun Jeruk purut (Citrus hystrix) Daun Karet kebo ( Ficus elastica) Bunga Belimbing ( Averrhoa carambola) Bunga Cabe (Capsicum annum) Biji Belimbing wuluh ( Averrhoa bilimbi) Biji Cabe besar (Capsicum annum) Buah Pisang ( Musa paradisiaca) Buah Cabe (Capsicum annum)
Jumlah secukupnya secukupnya secukupnya secukupnya secukupnya secukupnya secukupnya secukupnya secukupnya secukupnya secukupnya secukupnya
III. CARA KERJA Hari ke I : A. Pencucian Mencuci organ dengan air, jangan sampai merusak organ. Kemudian memasukkan kedalam flakon. B. Koleksi organ tumbuhan: a. Bunga 1. Mengambil bunga yang masih kuncup 2. Potong bagian ujung untuk mendapatkan benang sari dan putik, dan potong bagian pangkal untuk mendapatkan ovul. b. Daun 1. Memotong daun dengan bentuk persegi empat pada bagian daun yang terdapat tulang daun atau urat daun. c. Akar 1. Memotong akar secara melintang d. Batang 1. Memotong batang secara melintang e. Biji 1. Mengambil bagian biji
C. Fiksasi :
Hari ke II
Hari ke III
Hari ke IV
Hari ke V
Hari ke VI
Dipakai larutan FAA Formalin ................................................... ............................. 5 bagian Asam asetat glasial ................................................................ 5 bagian Alkohol 70%........................................................................ 90 bagian Diamkan selama 24 jam : Pencucian dan dehidrasi: Fiksatif dibuang lalu diganti berturut-turut dengan: Alkohol 70% .................................................. 30 menit Alkohol 80% .................................................. 30 menit Alkohol 95% .................................................. 30 menit Alkohol 100% ................................................ 30 menit Alkohol 100% ................................................ 30 menit Dealkoholisasi: Alkohol / xilol 3:1 ......................................... 30 menit Alkohol / xilol 1:1 ......................................... 30 menit Alkohol / xilol 1:3 ......................................... 30 menit Xilol .............................................................. 30 menit Xilol .............................................................. 30 menit Campuran Xilol / parafin 1:9 dengan temperatur 5 7°C selama 24 jam : Infiltrasi: Campuran xilol/parafin dibuang diganti dengan paraffin murni. Temperatur tetap 57°C selama 24 jam. : Penyelubungan: Parafin dibuang diganti dengan parafin murni yang baru. Setelah ± 1 jam dibuat balok. : Pengirisan: Dibuat irisan-irisan dengan menggunakan Rotary mikrotome dengan ketebalan 6-12µm (mikronmeter). Perekatan: Irisan direkatkan pada gelas benda dengan campuran Gliserin: Albumin yang dibubuhi air, kemudian gelas benda ditaruh diatas Hot plate dengan temperatur 45°C sampai pita paraffin merenggang. : Pewarnaan : dengan safranin 1% dalam alkohol 70%. Berturut-turut gelas benda dimasukkan dalam: Xilol ................................................................ 3 menit Xilol ................................................................ 3 menit Alkohol / xilol 1:3 ........................................... 3 menit Alkohol / xilol 1:1 ........................................... 3 menit Alkohol / xilol 3:1 ........................................... 3 menit Alkohol 100% ................................................. 3 menit Alkohol 100% ................................................. 3 menit Alkohol 95% ................................................... 3 menit
Alkohol 80% ................................................... 3 menit Alkohol 70% ................................................... 3 menit Safranin 1% dalam Alkohol 70% ...................... 1 jam Alkohol 70% ................................................... 1 menit Alkohol 80% ................................................... 1 menit Alkohol 95% ................................................... 1 menit Alkohol 100% ................................................. 1 menit Alkohol 100% ................................................. 1 menit Alkohol / xilol 3:1 ........................................... 1 menit Alkohol / xilol 1:1 ........................................... 1 menit Alkohol / xilol 1:3 ........................................... 1 menit Xilol ................................................................ 1 menit Xilol ................................................................ 1 menit Penutup: Irisan ditutup dengan gelas penutup dengan pemberian Balsam Kanada terlebih dahulu. Pemberian nama : Disebelah kiri gelas penutup dilekatkan etiket dan diberi keterangan: nama spesies, organ, penampang, dsb.
